一种便携式胆固醇分子印迹丝网印刷电化学检测仪

摘要

本发明公开了一种便携式胆固醇分子印迹丝网印刷电化学检测仪，属于快速检测技术领域。发明通过在电镀聚合模板分子胆固醇的丝网印刷电极，滴加提纯后的样品与电导液的混合溶液于丝网印刷电极的工作电极表面，通过便携式胆固醇分子印迹电化学检测仪直接可以读出胆固醇的电流，根据标准浓度的胆固醇的丝网印刷电极片，校正标准曲线，通过内置程序计算得到被检测样品中胆固醇的浓度。发明的检测仪构造简单、便携、灵敏、快速、准确、特异性高且经济。发明的检测仪能够实现对胆固醇的直接检测，具有便携、灵敏、快速、特异性高等优点，并且价格低廉，适用于基层或现场检测胆固醇。

说明书

技术领域

本发明涉及一种便携式胆固醇分子印迹丝网印刷电化学检测仪，属于快速检测技术领域。

背景技术

胆固醇是动物组织中的一种白色蜡状物质，是环戊烷多氢菲的衍生物。胆固醇是构成细胞膜的重要组成成分，是人体必不可少的物质，但过量的胆固醇会引起心脑血。近年来由于高胆固醇引发的疾病有以下几种常见类型：高血压、肾脏疾病、前列腺癌、破坏人体骨骼、牙周病、耳鸣或耳闷，高胆固醇还能够造成缺血性心脏病(心绞痛、心肌梗死)、脑梗死、间歇性跛行症及胆结石。

胆固醇的检测方法多种多样，原理各不相同，每种方法均由自己的优点和缺点，但因现代化食品工业对检测方法灵敏度及准确度要求的提高，有很多方法已不适合检测的需要。因此建立一种灵敏、快速、简便、特异性高且经济的检测方法是生产经营企业、质控人员、进出口检商、政府管理部门的迫切需要和食品、环境安全的有力保障。

目前，已报道的血胆固醇检测方法较多，常见的有气液色谱—质谱联用法、温度测定法、分子发光法、比色法、电化学方法等。然而这些检测方法大多耗时耗力，而且需要很大的检测费用。目前的胆固醇检测产品中，基本都采用了酶法为基础的原理，通过比色或者检测仪获得测定的结果。然而这种检测仪需要稳定性高的溶胶凝胶类作为固酶基质，电极上的酶容易失活，而产生假阴性的结果，此外，由于该种检测方法对胆固醇的特异性识别能力较差，在实际样品检测时，存在假阳性的结果。

本发明的特征在于采用分子印迹电镀在丝网印刷电极上，分子印迹又称“人造抗体”，对环境的要求不高，不需要特别的保存方式，此外对胆固醇分子具有较好的识别能力，达到特异性检测的要求。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提供了一种用于快速检测胆固醇的分子印迹丝网印刷电化学检测仪。

本发明的第一个目的是提供一种便携式分子印迹电化学检测仪，包括外插型一次性分子印迹丝网印刷电极和便携式检测器，其运行方式是将含有待测样品的电导液滴加到分子印迹 丝网印刷电极表面，然后将一次性分子印迹丝网印刷电极水平插入便携式电化学检测仪卡槽内，检测读数。

所述便携式检测器为简易式电化学工作站，配备LED显示屏，检测器在设置一定的电压下，由对电极发出电子流经电导液，再从工作电极流回工作站时形成的电流值会被记录，根据产生的电流大小与标准样品中目标物质的浓度关系折算，最终将待测样品中目标物质浓度显示于LED显示屏上。

所述产生的电流大小与标准样品中目标物质的浓度关系是已内置于检测器程序中的标准曲线，或者是检测器程序根据测得的不同电流值大小与操作者在操作界面输入的相应待测物质浓度而自动计算得到的标准曲线。

所述便携式检测器，在本发明的一种实施方式中，已内置有根据目标物质的标准品的浓度与电流值关系得到的标准曲线，检测样品时，可以直接根据测得的电流，结合标准曲线，最终直接显示样品中目标物质的浓度。

所述便携式检测器，在本发明的一种实施方式中，可以制备不同浓度标准品的分子印迹丝网印刷电极插入到检测器中并分别将浓度输入到检测器中，检测器系统可以根据测得的电流值大小和收到的浓度信息，计算得到电流值大小与物质浓度的标准曲线。检测待测样品时，系统内部可以测得的电流与计算得到的标准曲线，最终直接显示待测样品中目标物质的浓度。

所述含有待测样品的电导液，在本发明的一种实施方式中，是用PBS配置的待测样品溶液，或者是待测样品水溶液与导电溶液(2.5mmol·L^-1[Fe(CN)₆]^3/4和0.1mol·L^-1KCl溶液)的混合液。

所述待测样品溶液，在本发明的一种实施方式中，是以浓度为0.1～1mmol·L^-1，pH范围为6.2～8.1的PBS溶液作为溶剂。

所述混合液，在本发明的一种实施方式中，是待测样品溶液与导电溶液(2.5mmol·L^-1[Fe(CN)₆]^3/4和0.1mol·L^-1KCl溶液)按照体积比9:1～1:9混合。

所述含有待测样品的电导液，滴加到分子印迹丝网印刷电极表面的体积是：5μL～20μL。

所述含有待测样品的电导液滴加到分子印迹丝网印刷电极表面的体积，在本发明的一种实施方式中，是10μL。

所述滴加到分子印迹丝网印刷电极表面后，在本发明的一种实施方式中，静置吸附时间为50s～600s再进行结果读取。

所述静置吸附，在本发明的一种实施方式中，时间为120s。

所述便携式检测器的电压设置范围为-0.2V～0.6V。

所述电压设置范围，在本发明的一种实施方式中，为0.1V～0.3V。

所述标准品的分子印迹丝网印刷电极，可以是以下任意一种：

(1)由已知浓度的标准分子浓度的待测物滴加到电镀了分子印迹膜的丝网印刷电极上测定，计算得到浓度与电流信号剂量关系，计算标准品曲线，该方式在使用过程中无需使用与该电化学检测器配套的丝网印刷电极，该种标准丝网印刷电极不能重复使用，稳定时间短；

(2)产生的电流信号与该电化学检测器配套的滴加已知浓度被检测物的丝网印刷电极，可由可控电阻的模块丝印印刷电极代替，即根据检测范围得到一组已知电阻的模块丝网印刷电极用于校正标准曲线。模块丝印印刷电极通过物理方法调控阻抗，可以重复使用，且稳定耐用，需使用与该电化学检测器配套的丝网印刷电极，即为调试模块丝印印刷电极所使用的丝网印刷电极。

所述分子印迹丝网印刷电极，在本发明的一种实施方式中，包括电极基片、接线端子、电极连线、工作电极、对电极、绝缘层；所述工作电极表面电镀了分子印迹聚合物膜；

所述分子印迹丝网印刷电极，在本发明的一种实施方式中，电极基片为一次性消费基片，工作电极，对电极与参比电极由电极连线导出，形成凸型三线式插口，可插入便携式电化学检测器，检测读数。

所述分子印迹丝网印刷电极，在本发明的一种实施方式中，其分子印迹聚合物为胆固醇分子印迹聚合物。

所述分子印迹丝网印刷电极，在本发明的一种实施方式中，其电极基片印制了接线端子、电极连线与工作电极连成一体的一条电极基体和接线端子、电极连线与对电极连成一体的另一条电极基体，两条电极连线相互平行，电极连线在电极基体的中间部分，其表面涂覆一层PVC绝缘体。

所述分子印迹丝网印刷电极，在本发明的一种实施方式中，工作电极的形状为圆形块状，对电极的形状为与工作电极同心相离的半圆环形块状，工作电极表面电镀聚合胆固醇分子印迹膜。

所述分子印迹丝网印刷电极的制备方法，在本发明的一种实施方式中，是：在普通丝网印刷电极的工作电极表面电镀沉积金纳米粒子，再通过金巯键修饰对巯基苯胺，其浸置10mmol·L^-1胆固醇溶液中，室温孵育2h，再置于电聚合液中，电镀聚合，模板分子洗脱，使工作电极表面电镀了分子印迹聚合物膜，即得到分子印迹丝网印刷电极。

所述制备方法，在本发明的一种实施方式中，是先通过电镀或修饰其他用于扩大电极比表面积或增强电子传递的碳纳米材料，再在电极表面电镀沉积金纳米粒子。

所述电镀或修饰碳纳米材料，在本发明的一种实施方式中，采用修饰多壁碳纳米管。

所述制备方法中的电镀沉积金纳米粒子，在本发明的一种实施方式中是：将工作电极置于2.43mmol·L^-1氯金酸和0.1mol·L^-1硫酸溶液中，在电位-0.2V电压下，电镀时间为200s，以完成电镀。

所述制备方法中的电聚合液，在本发明的一种实施方式中，含有10mmol·L^-1对巯基苯胺，50mol·L^-1四丁基高氯酸铵，10mol·L^-1胆固醇和0.4g/L高氯酸。

所述制备方法中的电镀聚合，在本发明的一种实施方式中，具体条件是：电聚合电压为-0.3V-1.2V，扫描速率为50mv/s，最佳扫描圈数为6圈。

所述制备方法中的模板分子洗脱，在本发明的一种实施方式中，是将电极在含有乙醇水溶液(4：1，v/v)中浸泡10min，然后将工作电极用超纯水淋洗。

本发明的第二个目的是提供一种所述检测仪的应用，是：先插入标准品分子印迹丝网印刷电极，根据标准曲线校正便携式检测器的检测结果，然后再插入滴加有待测样品的分子印迹丝网印刷电极测试。

所述的应用，在本发明的一种实施方式中，是插入两个以上的标准品子印迹丝网印刷电极对检测器进行校正。

所述标准曲线的制备方法，在本发明的一种实施方式中，是：配置含有不同已知浓度的被测物质的电导液，滴加到该被测物质的分子印迹丝网印刷电极中(该标准浓度的被检测物用于标准曲线的设置)，由便携式检测器检测，记录数据计算被测物质溶液溶液中物质浓度与峰电流之间的标准曲线。根据标准曲线进行校正，用于实际样品检测分析时，系统内部的技术参照。

所述应用，在本发明的一种实施方式中，是用于检测胆固醇。所述分子印迹丝网印刷电极为胆固醇分子印迹丝网印刷电极，所述标准曲线为I_p＝-5.033LogC+16.885(R²＝0.995)，检测限为3.4×10^-14mol·L^-1。

本发明有如下的有益效果：

(1)便携式检测器主要突出快速、小巧、灵敏三大特征。应用范围广泛，只需要更改分子印迹膜，重新设置标准曲线，可以完成大多数能够制备分子印迹的化学物质的检测。

(2)可以用于多种物质的检测，只需要替换电镀聚合不同被检测物的分子印迹模板分子，就可以制备得到各种需要检测的分子印迹膜的丝网印刷电极，在有已知浓度标准物分子印迹丝网印刷电极片的设置下，可以使得便携式电化学检测仪得到校正，然后检测所需要检 测的分子印迹模板分子的量。同时每次检验都需要更换分子印迹丝网印刷电极片，避免重复使用带来的不稳定性。

(3)丝网印刷电极表面电镀纳米金，用于增强而后电镀聚合的分子印迹聚合膜的接触比表面积，同时增加电子传递速率，而增大灵敏度。

(4)采用分子印迹聚合膜来作为识别靶点，检测特异性强，同时分子印迹电化学传感器兼具有可以实现现场检测，不受样品颜色、浊度的影响，样品可以不经复杂处理、无需分离的优点。结合能够快速灵敏检测的电化学分析方法，加上丝网印刷电极的低成本、高性能，使得能够快速、便捷的检测样品中的胆固醇。

(5)本发明的检测仪是一种能够真正的解决市场需要，能够满足工商部门，质检机构，科研高校等机构的检测需要的快速检测产品，可用于生产经营企业、质控人员、进出口检商、政府管理部门、医院甚至个人家庭的使用，适用于食品工业、饲料行业、环境保护、医学药筛和生物化学等领域。

附图说明

图1：胆固醇分子印迹丝网印刷电极片的制备示意图；

图2：便携式胆固醇分子印迹电化学检测仪结构图；

图3：便携式胆固醇分子印迹电化学检测仪标准曲线检测。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明，其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。

实施例1胆固醇分子印迹丝网印刷电极的制备

胆固醇分子印迹丝网印刷电极片的制备示意图如图1所示。具体制备方法如下：

(1)在工作丝网印刷电极表面修饰碳纳米管：将多壁碳纳米管500mg与60mL浓硝酸混合，85度煮沸12h，然后冷却后过0.22μm的聚碳酸酯膜，水洗，氮气吹干后，取5mg制备得到的羧基化多壁碳纳米管与10mL 1.0wt％壳聚糖(乙酸为溶剂)混合，然后吸取10μL滴加到工作电极上，室温干燥。

(2)在工作丝网印刷电极表面电镀沉积金纳米粒子，电镀方法：工作电极置于2.43mmol·L^-1氯金酸和0.1mol·L^-1硫酸溶液中，在电位-0.2V电压下，电镀时间为200s，以完成电镀；

(3)通过金巯键修饰对巯基苯胺，修饰方法：将电镀沉积金纳米粒子的丝网印刷电极浸置于20mmol·L^-1对巯基苯胺乙醇溶液中，室温浸泡24h，之后用乙醇和水彻底清洗去除未吸附的对巯基苯胺，氮气吹干备用；

(4)再将修饰了对巯基苯胺的丝网印刷电极浸置10mmol·L^-1胆固醇溶液中，室温孵育2h，乙醇和超纯水洗涤后，氮气吹干备用；再将静电吸附后的丝网印刷电极浸入10mL含有10mmol·L^-1对巯基苯胺，50mol·L^-1四丁基高氯酸铵，10mol·L^-1胆固醇和0.4g·L^-1高氯酸，采用循环伏安法扫描，电聚合电压为：-0.3V-1.2V，扫描速率为：50mv/s，扫描圈数为：6；

(5)最后洗脱模板分子，将电聚合胆固醇分子印迹膜的丝网印刷电极浸置于乙醇水溶液(4：1，v/v)中浸泡10min，然后将丝网印刷电极用超纯水淋洗，已完成胆固醇分子印迹膜的丝网印刷电极的制备。

(6)本方法制备的电极与其他胆固醇分子印迹电化学传感技术的结果比较：

表1不同制备方法得到的胆固醇分子印迹电化学传感器的性能

根据与已经报道的其他方法制备的胆固醇分子印迹电化学传感器结果比较(如表1所示)，本发明方法制备的传感器具有较大的检测范围，且具有较低的检出限，此外稳定的期也较长。

实施例2胆固醇分子印迹丝网印刷电极的应用

样品测试步骤如下：

首先用标准(已知浓度的胆固醇)分子印迹丝网印刷电极插入到便携式检测器，校正便携式检测器的检测结果。然后将提纯后的胆固醇样品与电导液等体积混合，电导液的配置：2.5mmol·L^-1[Fe(CN)₆]^3/4和0.1mol·L^-1KCl溶液，滴加胆固醇样品与电导液混合液20μL在制>

所述便携式胆固醇分子印迹电化学检测仪结构图如图2所示，构造如下：

分子印迹丝网印刷电极包括电极基片、接线端子、电极连线、工作电极、对电极、绝缘层；所述工作电极表面电镀了分子印迹聚合物膜；电极基片为一次性消费基片，工作电极，对电极与参比电极由电极连线导出，形成凸型三线式插口，可插入便携式电化学检测器，检测读数。其电极基片印制了接线端子、电极连线与工作电极连成一体的一条电极基体和接线端子、电极连线与对电极连成一体的另一条电极基体，两条电极连线相互平行，电极连线在电极基体的中间部分，其表面涂覆一层PVC绝缘体。工作电极的形状为圆形块状，对电极的形状为与工作电极同心相离的半圆环形块状，工作电极表面电镀聚合胆固醇分子印迹膜。

便携式电化学检测仪为已设定电压的简易式电化学工作站，配备由LED显示屏，用于记录由对电极流出的电子，流经样品或电导液，再从工作电极流回工作站时形成的电流值。该电流会被电化学检测器记录，通过与标准浓度的胆固醇分子印迹丝网印刷电极制备得到的标准曲线计算，以浓度的形式显示在LED显示屏上。

实施例3胆固醇分子印迹丝网印刷电极的应用

在本发明的一种便携式检测器中，为胆固醇专用便携式检测器，胆固醇浓度与峰电流之间的标准曲线已内置于检测器程序。

该标准曲线的绘制方法：制备不同已知浓度(浓度范围：1×10^-13～1×10^-9mol·L^-1)的胆固醇分子印迹丝网印刷电极插入到检测器中，检测电子从对电极，经过电导液，再从工作电极流回工作站时形成的电流峰值，以胆固醇浓度为横坐标，峰电流值为纵坐标，即得到标准曲线，如图3所示。得到的标准曲线方程为：I_p＝-5.033LogC+16.885(R²＝0.995)，检测限为3.4×10^-14mol·L^-1。

人体血液中胆固醇的正常范围是2.84～5.17×10^-3mol·L^-1，空腹血糖是3.9～5.6×10^-3mol·L^-1,在血液样本检测的时候，需要用电导液将血液稀释7倍，以达到仪器的检测能力。常见食品中胆固醇的含量范围在0～4000mg/100g(其中鹌鹑蛋最高：3640mg/100g)，在进行食品中胆固醇检测时候方法如下：取10g不含水的食品样本，通过有机溶剂萃取，最终定容至10mL，即浓度范围：2.6×10^-4～1×10^-1mol·L^-1，所以在食品样品检测时候需要再将10mL样本稀释8倍，以达到仪器检测要求。

将得到的标准曲线通过计算机程序内置于检测器，即得到胆固醇专用便携式检测器。

检测待测样品时，先使用2个以上胆固醇标准品分子印迹丝网印刷电极进行校正，然后在检测待测样品溶液。便携式检测器可以根据内部设定的标准曲线，最终直接将待测样品中胆固醇的浓度显示在检测器的LED显示屏上。

实施例4标准曲线

在本发明的一种便携式检测器中，标准曲线并不是内置于检测器程序中。对于不同的被测物质，操作者可以制备不同已知浓度的被测物质的分子印迹丝网印刷电极插入到检测器中并在检测器的操作界面上分别将浓度输入到检测器中，检测器系统可以根据测得的电流值大小和收到的浓度信息，计算得到电流值大小与物质浓度的标准曲线，然后操作者进行待测样品的检测，系统内部可以根据测得的电流与计算得到的标准曲线，最终直接显示待测样品中目标物质的浓度。

实施例5便携式检测仪的性能测试

1、取100mg鸡蛋黄样本(本身的胆固醇含量2000mg/100g)，平行试验4个。用等体积的甲醇，三氯甲烷和水萃取(1:1:1)，14000g离心5min后，取上清液，氮气吹干(或真空干燥)，用乙醇溶液定容止1mL，将1mL溶液电导液稀释8倍，然后直接滴加到丝网印刷电极表面，吸附120s后直接检测。

2、检测结果如表2所示：

表2鸡蛋黄样本的检测

样本 检测得到的浓度(10^-11molL^-1)>折算得到的实际浓度(mg/100g) 回收率 1 5.18 1999.48 99.97％ 2 5.24 2022.64 101.13％ 3 5.22 2014.92 100.75％ 4 5.09 1964.74 98.24％

从表2可以看出，回收率在98.24％-101.13％，说明本发明的检测胆固醇含量的方法，精确度高，稳定性高，可重复性高。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。