与阿尔茨海默氏病和轻度认知障碍相关的原肌球蛋白同种型

摘要

本发明提供了有助于阿尔茨海默氏病(AD)或轻度认知障碍(MCI)诊断的体外方法，包括测定患者样品中对应于P09493-3和/或P09493-1的一种或多种原肌球蛋白同种型的表达水平。还提供了包含结合原肌球蛋白同种型P09493-3和P09493-1的探针的试剂盒。

说明书

发明背景

由于寿命的不断增加，基于痴呆的疾病逐渐成为了全球与健康相关 的医疗预算的主要负担，并且被认为是受影响护理者/家庭的压力源。阿 尔茨海默氏病(AD)表现出最普遍的神经退行性病理，并且一直在寻找用 于患者治疗和筛选的治疗和改进的诊断方法的鉴定。虽然心理计量测试 如简易精神状态检查通常是AD的良好预报器，尸体解剖仍然是阿尔茨 海默氏病诊断的唯一明确的方法。记忆力衰退在老年人中是常见的现象。 在严重的记忆力衰退为主要症状的事件中，该病症被称为轻度认知障碍 (MCI)，并且常常被看作是AD的初期阶段。在该阶段，治疗可能比后期 更为有效。据记载，MCI患者在3年内转化为临床型AD的比率为50％ (Karas et al.2008)。诊断医学中蛋白生物标志物的应用在逐渐增加。AD 的蛋白生物标志物，尤其是存在于易获取的生物液体如血液和尿液中的 那些蛋白生物标志物的鉴定，代表了当前诊断方法的合适的有效的替代 选择。原肌球蛋白是由两个α-螺旋组成的纤维分子。其广泛分布于所有 细胞类型中，在那里其调节肌丝肌动蛋白和肌球蛋白的收缩。在哺乳动 物中，4种高度保守的基因的不同剪接可产生多于40种同种型(Schevzov  et al.2005)。此外，每种同种型可接受不同程度的翻译后修饰，包括磷酸 化和糖基化。用于蛋白分离和鉴定的两种最常见的分析技术为二维凝胶 电泳(2-D DIGE)和2D蛋白质印迹。通过采用2-D DIGE确定血小板样品 中AD可能的生物标志物，EP2293075强调了两种原肌球蛋白同种型，指 定为Swissprot/Uniprot登录号P07951以及NCBI/Genbank登录号 BAB14554/AK023385。

发明概述

本发明提供了用于检测MCI和AD相关的包含外显子1a以及任选地 外显子9d的原肌球蛋白同种型的方法和试剂盒。

根据第一个方面，本发明提供了有助于阿尔茨海默氏病(AD)或轻度 认知障碍(MCI)诊断的体外方法，包括测定患者样品中对应于P09493-3 和/或P09493-1的一种或多种原肌球蛋白同种型的表达水平。

根据第二个方面，本发明提供了试剂盒，其包含结合原肌球蛋白同 种型P09493-3和P09493-1的探针，特征在于结合P09493-3和P09493-1 的不包含外显子1a的共同表位的第一探针，和特异性结合外显子1a的 第二探针。

根据第三个方面，本发明提供了改变一种或多种原肌球蛋白同种型 P09493-3和P09493-1的浓度水平的试剂，其被用于治疗AD或MCI。

附图说明

图1显示了由外显子1a和9d激发的抗体的钌染色；

图2显示了针对外显子1a的抗体的2D蛋白质印迹评估；并且

图3显示了针对外显子9d的抗体的2D蛋白质印迹评估。

发明详述

除非另有规定，提及外显子1a和9d是指如下所示的氨基酸序列：

外显子1a：-Leu-Asp-Lys-Glu-Asn-Ala-Leu-Asp-Arg-Ala-Glu-Gln-Ala-Glu-Ala-Asp- Lys-Lys-Ala-Ala-(SEQ ID NO.1)

外显子9d：-Glu-Lys-Val-Ala-His-Ala-Lys-Glu-Glu-Asn-Leu-Ser-Met-His-Gln-Met-Leu- Asp-Gln-Thr-Leu-Leu-Glu-Leu-Asn-Asn-Met-(SEQ ID NO.2)

术语“患者”和“个体”在本文中可互换使用，并且指任何动物(例如， 哺乳动物)，包括但不限于人、非人的灵长类、犬类、猫科动物、啮齿类 等，其将成为诊断的受试者。优选地，个体或患者为人。

术语“药物”和“试剂”在本文中可互换使用，并且指对生物系统产生影 响的化学或生物物质。

如本文所用，术语“原肌球蛋白同种型”包括所有基于原肌球蛋白的 蛋白质，包括来源于差异化遗传剪接和翻译后修饰形式的那些。对应于 图1、2和3的斑点2、3和4的3种原肌球蛋白同种型基于2D-WB和 质谱数据被指定为UniprotKB(UniprotKB；www.uniprot.org/uniprot)登录 号P09493-3；因此，在本文中提及P09493-3是指斑点2、3和4，除非另 有说明。如本文所述，提及P09493是指P09493-3(斑点2、3和4)和 P09493-1；本文中提及的P09493-1是如UniprotKB中所述，并且对应于 斑点1。

根据第一个方面，本发明提供了有助于轻度认知障碍(MCI)和/或阿尔 茨海默氏病(AD)诊断的方法，包括检测和测量体外患者样品中P09493和 /或其翻译后类似物的一种或多种的表达水平。在优选的实施方案中，待 检测和测量的原肌球蛋白同种型对应于P09493-3(斑点2、3和4)的一种 或多种。如本文所用，“表达水平(level of expression/expression level)”是指 所指蛋白或编码该蛋白的mRNA的量。P09493可与MCI和AD的其他 生物标志物一起使用以提高AD或MCI检测的诊断能力。蛋白生物标志 物并非单独使用，并且技术人员认可在使用P09493诊断MCI或AD过 程中，诊断还将包括使用身体和认识测试如MMSE进行患者的临床评估， 以助于将患者分类为AD或MCI。基于连同P09493使用的生物标志物的 诊断能力(例如，通过ROC曲线分析及灵敏度和特异性评估)，有可能的 是，生化生物标志物检测可为用于诊断AD或MCI的主要诊断工具。待 检测的原肌球蛋白同种型包含外显子1a以及任选地外显子9d；原肌球蛋 白同种型P09493-3包含外显子1a和9d，而原肌球蛋白同种型P09493-1 包含外显子1a，但没有外显子9d。待检测和测量的原肌球蛋白同种型优 选来源于获自患者血液样品的血小板。在MCI和AD患者中，已表明 P09493浓度相比对照值显示显著的增加。

优选地，对照值是来源于获自健康个体的样品优选血小板样品的 P09493的浓度。可选地，对照可为参照值。预期AD患者和健康对照中 的待测量血小板优选使用EP 1891445中描述的方法获得，其描述了从血 液样品中提取未活化血小板的方法。对照数据还可为来自在MCI/AD发 作前取自MCI/AD患者本身的样品的值。此类生物标志物诊断方法中的 通常做法是使用先前得到和存档的对照数据集。在优选的实施方案中， 一种或多种原肌球蛋白同种型表达水平相比对照值的增加指示AD或 MCI。本发明的方法任选地还可包括以能改变P09493浓度水平的试剂治 疗被诊断为患有AD或MCI的患者(或本发明方法指示可能会患AD或 MCI的患者)。

在第二方面，本发明提供了用于MCI和AD诊断的试剂盒，其包含 特异性识别外显子1a的第一探针和特异性识别P09493-3和P09493-1的 不包含外显子1a的共同表位的第二探针。为了诊断AD或MCI，第二探 针可为外显子9d特异性的。具体而言，指在测试的检测范围内，探针实 质上仅检测P09493，即探针与除P09493外的蛋白的任何结合的水平足够 低，使得该结合不影响诊断结果的完整性。探针优选为抗体。

如本文所用，术语“抗体”是指特异性识别靶标上的表位的免疫球蛋 白，如通过免疫球蛋白重链和轻链的可变域(V_HS和V_LS)，更具体而言互 补决定区(CDR)的结合特征所确定的。许多可能的抗体形式为本领域所已 知，其可包括但不限于多种完整的单克隆抗体或包含完整的单克隆抗体 的多克隆混合物、抗体片段(例如，F_ab、F_ab'和F_r片段、线性抗体单链抗 体和包含抗体片段的多特异性抗体)、单链可变片段(scF_vS)、多特异性抗 体、嵌合抗体、人源化抗体和包含识别靶标上给定表位所必需的结构域 的融合蛋白。优选地，在本发明上下文中提及抗体是指单克隆抗体。抗 体还可与多种报告部分缀合用于产生诊断作用，包括但不限于放射性核 素、荧光素或染料。提及抗体还包括“完整”抗体的短链可变片段和其他 亚结构变体。技术人员认可的是对于可用于本发明方法和试剂盒的抗体， 其需要识别外显子1a以及任选地9d。此类识别可包括识别完整外显子氨 基酸序列或外显子序列亚集的每种外显子特异性的抗体。例如，抗体识 别的外显子1a的亚集可仅包含7个氨基酸，但仍然为外显子1a特异性 的。其他适合用于本发明的探针为能够识别P09493的分子，如适体、分 子印迹的聚合物等。

本发明的第三个方面涉及改变P09493的浓度水平的试剂的用途；此 类用途意图作为减轻或抑制MCI和AD症状的治疗。

本发明还提供了治疗MCI和/或AD的方法，包括：(i)确定患者样品 中对应于P09493-3和/或P09493-1的一种或多种原肌球蛋白同种型表达 水平相比对照是否增加；以及(ii)给予能改变P09493的浓度水平的试剂。

本文所引用的所有出版物的内容通过引用并入本文。

本发明参照附图，通过以下非限制性实施例进行描述。

实施例

方法

研究人群

阿尔茨海默氏病患者：47名AD患者参与该研究。在取血当天进行 了CERAD(阿尔茨海默病联合注册表)的神经心理学成套测试。患者均未 以AD相关的药物如乙酰胆碱酯酶抑制剂或美金刚进行治疗。此外，痴 呆患者未接受长期的慢性抗精神病药物治疗，这可能已影响了Mao-B表 达。为了排除认知障碍的其他起因(例如，中风或肿瘤)，除了有两名患者 接受了计算机断层扫描(幽闭恐惧症、金属植入物)外，所有患者均接受了 脑部的结构成像扫描(磁共振成像)。基于CERAD标准 (http://cerad.mc.duke.edu/Assesment.htm/)，例如，病史、脑成像和神经心 理学CERAD成套测试，进行了以下诊断：47名AD(9名尸检确认)。总 共在13名患者中进行了神经病理学的尸体解剖。这些患者在取血后10-18 个月死亡。在患有临床疑似AD的47名患者的9名中，临床诊断得到神 经病理学确认，并且13名血管性痴呆(VD)病例中的4名满足混合型痴呆 (AD和VD)的神经病理学标准。神经病理学检查遵循标准方案，包括tau 蛋白(抗体AT-8,Innogenetics,Ghent,Belgium)、β-淀粉体(克隆4G8,Signet  Labs,Dedham,MA)和α-突触核蛋白(单克隆抗体和多克隆抗体,Chemicon, Temecula,CA)的苏木精/曙红染色、改良皮尔苏斯基氏浸渍(Bielschowsky  impregnation)和免疫组织化学。对于AD，根据确立的尸检一致标准进行 神经病理学诊断，包括CERAD评分。AD病例显示指示CERAD C和Braak 阶段V/VI的神经病理学，从而根据NIA里根研究所“痴呆”标准满足较高 的AD可能性。对照：无神经退行性疾病或认知障碍征兆的49名AD个 体的年龄和性别匹配的对照组。面见了所有个体，并由经验丰富的心理 学家进行神经心理学检查(MMSE)。包括在我们研究中的所有个体均为不 吸烟者。根据Petersen et al(1999&2004)确定轻度认知障碍。

研究设计的伦理方面

方案得到当地伦理委员会的批准，并且根据2000年修订的赫尔基辛 宣言的原则进行研究。在解释研究的目的和方案后从每名个体或律师获 得了知情同意书。

样品准备

不停顿从肘前静脉将血液抽入含有0.129mol/L柠檬酸钠作为抗凝剂 (与血液的混合比为1：9)的真空管(Greiner Bio-One GmbH,Kremsmunster, Austria)中。丢弃抽吸的第一管，以避免来自静脉穿刺的任何组织污染。 在MicroDiff 18血液分析仪(Coulter Electronics,Miami,FL,USA)上进行差 别血像检查。按先前的描述进行血小板分离程序和蛋白沉淀[31]。简而言 之，通过在4℃震荡过夜将沉淀再溶解于变性2-D样品缓冲液中，其含 有7M尿素、2M硫脲、4％CHAPS、20mM Tris-HCl(pH 8.5)。每100x 10⁶个血小板使用70微升的样品缓冲液。使用考马斯亮蓝蛋白检测试剂 盒以BSA作为标准蛋白(Pierce Biotechnology,Rockford,IL,USA)，以一 式三份测定再溶解的样品中的蛋白浓度。利用合适的稀释，2-D样品缓冲 液组分不干扰蛋白检测。因此，使用PBS以1:20稀释样品，并且将5％ 的2-D样品缓冲液加入至BSA标准液中。通过将每个研究样品的相同量 的总蛋白合并来组成2D DIGE分析的内部标准。将等份的内部标准和研 究个体样品储存在-80℃。在电泳前，根据厂商说明书并经少量修改以荧 光花青染料(CyDyes,GE Healthcare,Uppsala,Sweden)标记蛋白。将CyDye 与蛋白的比值降低至每μg蛋白5pmol的染料。以Cy2标记内部标准， 并可选地用Cy3或Cy5来标记样品。对于实时定量逆转录PCR (qRT-PCR)，按先前所述从凝胶过滤的血小板提取总RNA。

2D DIGE电泳和凝胶图像分析

按先前所述进行电泳和凝胶图像处理。简而言之，在含有染料标记 的样品的改良的再水合溶液(7M尿素、2M硫脲、4％CHAPS、70mM DTT 和0.5％两性电解质pH 4-7)中，使24cm、pH 4-7的9个IPG-Drystrip被 动地再水合。其后，通过被动再水合施加每一染料标记蛋白25μg。进行 等电点聚焦直至达到30kVh。在第二维度中进行11.5％SDS-PAGE(10℃ 下35V 1h,50V 1.5h和最终110V 16.5h)，并使用Typhoon 9410成像仪 (GE Healthcare,Uppsala,Sweden)在100μm分辨率下扫描凝胶。使用 DeCyder软件模块凝胶内差异分析(version 6.00.28；GE Healthcare, Uppsala,Sweden)，将靶标斑点数设定为2500，在凝胶图像上进行斑点检 测。将每个凝胶添加至合适的工作区和组，并使用DeCyder模块生物差 异分析(版本6.01.02)针对主凝胶进行匹配。凝胶成像分析程序在先前有 更为详细的描述。

蛋白鉴定

通过质谱分析鉴定蛋白。按先前所述进行后者的胰蛋白酶蛋白水解 物的制备。将肽加载至Zorbax 300SB-C8(5μm,0.3mm x 5mm)柱上，并使 用0.2％甲酸和3％乙腈至0.2％甲酸和45％乙腈的梯度，以250nl/min的 流速在12分钟内，利用Zorbax 300SB-C18(5μm,75μm x 150mm)柱，通 过纳流液相色谱(1100Series LC system,Agilent,Palo Alto,CA)进行分离。 利用装配垂直纳喷雾离子源的离子肼质谱仪(XCT-Plus,Agilent)，通过串 联质谱(MS/MS)碎片分析完成肽鉴定。通过Spectrum Mill MS蛋白质组工 作台软件(Version A.03.03,Agilent)解读MS/MS数据，并针对人蛋白的 SwissProt数据库(版本14.3，含有20,328个条目)进行搜索，所述数据库 允许1.5Da的前体质量偏差、0.7Da的产物质量公差和70％的最小匹配 峰值强度(％SPI)，以及一个切割的丢失。由于先前的化学修饰，半胱氨 酸的脲甲基化被设置为固定的修饰。肽评分高于13的错误发现率始终小 于1％，使得产生了对于确定具有两个或更多个高于13的肽评分的蛋白 的好于99.9％的确定性。

抗体产生

按月以对应于H-Cys-Leu-Asp-Lys-Glu-Asn-Ala-Leu-Asp-Arg- Ala-Glu-Gln-Ala-Glu-Ala-Asp-Lys-Lys-Ala-Ala-NH2和H-Cys-Glu-Lys-Val- Ala-His-Ala-Lys-Glu-Glu-Asn-Leu-Ser-Met-His-Gln-Met-Leu-Asp-Gln-Thr- Leu-Leu-Glu-Leu-Asn-Asn-Met-OH的肽序列免疫绵羊，该肽序列通过N 端半胱氨酸残基与牛血清白蛋白(BSA)缀合。按月将产生的免疫原给予成 年绵羊，以产生多克隆响应。然后收获淋巴细胞并与异源骨髓瘤细胞融 合。采用基于ELISA的检测，从产生的杂交瘤的上清液筛选外显子特异 性抗体的存在，其中微量滴定板包被有全长蛋白。将阳性杂交瘤克隆至 稳定。纯化通过所产生的单克隆杂交瘤生成的抗体，通过1维和2维蛋 白质印迹(1D和2D WB)进行表征，并用于建立生物芯片三明治免疫检测。 将检测施加于Evidence Investigator分析仪，其利用了基于ELISA免疫检 测原理的生物芯片阵列技术(Fitzgerald et al 2005)。

2维蛋白质印迹分析

对于2D蛋白质印迹分析，通过24cm、pH 4-7的IPG胶带(GE  Healthcare)上的IEF，在第一维中分离30μg的TCA沉淀的和尿素/硫脲 /CHAPS再溶解的血小板蛋白。通过SDS PAGE在13x 16cm凝胶上进行 第二维，并将分离的蛋白转移至硝酸纤维素膜(Pall,East Hills,NY)。使用 基于钌-(II)-三-(红菲绕啉二磺酸盐)(RuBPS)的荧光染料对膜上的总蛋白 进行染色。其后，使用于含有0.3％Tween-20的PBS(PBS-T)中的5％脱 脂干燥奶粉将膜封闭2小时。通过孵育膜检测AD相关的原肌球蛋白同 种型：a)对于抗1a外显子检测，HRP标记的抗1a外显子抗体(1/1000)， 孵育1h，使用Luminol PLUS/过氧化物检测，暴露10sec；b)对于抗9d 外显子检测，HRP标记的抗9d外显子抗体(1/1000)，孵育1h，使用Luminol  PLUS/过氧化物检测，暴露30sec-1min。

结果

选择外显子9d特异性的捕获抗体固定于生物芯片表面上，并将外显 子1a特异性的检测抗体与辣根过氧化物酶缀合以产生检测示踪物。采用 这些免疫试剂开发的生物芯片免疫检测展现对4种AD和MCI相关的 P09493原肌球蛋白同种型中的3种的特异性。1D和2D蛋白质印迹确定， 产生的针对外显子1a和9d的抗体结合至斑点2、3和4(图1)。还发现 AD和MCI样品中每种上调的原肌球蛋白同种型都包含外显子1a。通过 质谱指定的4种其他的原肌球蛋白同种型对应于斑点5、6、7和8(图1)， 其均不包含外显子1a，且在AD和MCI样品中均未上调。检测灵敏度为 <10ng/ml(测量范围0-700ng/ml)，且对于标准水平浓度，批内精确度为 <10％。在所用的实验条件下，斑点1具有pI＝4.5，且MW＝～37kDa，斑 点2具有pI＝4.5，且MW＝～37kDa，斑点3具有pI＝4.6，且MW＝～35kDa， 并且斑点4具有pI＝4.56，且MW＝～33kDa。在分离的血液血小板中，检 测到了多达12μg/ml的水平。表1(％变化行)证实，相比对照，对应于斑 点1、2、3和4的P09493原肌球蛋白同种型，单独地或组合地，在AD 和MCI患者中均上调。t-检验强调了相比对照，斑点2和所有4个斑点 的组合在AD和MCI患者中均显著上调(P<0.05)。该研究的结果表明，疑 似患有AD或MCI的患者的体外样品中上调的P09493-3和P09493-1原 肌球蛋白同种型的检测和测量预示AD和MCI。

参考文献

Karas et al(2008).Am.J.Neuroradiol,29(5):944-949

Schevzov G.et al(2005).J.Histochem.Cytochem.,53(5):557-570

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Petersen et al(2004).J.Intern.Med.256(3):183-194.