能够同时检测CymMV和ORSV的RT-PCR检测试剂盒及方法

摘要

本发明提供了一种能够同时检测CymMV和ORSV的RT-PCR检测试剂盒，主要包括特异性简并引物以及PCR反应试剂，所述简并引物核苷酸序列如下：上游引物：5’-TYAAMAMTKKCGAGAAAG-3’；下游引物：5’-TYGKGWMCRGTGTTAAT-3’；本发明通过设计能针对两种病毒的简并引物，建立了同时检测两种兰花病毒的一步RT-PCR检测试剂盒和方法，实践证明，该方法高效、快捷、准确，不失为一种好的病毒检测方法。

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种能够同时检测建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic  virus，CymMV）和齿兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus，ORSV） 的RT-PCR检测试剂盒及其检测方法。

（二）背景技术

建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus，CymMV）是侵染兰花最常 见的两种病毒之一。CymMV隶属线形病毒科（Flexiviridae）、马铃薯X 病毒属（Potexvirus），CymMV病毒粒子为线状正链单链RNA（+ssRNA）， 大小约为475nm×13nm或为490nm×13nm，病毒外壳无包膜，线行弯曲， 螺旋对称延伸，螺纹明显，螺距2.8nm，5’端有甲基化结构，3’端带有 poly(A)尾巴，病毒RNA基因组全序列约6-7kb，整个基因组由5个开放 读码框架（ORF）构成，编码为RDRP（160KDa）、TGB （26KDa/13KDa/10KDa）以及CP(24KDa)，其中CP基因是完整地ORF5 框，长约700nt，编码24kD的外壳蛋白，与该同属的其它成员有很高的 同源性。

齿兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus,ORSV）也是侵染兰花 最常见的两种病毒之一，曾经被命名为烟草花叶病毒兰花株系，ORSV隶 属烟草花叶病毒属（Tobamovirus），ORSV病毒粒子形状为立体杆状，大 小为300nm×18nm，螺距对称，螺纹明显，ORSV病毒粒体由衣壳蛋白 和+ssRNA组成，衣壳蛋白无包膜，单组分或多组分，5’端含有甲基化 帽子结构m7G5’PPP5，3’端带有类似t-RNA的结构。病毒RNA基因 组全序列约6-7kb，是烟草花叶病毒属中最长的，包含4个ORF，基因组 RNA编码181KDa的通读蛋白分别含126kDa RdRp蛋白、34kDa运动蛋 白、52kDa推断复制酶蛋白和18kDa外壳蛋白。CP基因位于最后一个 ORF，长约470bp，编码18kD的外壳蛋白，与该同属的其它成员也有很 高的同源性。兰科植物受CymMV和ORSV病毒病严重侵害而无法根治 的问题，其中复合侵染率高，一旦感染了这两种病毒，兰花的叶片将会形 成褪绿条纹、凹陷的灰白斑或者是坏死圈斑等症状，导致植株生长不良、 开花小而少、花期缩短、使植株的观赏价值大为下降，造成巨大经济损失， 是阻碍兰科植物正常生长、兰科珍惜种质资源保存及兰花产业发展的重要 瓶颈。常规的病毒血清学检测方法普遍存在灵敏度不高的缺点，而一般的 分子检测病毒，RNA提取质量的好坏对实验结果影响很大，而RNA又特 别容易降解，提取技术要求高；同时，要检测两种兰花病毒必须要设计针 对两种病毒的不同引物对，检测的过程也要分开进行，费时费力。

（三）发明内容

本发明目的是提供一步RT-PCR同时检测CymMV和ORSV两种主 要的兰花病毒的试剂盒及方法。

本发明采用的技术方案是：

一种能够同时检测CymMV和ORSV的RT-PCR检测试剂盒，主要 包括特异性简并引物以及PCR反应试剂，所述简并引物核苷酸序列如下：

上游引物：5’-TYAAMAMTKKCGAGAAAG-3’；

下游引物：5’-TYGKGWMCRGTGTTAAT-3’；

其中Y、M、K、W、R为简并碱基，Y为C或T，M为A或C，K 为G或T，W为A或T，R为A或G。

简并引物是获得序列未完全清楚的核酸的一种引物设计方案，特点是 所设计的引物序列某位置的核苷酸可以分别是两个或两个以上不同的碱 基，结果所合成的引物是该位置上不同序列的混合物。本申请发明人利用 NCBI上的CymMV与ORSV病毒核酸信息，通过DNAMAN软件对两 种兰花病毒进行同源比对（Ktuple=6,Gap_penalty=7），设计了同时针对 两种病毒的一对简并引物，引物序列及结合位点见图1。预期扩增目的条 带大小分别为：CymMV 558bp；ORSV 825bp。

本发明的关键在于简并引物的设计，试剂盒中其他组成，可按本领域 常规进行选择。PCR反应试剂包括PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物 和DNA聚合酶等，其中PCR缓冲液可采用市购商品，也可自行配制， 例如将Tris-HCl、KCl、MgCl₂等按比例混合进行配制，进行检测时，将 PCR反应试剂和扩增引物混合，再加入待测样品，即可进行PCR扩增反 应。

本发明还涉及一种一步RT-PCR检测CymMV和ORSV的方法，所 述方法包括：

（1）提取待测兰花样品总RNA；待测样品一般选择兰花叶片上有局 部褪绿、黄化条纹的部分；

（2）样品总RNA经反转录获得其cDNA；

（3）以样品cDNA为模板，加入简并引物和PCR反应试剂，进行 PCR扩增，扩增产物进行凝胶电泳，若电泳结果出现558bp条 带，则表示样品中含有CymMV；若样品中出现825bp条带，则 表示样品中含有ORSV；反之，则表示样品中不含有CymMV或 ORSV；所述简并引物核苷酸序列如前所述。PCR产物也可测序 后到NCBI里进行Blast同源比对以进一步验证其结论。

所述PCR反应程序如下：94℃预变性3分钟，94℃1分钟，45℃复 性1分钟，68℃延伸1分钟，循环次数为30次，68℃延伸5分钟。

本发明的有益效果主要体现在：本发明通过设计能针对两种病毒的简 并引物，建立了同时检测两种兰花病毒的一步RT-PCR检测试剂盒和方 法，实践证明，该方法高效、快捷、准确，不失为一种好的病毒检测方法。

（四）附图说明

图1为DNAMAN软件对ORSV及CymMV进行同源比对，展示出了简 并引物结合的具体位点；数字表示核苷酸的位置，两种病毒序列中完全一 致的核苷酸序列用“︱”表示；a：上游引物序列及结合位点；b：下游引物 序列及结合位点；

图2为6个品种35个样品免疫捕获RT-PCR电泳图；1~15：四季兰；16~28： 墨兰；29：慧兰；30、31：金钗石斛；32、33：春兰；34、35：蝴蝶兰； M:Marker DL2000。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围 并不仅限于此：

实施例1：

1、材料与方法

1.1实验材料

墨兰（Cymbidium sinensis）、建兰（Cymbidium ensifolium）、四季兰 （Cymbidium ensifolium var rubrigemmum）、蕙兰（Cymbidium faberi）、春 兰（Cymbidium goeringii）、金钗石斛（Dendrobium Stem）、来自于广东汕 头，蝴蝶兰（Phalaenopsis amabilis）来自杭州市农业科学研究院。所有 叶片样品采集有局部褪绿、黄化条纹的部分。

1.2试剂

BioRT cDNA第一链合成试剂盒购自杭州博日科技，内含AMV Reverse Transcriptase、5×RT Buffer、dNTP Mixture、RNase inhibitor、 Random Primer、RNase-free H₂O；

Taq酶购自上海生工生物技术有限公司。

T/A克隆测序试剂盒：Target Clone^TM，TOYOBO。

酵母浸出液，蛋白胨为国产分析纯。

1.3方法

1.3.1提取总RNA

（1）取1g待测叶片用液氮研磨，装入DEPC处理过的1.5mL EP管中， 加入1mL Trizol（购于Invitrogen公司），漩涡振荡；

（2）4℃，4000r/min，离心15分钟，将上清液转移至新的EP管中，冰 上静置15分钟；

（3）加入200μL预冷的氯仿，充分漩涡30秒，冰上静置5分钟；

（4）4℃，4000r/min，离心15分钟，将上清液转移至新的EP管中，并 置于冰上；

（5）加入500μL预冷的异丙醇，振荡混匀，冰上放置10分钟；

（6）4℃，4000r/min，离心30分钟，弃上清；

（7）加入1mL 80%预冷的乙醇洗涤沉淀，轻微振荡，4℃，4000r/min， 离心5分钟，弃上清；

（8）重复（7）步骤一次；

（9）室温干燥10分钟；

（10）在冰上加入55μL Rnase-free无菌水，冰上放置10分钟，重悬RNA 溶解；

（11）1μL上述RNA稀释至500倍测浓度；

（12）取1μL总RNA(稀释成5μL)+5μL 2×RNA loading buffer，65℃水 浴5分钟，1%琼脂糖凝胶电泳。

1.3.2反转录

按照试剂盒的使用说明，加入Rnase-free H₂O 3.5μL、5×RT Buffer 2μL、2mM dNTP 1μL、下游简并引物0.5μL（20μM/μL）、Rnase inhibitor 0.5μL、模板RNA 2μL、AMV Reverse transriptase 0.5μL，总体积10μL。 反转录程序为：48℃45分钟之后94℃3分钟。反转录完成后冰上放置3 分钟。

1.3.3PCR扩增

取反转录产物2μL做为模板，上、下游简并引物（20μM/μL）各0.5μL、 10×PCR Buffer（购于Invitrogen公司）2.5μL、25mM MgCl₂ 1.5μL、2mM dNTP 2.5μL、Taq酶0.3μL，加灭过菌的双蒸水到总体积25μL。

PCR程序为：94℃预变性3分钟，94℃1分钟，45℃复性1分钟，68℃ 延伸1分钟，循环次数为30次，68℃延伸5分钟。反应结束以后取5μL 扩增产物于1%琼脂糖凝胶上进行电泳。

1.3.4PCR产物T/A克隆后测序

取CymMV及ORSV PCR扩增产物做T/A克隆，具体的操作依据试 剂盒说明书。重组载体转DH5α感受态细胞，之后倒LB固体培养基平板， 37℃培养12~16小时后蓝白斑筛选。挑取白色的单斑于LB液体培养基摇 菌过夜。第二天用菌液做PCR模板，进行PCR验证找出阳性重组载体。 挑选出的重组载体菌液取1mL送上海Invitrogen公司测序。

1.4结果与分析

1.4.1提取总RNA、RT-PCR扩增

对6种35个样进行提取总RNA后RT-PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳 检测发现有31份呈阳性，检出率为88%（31/35），其中感染ORSV为77% （27/35），感染CymMV为25%（9/35），复合感染率为14%（5/35）（图 2）。这说明这一地区中齿兰环斑病毒流行率较高，同时也存在一定量的复 合感染。PCR扩增与预计扩增条带大小基本一致，CymMV 558bp；ORSV 825bp。

1.4.2T/A克隆测序结果

PCR产物T/A克隆后菌液送Invitrogen公司测序，代表性序列的测 序结果到NCBI里进行Blast同源比对，结果表明：PCR扩增的CymMV 条带序列（SEQ ID No.3）（11号样品）与编号AF016914.1的建兰花叶病 毒韩国株2型全基因组序列97%同源；ORSV条带序列（SEQ ID No.4） （23号样品）与NCBI中编号AY571290.1齿兰环斑病毒台湾株全基因组 的同源性高达99%，进一步验证了检测结果。