用于拮抗太子参根际土壤尖孢镰刀菌的多粘类芽孢杆菌

摘要

本发明涉及一株用于拮抗太子参根际土壤尖孢镰刀菌的多粘类芽孢杆菌。所述多粘类芽孢杆菌为多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）S960,已于2012年4月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCCNo.6021。该菌株可高效抑制太子参根际土壤的尖孢镰刀菌，在该领域的应用前景广阔。

说明书

技术领域

本发明涉及一株用于拮抗太子参根际土壤尖孢镰刀菌的多粘类芽孢杆菌。

背景技术

太子参是一种补益性中药材，补益脾肺，益气生津，治肺虚咳嗽，脾虚食少，心悸，怔忡，水肿，消渴，精神疲乏。用于脾气虚弱，胃阴不足，食少体倦，口渴舌干；肺虚燥咳，咽干痰粘；气阴不足，心悸失眠。其药性缓和，还适合病后虚弱者使用。太子参还作为中成药健胃消食片的主要成分，乃至作为保健饮片出口东南亚等国。

太子参用途广泛，市场需求越来越大。但是，其连作障碍极其严重，即在同一块地里连续种植太子参，即使在加强田间管理的情况下，其生长状况变差，叶片光合作用速率显著下降，最终导致其产量急剧降低到前茬的1/2至1/3以下、甚至绝收，其品质变劣，多糖和总人参皂苷含量显著下降。申请人经过研究证实：种植太子参后，根际土壤中尖孢镰刀菌(F.oxysporum)数量极显著增加；将分离到的尖孢镰刀菌接种于种植太子参的健康土壤中，尖孢镰刀菌在健康土壤中大量增殖，且侵染太子参根部，引发太子参病害。

发明内容

为此，本发明从土壤中筛选到一株高效拮抗太子参根际土壤尖孢镰刀菌的多粘类芽孢杆菌。

本发明提供的一株用于拮抗太子参根际土壤尖孢镰刀菌的多粘类芽孢杆菌，为多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）S960,已于2012年4月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.6021。

该菌可在在芽孢杆菌通用培养基中培养发酵。培养基为：培养基成分：葡萄糖0.7%；蛋白胨0.5%；牛肉膏0.3%；MgSO₄·7H₂O 0.02%；pH  7.5-7.6。

该菌在改良高氏I号培养基（可溶性淀粉20.0g，KNO₃ 1.0g，K₂HPO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 0.5g, FeSO₄·7H₂O 0.01g，琼脂15g，蒸馏水1000mL）上生长良好，菌落呈黄色，凸起，表面湿润且光滑。其气生菌丝生长旺盛，分枝多；基内菌丝无横隔、不断裂（图1）。

在油镜下（目镜10×，物镜100×）下观察到的孢子丝细、长，孢子卵圆形。该菌株经形态学和16s RNA分子生物学鉴定，确定为多粘类芽孢杆菌。

该菌株能较广泛利用碳源，包括：L-鼠李糖、蔗糖、D-葡萄糖和D-甘露醇，但对部分碳源不利用，包括：D-果糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、L-肌醇、麦芽糖及纤维二糖，也能较广泛利用氮源，可以使明胶液化、牛奶凝固及胨化，可产生硫化氢，但是对淀粉不水解，也不利用纤维素。

本发明的多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）S960,可高效抑制太子参根际土壤的尖孢镰刀菌，在该领域的应用前景广阔。该菌株已于2012年4月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保蒇，其简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No. 6021。

附图说明

图1为多粘类芽孢杆菌S960在高氏合成1号琼脂培养基生长图。

图2为多粘类芽孢杆菌S960对尖孢镰刀菌的抑菌效果。

具体实施方式

1、多粘类芽孢杆菌S960的分离与纯化

（1）制备土壤悬浮液：取一定量种植过两年太子参的土壤（福建省柘荣县太子参GAP生产基地），自然风干后在研钵内研磨，当土壤颗粒较均一，无大颗粒时停止。称取10 g研磨好的土壤，放入装有90mL无菌水的三角瓶中充分振荡，制成10^-1的土壤稀释液。从上述溶液中取出1mL加到9mL无菌水中充分振荡制成10^-2的稀释液，以此类推，制成10^-3、10^-4、10^-5倍的土壤溶液备用。

（2）平板接种：分别取上述3个浓度土壤稀释液50uL，加到已凝好的改良高氏I号平板培养基上（可溶性淀粉20.0g，KNO₃ 1.0g，K₂HPO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 0.5g, FeSO₄·7H₂O 0.01g，琼脂15g，蒸馏水1000mL；为了防止细菌和真菌污染，在培养基中加入重铬酸钾，浓度为200mg/L），用灭菌的玻璃涂棒将稀释液均匀的涂布开。放入28℃恒温培养箱中培养。

（3）纯化：随时观察并记录菌株的原始培养结果。及时挑取单个菌落至改良高氏I号平板上，用划线分离法纯化，分离纯化的菌株统一编号。保存到改良高氏I号液体培养基中。

2、多粘类芽孢杆菌S960的筛选及其抑菌效果测定

拮抗菌的初筛：将上述纯化的各菌株与尖孢镰刀菌以1:4对峙培养法进行初筛:取出上述纯化的菌液200uL倒入改良高氏I号平板培养基上，用灭菌的玻璃涂棒将稀释液均匀的涂布，28℃培养5d。在倒好PDA的平板培养基上用直径5mm打孔器在直径为9cm的平板培养基中心打孔，并将同样大小的尖孢镰刀菌菌块接入。在距离尖孢镰刀菌上下左右2cm的4个方向分别打孔，接种多粘类芽孢杆菌菌块。只接种尖孢镰刀菌的PDA平板培养基为对照。28℃培养，至空白尖孢镰刀菌长满整个平板时，选出有明显抑菌圈的菌株，继续用于1:1对峙培养。

1:1对峙培养方法同1:4对峙培养，区别是在PDA平板培养基直径上的两个1/3等分处分别接种一个5mm孔径大小的待筛选菌株和尖孢镰刀菌。筛选抑菌圈最大的菌株对其进行鉴定，经形态学和16sRNA分子生物学鉴定，确定为多粘类芽孢杆菌，命名为粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）S960。

S960菌株经种子罐发酵，至中试发酵罐进一步放大发酵后，在太子参种植后立即喷雾施用于土壤，或菌液发酵后，拌基肥施用于即将种植太子参的土壤。菌液喷雾施用或拌基肥施用，其施用浓度为10⁷-10⁸CFU/mL。施用后将显著提高太子参产量和品质。

3、多粘类芽孢杆菌S960的抑菌效果测定

在实验室中，将多粘类芽孢杆菌S960涂布接种在PDA平板培养基上，同时用打孔器将尖孢镰刀菌的菌苔打成直径为6mm的小菌块并将其移入已在平板培养皿中心位置打好孔的孔内。未涂布接种该菌的PDA平板培养基中心位置接入尖孢镰刀菌菌苔为空照。28℃恒温培养5日，进行菌落直径大小测量及抑制率计算，确定菌株的拮抗性能。

抑菌率计算公式：抑菌率(%)=(对照的尖孢镰刀菌菌落直径－涂布接种该菌的尖孢镰刀菌菌落直径)/对照的尖孢镰刀菌菌落直径×100%。

结果，该菌株对尖孢镰刀菌5天抑菌率达到91.8%，如图2所示。

4、多粘类芽孢杆菌S960的应用前景

植物病害80%以上是由真菌引起的，控制真菌病害对于提高农作物产量极其重要。尖孢镰刀菌是一类典型的土传病害真菌，在土壤和有机质中数量多而活跃，其寄居范围非常广泛，可引起瓜类、茄科、香蕉、棉、豆科及花卉等100多种植物发生枯萎病，在农业生产中导致严重的作物减产，降低品质，影响供应和外销，甚至引起人畜中毒，造成严重的经济损失。申请人经过研究证实：种植太子参后，根际土壤中尖孢镰刀菌数量极显著增加；将分离到的尖孢镰刀菌接种于种植太子参的健康土壤中，尖孢镰刀菌在健康土壤中大量增殖，且侵染太子参根部，引发太子参病害。全国每年太子参总栽培面积约5万多亩，按目前市场价格估算，全国产值约50亿多元人民币，但是连作后太子参根际土壤中尖孢镰刀菌等致病菌和病原菌增多,使得产量急剧下降为头茬（对照）的1/3以下，产生严重的经济损失，是一个急需解决的重要问题。多粘类芽孢杆菌S960可高效抑制太子参根际土壤的尖孢镰刀菌。在该领域的应用前景广阔。