北京鸭STMN1基因单核苷酸多态性及其分子标记的检测方法

摘要

本发明公开了北京鸭STMN1基因的单核苷酸多态性及其检测方法，其基因单核苷酸多态性包括：以包含STMN1基因的待测北京鸭全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增北京鸭STMN1基因；用限制性内切酶EcoRII消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定北京鸭STMN1基因外显子4第48位的核苷酸碱基多态性。本发明是一种在DNA水平上筛查和检测与北京鸭经济性状密切相关的分子遗传标记，为北京鸭快速选育提供了分子依据。

说明书

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及以北京鸭的功能基因的单核苷酸多态性(SNP)作为分子遗传标记，特别涉及北京鸭STMN1基因的单核苷酸多态性及其检测方法。

背景技术

单核苷酸多态性(SNP)就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性。因此，通常所说的SNP包括碱基的替换、插入、缺失以及重复序列拷贝数的变化。一个SNP表示在基因组某个位点上有一个核苷酸的变化，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起；具有转换型变异的SNP约占2/3，其他几种SNP在相似的水平上。CpG二核苷酸的胞嘧啶是基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。

在任何已知或未知的基因内或附近都可能找到数量不等的SNP，根据它们在基因组中分布的位置可分为基因编码区SNP(cSNP)、基因周边SNP(pSNP)和基因间SNP(iSNP)等三类。总的说来，cSNP比较少，因为在外显子内的变异率仅占周围序列的1/5，但它在遗传病和育种的研究中却具重要意义，因此倍受关注。根据对遗传性状的影响，cSNP又可分为两种：一种是同义cSNP，即SNP所致编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质中氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的“含义”相同；另一种是非同义cSNP，即碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变，从而产生蛋白质序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能。因此，对编码区SNP的非同义突变来说，它们可能对基因功能有直接的重要影响。不仅如此，在群体遗传研究中，这些SNP作为遗传标记在群体遗传和生物进化的研究中也具有重要意义。

由于SNP是二等位基因分子标记，所以，理论上在一个二倍体生物群体中，SNP可能是由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上3个或4个等位基因的SNP很罕见，故SNP通常被简单地称为二等位基因分子标记。目前，主要采用几种不同的路线来发现SNP：即DNA序列测定方法、PCR-SSCP与DNA测序结合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。在这些SNP检测技术中，DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但是，其检测费用极其昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术人员和经验，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法；当然，利用PCR-SSCP与DNA测序结合法检测SNP可以适当降低检测费用，但是，PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阳性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段；AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；而引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。

PCR-RFLP方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后使用限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖或聚丙烯凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。PCR-RFLP方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了其费用昂贵、操作繁琐、假阳性率高的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。

STMN1(Stathmin)基因抑制微管形成，因为其在杏仁体的外侧核(LA)以及将后天恐惧和先天恐惧的刺激信息发送到外侧核的丘脑和皮层结构中高表达。Brocke等人报导编码STMN1的基因有两个影响人类恐惧和焦虑刺激的行为反应的SNP(rs182455，rs213641)。提高饲料转化率能减少生长所需的饲料数量，能减少生产费用，也能减少含氮废料的数量。在不影响动物成长的前提下，减少RFI能减少饲料喂养量，能减少背部脂肪，能减少费用。因此，研究家禽STMN1基因遗传变异和分子遗传特征具有重要理论和实践意义。

关于动物STMN1基因遗传变异的研究国内外多见于人、鼠等动物，而未见北京鸭STMN1基因遗传变异或SNP研究的报道。由于目前北京鸭STMN1基因遗传变异领域的研究匮乏，使该基因位点的功能研究及该基因遗传变异与经济性状关联的研究成为空白。

发明内容

本发明解决的问题在于提供北京鸭STMN1基因单核苷酸多态性检测方法及其应用，寻找与北京鸭经济性状相关的SNP作为分子标记，加快北京鸭良种繁育速度。

本发明的目的在于提供北京鸭STMN1基因的单核苷酸多态性，该基因单核苷酸多态性包括：北京鸭STMN1基因外显子4第48位为C或T的单核苷酸多态性。

本发明的还一目的在于提供北京鸭STMN1基因的单核苷酸多态性的检测方法，本发明通过以下技术方案来实现：

以包含STMN1基因的待测北京鸭全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增北京鸭STMN1基因；用限制性内切酶EcoRII消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定北京鸭STMN1基因外显子4第48位的单核苷酸多态性；

所述的引物对P为：

上游引物P1：GCAGAGGAGAAGCTGACCCAC 21

下游引物P2：CATCAACCCAGGAGCGAGTG 20。

所述的PCR扩增反应程序为：

94℃预变性5min；94℃变性30s，54.6℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。

所述的琼脂糖凝胶电泳为浓度为2.5％的琼脂糖凝胶电泳。

所述的根据琼脂糖凝胶电泳结果，STMN1基因外显子4第48位的碱基多态性为：CC型为3个片段：10bp、201bp和536bp；CT型为5个片段：10bp、201bp、262bp、274bp和536bp；TT型为4个片段：10bp、201bp、262bp和274bp。由于片段10bp太小，在琼脂糖凝胶不能观察到，片段262bp和274bp大小相差太小，在琼脂糖凝胶上不易分开，形成了1条带，所以在琼脂糖凝胶上，CC基因型可以观察到2条带(201bp和536bp)，CT基因型可以观察到3条带(201bp、262bp+274bp和536bp)，TT基因型可以观察到2条带(201bp和262bp+274bp)。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明公开了与北京鸭生长发育相关的功能基因STMN1的核苷酸多态性，该核苷酸多态性能够作为一个分子遗传标记，利用标记位点信息和数量性状的表型信息，更准确估计动物个体的育种值，提高选择效率，加快育种进展。

本发明对STMN1基因的SNP进行了基因分型和基因频率分析，结果显示STMN1基因的核苷酸多态位点能够成为分子遗传辅助育种的标记。

本发明提供的检测方法为STMN1基因的SNP与经济性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国北京鸭标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的北京鸭种群。

附图说明

图1为北京鸭STMN1基因外显子4的747bp克隆测序PCR产物电泳图；

图2为北京鸭STMN1基因外显子4的747bp PCR产物的EcoRII酶切电泳检测STMN1基因多态性的电泳结果图；泳道1：CT基因型个体(10bp、201bp、262bp、274bp和536bp)；泳道2、3：TT基因型个体(10bp、201bp、262bp和274bp)；泳道4、5：CC基因型个体(10bp、201bp和536bp)；M：Marker(2000bp)；由于片段10bp太小，在琼脂糖凝胶不能观察到，片段262bp和274bp大小相差太小，在琼脂糖凝胶上不易分开，形成了1条带，所以在琼脂糖凝胶上，CC基因型可以观察到2条带(201bp和536bp)，CT基因型可以观察到3条带(201bp、262bp+274bp和536bp)，TT基因型可以观察到2条带(201bp、262bp+274bp)。

图3为北京鸭STMN1基因SNP的不同基因型测序峰图，其中图3a、图3b和图3c分别代表CC、TT和CT基因型。

图4为EcoRII PCR-RFLP方法检测北京鸭STMN1基因外显子4的SNP分析。

具体实施方式

本发明以STMN1基因保守序列设计引物扩增STMN1基因外显子4的的747bp片段，以北京鸭品种的基因组为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物纯化，经测序后寻找该扩增片段的单核苷酸多态；针对发现的单核苷酸多态进行性状关联性分析，并提供其检测方法，使得STMN1基因的核苷酸多态性成为一种能够快速、方便检测的分子遗传标记，为加快建立具有优质经济性状的北京鸭种群提供依据。

a、北京鸭STMN1基因部分DNA序列的克隆及其多态性的检测

1、北京鸭血样的采集及处理

取北京鸭血样6mL，加入0.5mol/L的抗凝剂ACD 1mL抗凝，缓慢颠倒3次后放入冰盒，-80℃保存备用。

本发明采用了北京鸭品种样品，具体如表1所示。

表1北京鸭品种样品来源表

2、血样基因组DNA的提取、纯化

(1)取20μL抗凝全血置于1.5mL的离心管中，再添加500μL 1×STE缓冲液、15μL20％SDS和20μL0.01mg/μL蛋白酶K，置于55℃水浴锅中，过夜消化。

(2)将离心管取出，添加500μL饱和酚，于冰盒中轻摇20min，离心10min(10000r/min)。

(3)取上清，放到新的离心管中(无菌)，加入500μL饱和酚，于冰盒中轻摇20min，离心10min(10000r/min)。

(4)取上清，移入新的灭过菌的离心管中，加入500μL氯仿-异戊醇(24∶1)，于冰盒中轻摇20min，离心10min(10000r/min)。

(5)取上清，移到无菌的新的离心管中，加入500mL冰无水乙醇(-20℃)，来回颠倒沉淀物(DNA)，离心10min(10000r/min)，轻轻倒掉上清液。

(6)加入1mL 70％乙醇，清洗DNA，10000r/min离心5min，弃上清液。

(7)重复步骤6。

(8)置于通风橱中，干燥2～4h，使其水分挥发。

(9)DNA完全干燥后，加入200μL灭菌后的TE溶液，在4℃冰箱中放置3天，以溶解DNA。

(10)将提取到的DNA短期(-20℃)或长期(-70℃)保存，使用前取出稀释即可。

3、DNA池的构建

(1)1％琼脂糖凝胶电泳检测

选部分DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，选择DNA样品条带均一、无拖尾、无降解的样品进行DNA池的构建。

(2)OD值测定

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值。如OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。

DNA浓度(μg/mL)＝50×OD₂₆₀值×稀释倍数

(3)北京鸭DNA池的构建

DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50mg/μL，然后从50个北京鸭个体浓度为50ng/μL DNA样品中取10μL混合构建成品种DNA池。

4、克隆测序PCR扩增引物设计

由于北京鸭STMN1基因的序列不完整，故从NCBI数据库中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得原鸡的GenBank登录号为：NM_001001858.1的STMN1基因DNA序列，然后利用Primer 5.0设计北京鸭STMN1基因外显子4的747bp片段的PCR引物对，其引物对序列如下：

上游引物P1：GCAGAGGAGAAGCTGACCCAC  21

下游引物P2：CATCAACCCAGGAGCGAGTG  20。

5、PCR克隆北京鸭STMN1基因

以北京鸭的DNA池为模版，用设计的克隆测序引物进行PCR扩增，PCR总反应体系为25μL，见表2；PCR总反应程序，见表3。

表2PCR反应体系

  体系成分  体积(μL)  10×PCR缓冲液(MBI)  2.50  MgCl₂(25mmol/L)  1.50

  dNTPs(2.5mmol/L)  2.50  上游引物(10pmol/L)  0.25  下游引物(10pmol/L)  0.25  Taq DNA聚合酶(0.5U/μL)  2.00  DNA模板(50ng/μL)  1.00  灭菌超纯水(H₂O)  15.00  总体积  25.00

表3PCR反应程序

6、PCR产物纯化和测序

PCR扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1所示，可以清楚看到747bp的条带，说明目的基因克隆成功；然后进行PCR产物的切胶回收及纯化：在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管中，然后用PCR产物回收纯化试剂盒(北京天根生物公司)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤如下：

(1)首先向吸附柱中加入500μL平衡液BL，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(2)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。

(3)向胶块中加入等体积溶液PC，60℃水浴放置10min左右，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

(4)将上一步所得溶液加入一个吸附柱中，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。

(5)向吸附柱中加入700μL漂洗液，12000r/min离心1min，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。

(6)向吸附柱中加入500μL漂洗液，12000r/min离心1min，倒掉废液，将离心吸附柱放入收集管中，12000r/min离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温或50℃温箱数分钟，彻底晾干。

(7)将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液，室温放置2min。12000r/min离心1min收集DNA溶液。

(8)为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步骤7。

把以上北京鸭品种DNA池为模板的PCR纯化产物送上海生物工程有限公司进行双向测序。

对测序峰图进行分析，其中在同一位点有两个不同峰的是发生了单核苷酸突变；位于北京鸭STMN1基因外显子4第48位出现了C、T两种检测结果，即为筛查到的北京鸭STMN1基因的SNP多态性，该位点是为C或T的碱基多态性。

b、北京鸭STMN1基因C＞T突变多态性的RFLP-PCR检测

当北京鸭STMN1基因外显子4第48位发生C＞T突变时，即C突变为T，利用引物扩增的STMN1基因序列cccgg也相应地变成cctgg，从而成为EcoRII的限制性内切酶识别位点，由于筛查到的碱基多态性能被EcoRII限制性内切酶识别，所以直接用EcoRII酶对目的片段进行酶切，最后进行基因分型。

3、PCR扩增产物的EcoRII酶切

(1)20μL EcoR II酶切反应体系：10μL PCR产物，10×缓冲液(含BSA)2.5～3.0μL，EcoRII(10U/μL)为1.0μL，加灭菌纯水(H₂O)至20μL；

(2)酶切消化条件：37℃恒温培养箱中消化过夜。

(3)EcoR II消化PCR产物后琼脂糖凝胶电泳分析

用2.5％的琼脂糖凝胶，100V电压电泳30min，染色检测酶切结果，用在BIO-RADGel Doc 2000凝胶成像分析系统照相分析，并判型、记录其基因型；

由于RFLP-PCR扩增的747bp片段中包含2个天然的EcoRII酶切识别位点，所以不发生突变前就有3段。当STMN1基因外显子4第48位发生C＞T突变时，PCR扩增的STMN1基因产物被限制性内切酶EcoRII识别后，除了在天然酶切位点酶切外，在扩增片段cc/tgg处也被酶切，将扩增片段切为4段；而当STMN1基因外显子4第48位没有发生突变时，则不能形成新的限制性内切酶EcoRII酶切识别位点，扩增片段只能在天然酶切位点被酶切为3个片段；

由于北京鸭为2倍体动物，所以当发生C＞T的突变时，可形成3种不同的基因型，分别为CC、CT、TT，其RFLP-PCR检测的凝胶结果图如图2所示：

其中，CC基因型为野生型，它的两条DNA链的SNP位点不能被EcoRII酶切，但是由于该扩增产物有2个天然酶切位点，所以表现为10bp、201bp和536bp 3个片段；发生突变后的突变型TT的两条链的SNP位点均能被酶切，表现为10bp、201bp、262bp和274bp 4个片段；杂合子CT的两条链中的一条含SNP位点的能够被识别，而另一条不能被识别，所以表现为10bp、201bp、262bp、274bp和536bp 5个片段；由于片段10bp太小，在琼脂糖凝胶不能观察到，片段262bp和274bp大小相差太小，在琼脂糖凝胶上不易分开，可观察为1条带，所以在琼脂糖凝胶上，CC基因型可以观察到2条带(201bp和536bp)，CT基因型可以观察到3条带(201bp、262bp+274bp和536bp)，TT基因型可以观察到2条带(201bp和262bp+274bp)。根据条带的个数和条带的大小，如图2所示的凝胶电泳检测结果能够很清楚的判定是否发生了点突变，将三种基因型区分开，从而检测其SNP多态性。

(4)不同基因型个体PCR产物的测序验证

利用ABI 377和ABI 3730测序仪对不同基因型个体PCR产物分别进行正反双向测序；同时，进行SNP位置分析，结果表明包含10bp、201bp、262bp、274bp和536bp片段的杂合子CT基因型个体其外显子4第48位的测序图的确表示为C或T，如图3所示。

c、北京鸭的STMN1基因外显子4第48位的SNP作为分子标记在不同基因型鸭群体中的应用

1、SNP位点的频率统计分析

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_A＝(2N_AA+N_Aa1+N_Aa2+......+N_Aan)/2N。式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_Aai表示群体中具有Aai基因型个体数量，al-an为等位基因A的n个不同的复等位基因；统计结果见表4。

表4北京鸭STMN1基因第4外显子48位SNP位点基因型频率和基因频率分布表

3、基因效应的关联分析

基因型数据：EcoRII识别的基因型(CC、CT和TT)

生产数据：生长性状数据(6周胴体重、胸肌率、腿肌率、腹脂率和皮脂率)

关联分析模型：

利用SPSS(17.0)软件分析基因位点、公禽、场别效应、年龄和品种效应与生长性状的相关性。先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，利用多元线性模型分析基因型效应。模型如下：

y_ijklmn＝μ+Genotype_i+S_j+B_k+F_l+Age_m+Xn+e_ijklmn

其中：y_ijklm为个体表型记录；F_l场别效应；S_j为种公禽效应；B_k：品种效应；Age_m为年龄效应；Xn为各种二级和二级以上互作效应，如：Age×Genotype，S_j×Genotype等；e_ijklmn为随机误差；运用SPSS(17.0)软件对数据进行分析，并用最小二乘法拟合线性模型，对各基因型间体尺指标进行差异显著性检验。

结果表明(见表5)：对于EcoRII可识别的外显子4第48位的SNP位点，对于6周胴体重和皮脂率，TT、CT基因型个体的数值均显著高于CC基因型个体，这说明T等位基因对6周胴体重和皮脂率是一个有利基因，TT、CT基因型可以成为一个提高胴体重和皮脂率育种速度的分子遗传标记。

表5北京鸭STMN1基因突变多态性与经济性状的关联分析

注：字母不同表示差异显著(P＜0.05)。