生产角鲨烯的微藻新菌株

摘要

本发明涉及生产角鲨烯的微藻新菌株，本发明的目的为裂殖壶菌的一种新菌株，该菌株表现出角鲨烯的高产能力，使用该菌株进行目的脂类化合物生产的方法，以及使用该菌株制备的产品和组合物。

说明书

本发明是关于特别适用于角鲨烯的生产和应用的一种微藻新菌株。 

角鲨烯是一种三萜类化合物，分子结构为三十碳五十氢的异戊二烯，其分子式为：2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22二十四碳六烯。 

这是一种所有高等生物，包括在人类身上(皮脂中可以找到)自然分泌的脂质。角鲨烯实际是胆固醇、类固醇激素和维生素D的一种生物合成的基础中间体(一种胆固醇代谢酶，角鲨烯单加氧酶，在氧化角鲨烯分子的其中一个链的同时，诱导环化作用并产生羊毛固醇，后者将转化为胆固醇和其他类固醇)。 

在工业中，角鲨烯主要用于食品、化妆品和医药等行业。 

作为食用添加，通常是被制成为角鲨烯胶囊或油制品。 

在化妆品领域，其分子可作为保湿霜里面的一种抗氧化剂，抗静电剂和润肤保湿剂，迅速渗透进入皮肤，不留下痕迹，没有油腻感，与其它油和维生素混合使用效果良好。 

在这个领域使用的时候，请注意，由于角鲨烯性质极不稳定(6个不饱和烃)，饱和形式的角鲨烷(加氢反应制得)是最佳的抗氧化剂，现在市场上售卖的也是这种，一般来说其纯度水平非常高(99％)。 

毒理学研究表明，按照目前在化妆品中使用的浓度，角鲨烯和角 鲨烷并没有毒性，对人体皮肤无刺激，不致敏。 

在制药领域，角鲨烯可以用作疫苗辅助佐剂。 

这些佐剂物质能够刺激免疫系统，增加对疫苗的反应。 

以乳液形式添加到疫苗物质里，使疫苗具有更强免疫力，自1977年以来，角鲨烯已用于流感疫苗(FLUAD【复立达】，奇龙公司[CHIRON]，预防季节性流感的疫苗)，每剂加入10毫克的角鲨烯。 

由于所有的疫苗都含有角鲨烯，其乳液呈乳白色。 

角鲨烯也用作疫苗佐剂，尤其是实验性疫苗，抗疟疾药物或针对H5N1和2009年H1N1新型病毒的抗流感疫苗，如下： 

-葛兰素史克公司所使用的佐剂系统AS03里用于对抗2009年流感大流行的Pandemrix和Arepanrix疫苗的专利成分， 

-诺华公司所使用的佐剂系统MF59里面的专利成分。 

角鲨烯也被用于添加到抗流感疫苗，通过产生记忆CD4细胞刺激人体免疫反应。 

在销售中的产品中，这是对抗季节性流感的和病毒抗原联合制成的抗流感疫苗的第一种水包油助剂。 

角鲨烯的纯度在这一应用领域至关重要。 

事实上，如果内服，角鲨烯被视为完全安全的；但是作为注射剂，则备受质疑。 

事实上，在医疗领域，对服用人群的伤害风险将会剧增，如果角 鲨烯含有杂质，因为根据其定义，这种助剂将会诱导人体对其杂质产生强烈的免疫反应。 

因此，必须获得高品质的、无杂质(杂质指极微量的金属，尤其是汞和其它有毒物质)的角鲨烯。 

文献中提出了几种制备角鲨烯的途径。 

人们常常在软骨鱼类的肝脏中发现这种化合物，如深海鲨鱼(角鲨烯因此得名)。 

因此，这成为鲨鱼被过度捕捞的原因之一，鲨鱼已经因其珍贵的鳍而成为被猎杀的对象。此后，鲨鱼的肝脏也被用于出售，以生产出“有益健康”的优质胶囊。 

但是，即使售卖的角鲨烯主要是从鲨鱼肝脏中提取，也不能完全排除卫生问题。 

事实上，鲨鱼可能被病原体感染，可能产生对人体有害的物质。此外，鲨鱼肝脏这样一个消除毒素和净化身体机能的器官，也可能含有对人体有害的毒素，例如：carchatoxin。 

这些令人忧虑的环境问题(鲨鱼的强烈严重退化)和卫生问题(鱼肝也储存着令人担忧的、对健康有害的毒素)，促使人们从植物提取角鲨烯。 

因此，从橄榄油、棕榈油、其他油类作物，或者从苋属植物、种籽、米糠、小麦胚芽中将其分离出来是有可能的。 

然而，这种方法存在一个重大缺点，角鲨烯在植物中含量极低， 大约以重量计算占比为0.1到0.7％。 

作为从鲨鱼肝脏或者植物中提取工艺的第一替代方法，往往由于需要实施大型的浓缩和净化工艺而成本高企，因此人们提出了第一种从微生物入手进行角鲨烯生产的工艺方法：天然酵母或重组酵母，尤其是啤酒酵母(Saccharomyces)类型的。 

因此，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)生产角鲨烯的能力已被熟知，但是其产出物含量仍然非常低：大概是0.041毫克/克生物量(保罗·巴塔查尔吉BHATTACHARJEE等人，2001年，《世界微生物学与生物技术杂志》，第17期，第811-816页)。 

通过遗传重组，研究人员已经将其生产性能进行了优化处理。 

因此，重组酵母生产角鲨烯具有如下优势： 

-享受和宿主细胞同等的GRAS(公认安全使用物质)地位， 

-无病原体，无传染性蛋白微粒，无毒素，和宿主细胞一样，并且 

-已经被用于疫苗领域(如这些酵母的表达载体含有乙肝抗原)。 

然而，正如第WO 2010/023551号医疗领域应用专利申请所指出的那样(生产的角鲨烯达到97％以上的纯度，可以用作疫苗佐剂)，在人们研制出超高产量的角鲨烯重组酵母以前(超过15％细胞干重)，这种第一替代方案还不能被工业化。 

然而，获取这些重组细胞需要通过分子生物学手段，实施许多重大、漫长而又复杂的代谢工程步骤，诱导产生角鲨烯的生物合成作用和抑制角鲨烯的分解代谢作用。 

的确是的，此外，正如在第WO 2010/023551号专利申请提出的那 样，角鲨烯合成的相关基因有很多：包括甲羟戊酸激酶，磷酸甲羟戊酸激酶，焦磷酸盐脱羧酶，异戊烯焦磷酸异构酶，HMGR(3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶)和角鲨烯合成酶。 

分解代谢作用后，转化为含有角鲨烯环氧化酶(ERG1)的麦角甾醇，羊毛甾醇合成酶，C14-位脱甲基酶，d14-还原酶，C4-甲基氧化酶和C4-脱羧酶(ERG26)，3-酮还原酶，C24-甲基转移酶，C8-异构酶，C5-去饱和酶，d22-脱氢酶和d24-还原酶的过程中，牵涉到为数众多的酶密码基因。 

此外，其他代谢酶也必须加以考虑：LEU2基因([测试]-异丙基苹果酸脱氢酶)，环氧化鲨烯环化酶，酵母固醇-24-甲基转移酶和麦角甾醇-5，7.24(28)-三烯酚-22-脱氢酶。 

第二替代方案鲨鱼肝脏或植物提取工艺方面，人们已经提出了从破囊壶菌目科里提取微藻的角鲨烯制备工艺方法，这种方法颇具前景(包括破囊壶菌，Aurantiochytrium和裂殖弧菌)，尤其是Schizochytrium mangrovei或裂殖弧菌。 

这些微藻在异养条件下生产出角鲨烯(暗室；提供葡萄糖作为碳源)，并且行内的微生物发酵技师很容易操作。 

因此，通过控制发酵条件，这些工艺提供容易实现的提纯步骤，使角鲨烯的品质能够满足食品、化妆品和医疗领域的需求。 

从破囊壶菌科微藻身上产出的角鲨烯不过是和其它目的脂类化合物伴生的副产物，脂类举例如二十二碳六烯酸(或者DHA)，ω3多不饱和脂肪酸。 

因此，角鲨烯通常被描述为DHA商业用油不可皂化部分的其中一 个成分(和类胡萝卜素和类固醇做比较)。 

在比较过程中，Schizochytrium mangrovei FB1的菌株生产出的DHA细胞干重大约为6.2％，角鲨烯为0.017％。 

结论是，能够自然生产角鲨烯的这些微生物，其产量是非常低的： 

-大约为0.1毫克/克生物量，破囊壶菌ACEM 6063(参见勒维斯等人《新生物技术》，2001年，第439-447页。) 

-大约0.162毫克/克生物量，Schizochytrium mangrovei FB1(参见：江等人，《农业和食品化学杂志》，2004年，第52期，页数1196至1200) 

-大约0.18毫克/克生物量，Aurantiochytrium BR-MP4-A1香港红树林隔离剂(参见：李等人，《农业和食品化学杂志》，2009年，第57期，页数4267至4272) 

为了提高产量，看来优化发酵条件是势在必行。 

在钱李等人发表在《农业和食品化学杂志》2009年，第57期，第4267-4272页的文章指出，角鲨烯是在甾醇生物合成的关键中间体，角鲨烯转化为类固醇的第一步关键步骤是加氧对角鲨烯进行环氧酶催化。 

然而，如果人们希望实现细胞内角鲨烯的蓄积，应当避免高溶氧水平。 

因此，在低溶氧水平(0-5％饱和度)条件下，培养破囊壶菌ACEM6063可以使角鲨烯累积到超过1毫克/克生物量，而溶氧水平的升高(40-60％)，角鲨烯的含量也不过只达到0.01毫克/克。 

同样，培养温度为15℃，通过破囊壶菌ACEM 6063进行角鲨烯 生产，产量可以达到1.2毫克/克，而在20℃的时候只有0.7毫克/克(参见：勒维斯等人，《新生物技术》，2001年，第3期，第439-447页)。 

在G.陈等人发表在《新生物技术》2010年，第27-4期，第382-389页的文章中，回顾了裂殖壶菌主要产自DHA，其途径为聚酮合成方法(简称：PKS)，然而角鲨烯是通过胆固醇生物合成途径合成的，这意味着生产这两种化合物的时候，破囊壶菌的营养需求是不同的。 

他们的工作目的是系统地寻找不同氮源对角鲨烯产量的影响。 

G.陈等人发现，在含有谷氨酸钠、酵母提取物和蛋白胨氮源混合物培养基中，裂殖壶菌可以快速生长，并且蓄积“高”含量的角鲨烯。 

尽管这样，所谓的“高”含量角鲨烯是相对而言。 

事实上，和基础培养基的产出值相比较，如果这个方法的设计人能够显著提高角鲨烯含量及产量，其提升比例分别为26.3％和10.1％，优化后的培养条件实际上可以提供含量为0.72毫克/克和滴定浓度为5.90毫克/升的角鲨烯。 

怀着同样的优化角鲨烯产量的目标，K.W.范等人，在《世界微生物学与生物技术杂志》2010年第26-3期第1303至1309页，使用了单加氧酶角鲨烯抑制剂(甾醇生物合成的关键酶)：特比萘芬(氢氧基氯化物)。 

行内人都了解，角鲨烯的含量和产出率和微生物培养基的培养时间相关。 

细胞培养基的培养时间越久，可以蓄积的角鲨烯就越少；实际上，培养基通过甾醇生物合成作用消耗更多角鲨烯。 

特比萘芬的作用是，防止通过固醇途径消耗角鲨烯，并刺激了角鲨烯在细胞内的蓄积，较试验组其增量达到36至40％。 

但是，在本文中使用的Aurantiochytrium mangrovei FB3菌株制得的角鲨烯产量是最高的，甚至远高于酿酒酵母(0.041毫克/克生物量)，甚至高于鲍圆酵母Torulaspora debrueckii(0.24毫克/克生物量)，即使这样，这种方法也不过是0.53毫克/克的生物量。 

因此，尽管人们所作的一切努力，这些值仍然远远低于橄榄油的参考值(大约为4.24毫克/克)，离工业规模所需要的数值差距甚远。 

为了研制出一种比现存技术更有效和更廉宜的方法，在其研究过程中，申请人找出了一种具备异常高的角鲨烯生产能力的微藻菌株，这种微藻产出的角鲨烯超过10毫克微藻/克生物量，举例说产出18毫克角鲨烯/克生物量，即使用Aurantiochytrium mangrovei FB3菌株所生产的产量的30倍。此外，除了其出色的角鲨烯生产能力以外，这种菌株还能制得其他目的脂类化合物，例如高于生物量干重15％的二十二碳六烯酸(DHA)，举例说其制成品为生物量干重的17,6％。 

这个裂殖壶菌已经于2011年4月14日于法国国家微生物保藏中心(CNCM)提交的第I-4469号菌种((裂殖壶菌ROQ425(Schizochytrium sp.ROQ425)))，以及于2009年6月2日向武汉大学(中华人民共和国武汉，邮政编码：430072)的中国典型培养物保藏中心提交的号码为：M 209118(裂殖壶菌080129(Schizochytrium sp.080129))。其特点在于ARN 18S密码基因的部分序列 

1  GAGGGTTTTA CATTGCTCTC aTTCCaATAGCAaGACGCGA AGCGCCCCGC ATTGATATTT 

61 CTCGTCACTA CCTCGTGGAG TCCACATTGGGTAATTTACG CGCCTGCTGC CTTCCTTGGA 

121  TGTGGTAGCC GTCTCTCAGG CTCCCTCTCCGGAGTCGAGC CCTAACTCCC CGTCACCCGT 

181  TATAGTCACC GTAGGCCAAT ACCCTACCGTCGACAACTGA TGGGGCAGAA ACTCAAACGA 

241  TTCATCGCTC CGAAAAGCGA TCTGCTCAATTATCATGACT CACCAAGAGA GTTGGCTTAG 

301  ACCTAATAAG TGCGGCCCTC CCCGAAAGTCGGGCCCGTAC AGCACGTATT AATTCCAGAA 

361  TTACTGCAGG TATCCGTATA AAGGAACTACCGAAGGGATT ATAACTGATA TAATGAGCCG 

421  TTCGCAGTTT CACAGTATAA TTCGCTTATACTTACACATG CATGGCTTAG TCTTTGAGA 

从上述序列，可以识别裂殖壶菌的菌株。 

因此，本发明和2011年4月14日向法国国家微生物保藏中心(CNCM)提交的裂殖壶菌的菌株有关。这个菌株在本申请书下文将被命名为“CNCM I-4469”。 

这个菌株表现出令人感兴趣的角鲨烯高产能力。实际上，应用该菌株可以从每100克生物量干重获得克重级别规模的角鲨烯。特别是，通过详细的实验方法，可以实现角鲨烯量化生产。 

因此，本发明同时也和该菌株的变种或者衍生菌株相关，所谓变种或者所谓衍生菌株具有高于或者等于1克/100克生物量干重的角鲨烯产量的特性。特别是，本发明和具有高于或者等于1克/100克生物量干重的角鲨烯产量的sch菌株，从CNCM I-4469菌株通过基因改造或者基因突变制得。基因改造可以是定向诱变和/或随机。 

本发明和某种含有CNCM I-4469菌株基因改造或者基因突变的菌 株制备方法相关，作为选项之一，和具有至少1克/100克生物量干重的角鲨烯生产能力的菌株筛分步骤相关。 

本发明和具备角鲨烯生产能力的CNCM I-4469菌株和变种菌株的培养方法相关，包括在适宜的培养基上进行该菌株的培养步骤、生物量的回收步骤。培养是在异养条件下进行。一般来说，培养步骤包括预培养步骤，该步骤使菌株成活，然后是培养步骤和真正的发酵步骤。这最后一个步骤是目的脂类化合物的生产阶段。 

这些微藻的培养条件在本领域里已经广为人知。举例说，在上述G.陈的文章中，我们发现他的方法包括以下连续的步骤： 

-在含有葡萄糖、谷氨酸钠、酵母提取物和各种微量元素的琼脂营养培养基上培养的菌株， 

-在放置在轨道式振荡器的锥形烧瓶里进行预培养，pH值6，温度为25℃，以获得成活的生物量。 

-从培养中的锥形烧瓶里接种另外一个系列，使用和预培养基同样的培养基，拿取约0.5％(v/v)的上一个步骤得到的生物量，维持温度为25℃。 

预培养阶段为时24至74小时，最好约为48个小时。培养阶段最好为60-150个小时。 

至于氮源性质，申请人发现它是可以选择的，从酵母提取物，尿素，谷氨酸钠，硫酸铵这个组合里面选择单独一项或者选择组合。同样地，可以全部或者部分使用谷氨酸钠取代尿素，或使用谷氨酸钠和硫酸铵的混合物。 

可以偏好选择酵母提取物，现有技术工艺传统上使用的碳源，可能你倾向于选择酵母提取物，传统上现有技术所实施的工艺方法，尿素+维生素混合物，例如由西格玛公司销售的BME混合物试剂(β-巯 基乙醇)，用量比例为5毫升/升。 

更佳的方法是，预培养基包含维生素B1，B6和B12. 

至于培养基pH值，如下例所述，将保持在5.5和6.5，最好是固定在pH值6。pH值的调节可以使用业内人士所了解的任何方式，例如，通过添加2N的硫酸，然后添加8N氢氧化钠。 

最后，溶氧率可以调节到20和0％之间的值，最好保持在5％作用，最初的阶段维持24至48小时，最好是36小时，然后任其下降到0％。关于氧的传输，可以使用业内人士所了解的任何方式调节使之不超过45毫摩尔/升/小时。 

本发明特别涉及CNCM I-4469菌株或者具备角鲨烯生产能力的该菌株的变种，以生产目的脂类化合物。相关的脂类混合物包括角鲨烯，特别是二十二碳六烯酸(或称DHA)。尤其是相关混合物就是角鲨烯。应该指出的是，可以从每100克干物质中生产出大于或者等于1克角鲨烯。 

本发明和具备角鲨烯生产能力的CNCM I-4469菌株和变种菌株的培养方法相关，富含目的脂类化合物的生物量回收以及，作为选项之一，目的脂类化合物的分离和/或提纯。目的脂类化合物包含角鲨烯，特别是二十二碳六烯酸(或称DHA)。尤其是，相关混合物就是角鲨烯。尤其是，可以从每100克干物质中生产出大于或者等于1克角鲨烯。 

发酵步骤后，可以使用任何业内人士已知的发酵培养基回收生物量的方法，例如，可从发酵装置提取生物量，或者简单地使用微滤浓缩或离心浓缩，连续地使用水溶剂浓缩-稀释法清洗。 

这样，本发明还与具备角鲨烯生产能力的包含CNCM I-4469菌株或该菌株变种的生物量相关。特别是与在发酵或者培养步骤后，富含目的脂类化合物的生物量关，如角鲨烯和十二碳六烯酸，相比较而言角鲨烯相关性更高。通过本文件所描述的方法可以制得角鲨烯。的确，经过发酵，生物量可以包含以重量计算17.6％的十二碳六烯酸和1.8％的角鲨烯。所谓的“富含角鲨烯”在这里的意思为，每100克干物质生物量的角鲨烯含量大于或等于每100克。 

除了生物量，本发明还涉及一种提取物或称细胞裂解液，该提取物或细胞裂解液从具备角鲨烯生产能力的、包含CNCM I-4469菌株或其变种的生物量中制得。特别是，从发酵后的生物量中制得该提取物或裂解液。这种提取物或细胞裂解液富含目的脂类化合物，如角鲨烯和十二碳六烯酸，尤其是角鲨烯。为了提取脂类而进行的细胞破碎可以通过机械作用，化学作用，酶作用。 

随后，通过数个连续的提取步骤，可以用正己烷/乙醇法从细胞裂解液中提取油。正己烷组分分离后，正己烷蒸发，原油被分离出来。 

因此，目的脂类化合物(尤其是角鲨烯)的生产方法包括生物量收获法，提取物或细胞裂解液的制备，含有目的脂类化合物尤其是角鲨烯的原油提取。 

本发明涉及一种含有目的脂类化合物的原油或成品油，从具备角鲨烯生产能力的、含有CNCM I-4469菌株或其变种的生物量中制备。 

最后，本发明还涉及目的脂类化合物的应用，如角鲨烯或二十二碳六烯酸(或称DHA)，特别是角鲨烯，角鲨烯通过本发明中应用于医疗、化妆品和食品领域产品的组成成分的制备方法任意一种工艺。因此，本发明还涉及应用于医疗、化妆品和食品领域产品的组成成分的制备方法，该方法包括目的脂类化合物的生产，如角鲨烯或二十二 碳六烯酸(或称DHA)，特别是应用医疗、化妆品和食品领域产品的组成成分的制备方法任意一种工艺生产的角鲨烯。 

本发明特别涉及具备角鲨烯生产能力的、含有CNCM I-4469菌株或其变种的一种产品或者成分，在培养或发酵该菌株后制得的一种生物量，或者该菌株的提取物或者细胞裂解液。尤其是，这个产品或这个成分是一种食品成分或一种食品或补充食品。其形态可能是液体或固体。尤其是，它包含了该菌株的一种冻干细胞、或者提取物、或细胞裂解液。该产品或该成分的形态可能为粉状，颗粒状，胶囊，或片剂形式，最好是胶囊的状态。可以作为替代方案的是，该产品或该成分为液态，包含由本方面中任意一个工艺方法制得的原油、成品油。 

为了更好的理解本发明，以下举例其性质是说明性的，而不是限定性的。 

例1：使用SCH CNCM I-4469菌株进行角鲨烯生产的研究 

为了展现SCH CNCM I-4469菌株出色的角鲨烯生产能力，我们对该菌株和文献中的参考微藻菌株进行了角鲨烯生产对照，这里所说的微藻就是Schizochytrium mangrovei(RCC 893，法国《海洋浮游植物培养库》(Roscoff Culture Collection，简称RCC)。 

预培养基和培养基

这里所说的微藻发酵分为两个连续预培养阶段，之后是培养/生产本身的阶段。 

预培养基的组成成分如下表一所示： 

表一 

  预培养阶段培养基    葡萄糖   25g   酵母提取物   2g   谷氨酸钠盐   19g   氯化钠   6g   硫酸镁   6.5g   硫酸钠   0.1g   氯化钙   0.1g   碳酸氢钠   0.1g   磷酸二氢钾   2g   浓缩液的维生素   0.6ml   微量元素浓缩液   0.6ml   去离子水qsq   0.3L

培养阶段/生产阶段的培养基组成成分如下表二所示： 

表二 

维生素浓缩液成分(单位：克/升) 

  维生素B1   45   维生素B6   45   维生素B12   0.25

微量元素浓缩液成分(单位：克/升) 

  二水氯化锰   8.6   六水氯化钴   0.2   六水硫酸镍   4.5   二水钼酸钠   0.15   七水硫酸锌   5.7   五水硫酸铜   6.5   七水硫酸亚铁   32

发酵操作

预培养阶段在使用挡板防护的2公升锥形烧瓶中进行。等其成分完全溶解后，过滤培养基。通过在培养皿抽取微藻菌落进行接种(使用10微升的柏丝接种环)。 

孵育期在25℃的温度下持续48小时，振荡速度为100转/每分钟(轨道式振动器上)。 

生物量沉淀(或黏贴在壁上)，在充分搅拌锥形烧瓶后，注意掌握抽取量为300毫升。这300毫升用于接种培养。 

对于第二个预培养阶段，使用2升的锥形烧瓶，使用挡板，温度25℃，振荡速度110转/分钟(轨道式振荡器)。初始pH值＞5.5. 

消耗等量的葡萄糖，裂殖壶菌CNCM I-4469菌株培养时间为66个小时，Schizochytrium mangrovei RCC 893为138个小时，说明裂殖壶菌CNCM I-4469具有更好的菌株生长能力。 

下表三列出裂殖壶菌CNCM I-4469菌株和Schizochytrium mangrovei RCC 893菌株的结果。 

表三 

Glc＝葡萄糖；MS＝生物量干重；Squa＝角鲨烯； 

因此，发现裂殖壶菌CNCM I-4469能够从每100克生物量干量从制得1.8克角鲨烯，这是使用这些微藻从未有过的含量。与参考菌株相比，这个含量至少高出4倍以上，培养时间减少2倍。 

此外，对从裂殖壶菌CNCM I-4469发酵后制得的生物量进行分析，观察所得，该生物量含有以重量计算41.8％的总脂肪酸，其中17.6％为二十二碳六烯酸(DHA)。 

  总脂肪酸   ％   41.8   酸，月桂酸C12:0   ％   0.1   酸，肉豆蔻酸C14:0   ％   4.8   酸，十五烷酸C15:0   ％   0.4   酸，棕榈酸C16:0   ％   10.7   酸，棕榈油酸C16:1   ％   0.2   酸，硬脂酸C18:0   ％   0.4   酸，油酸C18:1   ％   ＜0.1   酸，亚油酸简称LA C18:2   ％   0.3   酸，伽玛亚麻酸简称GLA C18:3   ％   ＜0.1   酸，阿尔法亚麻酸简称ALA C18:3   ％   ＜0.1   酸，花生酸C20:0   ％   ＜0.1   酸，十八碳四烯酸C18:4   ％   0.1   酸，巨头鲸鱼酸C20:1   ％   ＜0.03   酸，二高γ亚麻酸C20:3   ％   0.1   酸，花生四烯酸简称AA C20:4   ％   0.1   (ETE)C20:3   ％   ＜0.03   酸，山萮酸C22:0   ％   ＜0.1   酸，二十碳五烯酸简称EPA C20:5   ％   0.3   酸，木蜡酸 C24:0   ％   ＜0.1   酸，Osbond C22:5   ％   6.4   酸，神经酸C24:1   ％   ＜0.1   酸，鰶鱼酸简称DPA C22:5   ％   0.2   酸，二十二碳六烯酸简称DHA C22:6   ％   17.6

裂殖弧菌科属生物量角鲨烯量化方法

在25℃下，进行生物量玻璃珠破碎，使用氯仿/甲醇法进行低温提取。使用如下所述内部级别标准进行量化。 

使用AVANCE III 400光谱仪(布鲁克仪器公司)在400兆赫下获得光谱数据。 

生物量破碎：准确称取约200毫克的鲜生物量。添加约1-1.5厘米的玻璃珠和0.1mL甲醇。密封试管和使用涡旋振荡器进行至少5分钟的振荡。 

冷提取：添加约2毫克的磷酸三苯酯(TPP)，0.9毫升的甲醇和2毫升氯仿。密封试管和使用涡旋振荡器进行1分钟的振荡。冷藏。沉淀后(至少1小时)，小心回收上层澄明层，并转移到一个玻璃容器里，在室温下蒸发，氮气流干燥。将干物质溶于0.5毫升氘代氯仿和0.1毫升氘代甲醇，并转移到一根核磁共振试管里。 

频谱记录：进行采集，但未去掉溶剂，未施加旋转，至少15秒休息时间后，对仪器进行适当调整。光谱窗口必须至少介于-1和9ppm之间，将光谱仪的氯仿峰值校正为7.25ppm。傅立叶变换后进行频谱分析，进行相位校正和图像减法设定手动模式基准线(未进行指数运算，LB＝GB＝0)。 

信号分析：将三苯基膦(TPP)固体的值设置为100，且该固体不包含7.05和7.15ppm之间氯仿信号(计算为9个质子的三苯基膦)。纳入1.55ppm范围的角鲨烯信号(单态，计算为6个质子)。 

计算和结果表达：结果表达方法为毛质量的百分比。 

其中 

A₅  1.55ppm的角鲨烯信号范围。 

P_TPP：纳入的TPP固体质子数量：9 

W_TPP：称量出来的TPP质量，以克重计算 

M_TPP：TPP的摩尔质量，单位为克/摩尔，(M_TPP＝326克/摩尔) 

M_s：角鲨烯的摩尔质量，单位为克/摩尔(M_S＝410克/摩尔) 

PE：质量，单位为克，鲜生物量 

例2：裂殖壶菌CNCM I-4469菌株生化特征的研究。 

该菌株的生化特征(见表四)使之能够生产相关的脂类化合物，其中包括二十二碳六烯酸(或称DHA)。发酵后从制得的生物量中提取原油而实现生产。 

表四：确定相关化合物的菌株生化特征

生化特征测定方法

与甲醇进行酯交换反应后，用溶剂萃取-气相色谱法测定确定脂肪酸甲酯的组成。结果以百分比分布表示，显示为％；应用内部标准方法进行分析。 

使用配备有分流-不分流进样器(带进样口衬管)、火焰离子化检测器的气相色谱仪(VARIAN 3800)。 

预先准备内部校准约0.5毫克的十七烷酸甲基溶液(每毫升甲醇)。该十七烷酸甲基溶液用于作色谱标记。 

在6毫升试管里，预先准确称量干样品约30毫克。添加到吸管，内部校准的1毫升(第二道杆)溶液，然后2毫升3N甲醇。当时密封，在110℃的恒温干浴器内放置4小时 

冷却后，添加约0.5毫升水和0.5毫升的氯化钠饱和水，三次提取1毫升的氯仿。6毫升试管里取得氯仿气相，将其在含有硫酸钠试管里干燥。氮气流下浓缩直至约1毫升然后注入。 

每个脂肪酸(i)的百分比分布，是通过该脂肪酸的峰值比例和在气相色谱图上取得的所有峰值的表面积数值比较取得，以及含有DHA(C22：6Δ4c，7c，10c，13c，16c，19c)的月桂酸(C12:0)，但不包括十七烷酸甲酯的峰值。