一种鉴别平滑型脂多糖和粗糙型脂多糖的方法

摘要

本发明公开了一种鉴别平滑型脂多糖和粗糙型脂多糖的方法，首先合成能有效干扰小鼠mCD14基因表达的小干扰核糖核酸分子(siRNA-224.3)及阴性对照siRNA-NC，并制备成重组慢病毒；其次，将慢病毒感染小鼠巨噬细胞RAW264.7，并用嘌呤霉素筛选出阳性克隆，构建稳定细胞系siRNA-224.3、siRNA-NC；最后，应用酶联免疫吸附实验检测分别用平滑型脂多糖和粗糙型脂多糖刺激条件下表达该小干扰核糖核酸分子的小鼠单核巨噬细胞稳定细胞系细胞上清中的一氧化氮、肿瘤坏死因子α和白细胞介素6，通过比较其差异，实现鉴别平滑型脂多糖和粗糙型脂多糖。本发明的方法相比现有技术更加方便，准确性更高。

说明书

技术领域

本发明属于生物科技应用技术领域，涉及一种鉴别平滑型脂多糖和粗糙 型脂多糖的方法。

背景技术

白细胞分化抗原14(cluster of differentiation antigen，CD14)是一种存在 于单核细胞、巨噬细胞等细胞表面的分化抗原，为体内介导脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS)生物效应的重要受体之一。白细胞分化抗原14 (CD14)包括膜结合型白细胞分化抗原14(membrane bound CD14，mCD14)和 可溶性白细胞分化抗原14(soluble CD14，sCD14)两种形式：膜结合型白细胞 分化抗原14(mCD14)是分子量为55千道尔顿(KD)的糖蛋白，其C-末端借助 糖基磷酯酰肌醇(glucose phosphatidylinositol，GPI)结构锚附于细胞膜表面； 可溶性白细胞分化抗原14(sCD14)分子有49KD和55KD两种形式，缺乏糖 基磷酯酰肌醇(GPI)锚。膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)是由含有白细 胞分化抗原14(CD14)基因的单核细胞、巨噬细胞，自行转录、翻译蛋白质 多肽链，在高尔基复合体内糖化后，其羧基端再与磷酯酰肌醇 (phosphatidylinositol，PI)结合，并由磷酯酰肌醇的磷脂部分与细胞膜连接。 生理条件下，膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)主要表达于成熟的单核巨 噬细胞，微弱表达于中性粒细胞、肾小球膜细胞、乳房细胞和B细胞， mCD14介导脂多糖对这些细胞的激活作用。

内毒素是革兰氏阴性菌细胞外膜的组成部分，其主要成分为脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS)，脂多糖一旦进入体内，将诱导机体产生多种炎症 介质的反应，导致机体的严重损伤。脂多糖是一类特殊类型的磷脂,对哺乳 类动物具有广泛的生物学作用。根据化学结构，可以将脂多糖分为二大类， 即光滑型脂多糖(Smooth Form LPS，S-LPS)和粗糙型脂多糖(Rough Form  LPS，R-LPS)。这二类脂多糖在化学结构、实验室制备及生物学活性等方面 具有显著差别。建立鉴别光滑型脂多糖(S-LPS)与粗糙型脂多糖(R-LPS)的方 法，最终可以应用于临床细菌感染性疾病的诊断和治疗

在革兰氏阴性细菌引起的炎症反应过程中，脂多糖受体起着关键作用， 是脂多糖作用的重要门户。白细胞分化抗原14(CD14)被认为是脂多糖信号 转导中最重要的脂多糖受体，白细胞分化抗原14在介导脂多糖激活靶细胞 及炎症反应中起关键作用；研究表明，通过抑制白细胞分化抗原14破坏脂 多糖所激活的靶细胞炎症反应是一个可行的治疗方法。

核糖核酸干扰(RNA interference，RNAi)是指由特定双链核糖核酸(double  stranded RNA，dsRNA)引发同源信使核糖核酸(messenger RNA，mRNA)降 解的转录后基因静默机制。这类特定双链核糖核酸被裂解成小（干扰）核糖 核酸分子(siRNAs)，并能导致同源信使核糖核酸(mRNA)在核糖核酸诱导的 静默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)作用下降解。核糖核酸干 扰(RNAi，Ribonucleic acid interference)RNA是目前简单而高效地阻断哺乳 动物细胞内特异基因表达的最有效方法之一，可达到基因敲除效果，且安全 性好。但对于核糖核酸干扰(RNAi)来说，并不是所有针对靶基因信使核糖核 酸(mRNA)序列随机合成的小核糖核酸分子(siRNAs)都能引起有效的基因沉 默，干扰靶序列的选择对干扰效率的影响是至关重要的。因此，对能有效抑 制特异基因表达的小核糖核酸分子(siRNAs)的筛选是应用核糖核酸干扰 (RNAi)技术进行基因功能、基因治疗等相关研究的重要基础。

酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)的基础 是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原 或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又 保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体 表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合 物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结 合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。 加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检 物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催 化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。

对于平滑型脂多糖和粗糙型脂多糖的区别检测方法，现有技术的化 学鉴别方法如酚-水法、苯酚-氯仿-石油醚法，均存在着步骤繁琐，准确 率不够理想的不足。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴别平滑型脂多糖和粗糙型脂多糖的方法， 解决了现有技术的化学鉴别方法步骤繁琐，准确率不够理想的问题。

本发明采用的技术方案是，一种鉴别平滑型脂多糖和粗糙型脂多糖的 方法，按照以下步骤具体实施：

步骤1、根据膜结合型白细胞分化抗原14基因的序列，按照小干 扰核糖核酸分子设计的基本原则，合成一对针对膜结合型白细胞分化抗 原14的小干扰核糖核酸分子siRNA-224.3；

步骤2、将合成好的siRNA-224.3包装慢病毒载体

2.1）制备寡核苷酸：在Lentivirus-shRNA模板中的loop结构选用 TTCAAGAGA；在正义链模板的5’端添加T，与Hpa I酶切后形成的粘端互补； 在反义链模板的5’端添加AGCT，与Xho I酶切后形成的粘端互补；T4连接酶 连接而成重组载体；

2.2）对Lentivirus-shDNA模板退火，参照表1，配置退火体系：

表1 Lentivirus-shDNA模板的退火体系

  组分   体积(ul)   10倍短发夹DNA退火缓冲液   5   正义链(100uM)   5   反义链(100uM)   5   水   35   总体积   50

退火条件是：93-95°C时为5-6min；83-85°C时为5-6min；73-75°C时为 5-6min；68-70°C时为5-6min；4°C-5°C的环境中保存；将得到的退火产物稀 释50-52倍至终浓度为200-220nM，用于连接反应；

2.3）构建Lentivirus-shRNA载体，参照表2配置连接体系：

表2Lentivirus-shRNA载体的连接体系

  组分   体积(ul)   10倍T4DNA连接酶缓冲液   2   XhoI+Hpa I酶切后的慢病毒载体   1   模板(100nM)   1   T4DNA连接酶(5weissU/ul)   1

  水   15   总体积   20

在22℃环境中静置1h后，转化DH5α；

2.4）转染重组质粒以及制备病毒液

293T细胞常规培养于10%的FBS+DMEM，37℃，5%的CO₂环境条件中； 在转染前一天按3×10⁶cell/皿的密度接种293T细胞于10cm dish中，使转染时 细胞密度能达到90%-95%，每皿加9ml的10%FBS+DMEM，37℃，5%的CO₂环境中培养过夜；

2.4.1）转染前2h将6皿细胞进行换液，10%FBS+DMEM，每皿5ml；

2.4.2）取2个无菌的1.5ml的EP管，分别加入500ul的无血清DMEM，并 标记为①、②号管；

2.4.3）往①号管中加入穿梭质粒pGLV-U6-EGFP-shRNA-224共40ug，包 装质粒，PG-P1-VSVG、PG-P2-REV以及PG-P3-RRE三者共42ug，总计82ug， 将两者混匀；往②号管中加入65×6=390ul的转染试剂RNAi-mate，混匀，室 温静止5min；

2.4.4）5min后，将②号管液体缓慢的加入到①号管中，并轻轻的混匀， 室温静止20min；

2.4.5）在20min期间，将各皿293T细胞的上清液弃掉，并用预热的PBS 洗两遍，用tip头吸去剩余液体，然后每皿细胞加入5ml预热的DMEM培养基；

2.4.6）20min后，将①号管内的混合液平均分到各皿细胞中，然后放入 37℃，5%的CO₂培养箱中；

2.4.7）转染6h后，将各皿细胞上清液吸掉，加入10ml新鲜的 10%FBS+DMEM，然后放入37℃，5%的CO₂培养箱，培养72h；

2.4.8）转染72h后，将6个10cm的dish细胞上清液共60ml全部吸到两个 50ml离心管中，然后进行低速离心，离心转速1800-1850rpm，离心时间 3-3.5min；

2.4.9）低速离心后，取上清液经0.45um的过滤器过滤；

2.4.10）过滤后，取15ml病毒液到纯化管内进行高速离心，离心转速 8000-8200rpm，离心时间16-18min；

2.4.11）去除底部的废液，将剩余病毒液加入到超滤管内进行第二次高 速离心，离心转速8000-8200rpm，离心时间20-22min；离心到上清液到1ml， 即病毒纯化液1ml，分装5管，每管200ul，-80℃条件保存；

步骤3、慢病毒感染小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞，构建稳定细胞系， 具体步骤是：

3.1）感染前一天用完全培养基将0.5×10⁵个细胞/孔铺于24孔板；

3.2）移去细胞培养液，以MOI=10，加入稀释后的病毒液0.5ml，在37℃、 5%的CO₂条件下过夜；

3.3）24h后移去细胞培养液，每孔加入0.5ml的完全培养液，在37℃、 5%的CO₂条件下过夜；

3.4）RAW264.7细胞感染96h后，加入终浓度为1-1.1ug/ml的嘌呤霉素筛 选，24h后换完全培养基，根据细胞状态换液，直至单克隆形成，并在显微 镜下挑取各阳性克隆扩增培养；

步骤4、采用实时荧光定量聚合酶链式反应技术检测稳定细胞系信使核 糖核酸的表达水平；采用蛋白质印迹检测稳定细胞系蛋白表达水平，具体步 骤是：

4.1）收集细胞用于总RNA提取：吸出培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤细 胞2次，加1ml的Trizol反复吹打细胞后收集液体，设计引物采用上海生工 相应的合成物品；

根据核糖核酸提取试剂盒说明书分提取总核糖核酸；使用第一链试剂盒 合成互补脱氧核糖核酸；采用ABI-7500系统，使用荧光定量聚合酶链式反 应试剂盒，利用比较CT法来测定膜结合型白细胞分化抗原14的表达水平；

4.2）收集蛋白进行蛋白质印迹检测稳定细胞系蛋白表达水平，具体步骤 是：

洗掉培养基，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞2次，加入0.25%胰酶 -0.02%EDTA消化3min，再加入1ml的完全培养基终止消化，吹打细胞使其 从壁上脱落；在1000-1050rpm条件下离心细胞，弃上清液，磷酸盐缓冲液 重悬细胞，再次离心弃上清液后，加入一定量的IP裂解液，其中含千分之 一的蛋白酶抑制剂PMSF在冰上裂解细胞，反复吹打；在12000-12500rpm 条件下离心取上清液；利用二喹林甲酸蛋白测定试剂盒测定总蛋白浓度，将 总蛋白等量上样，在12%的分离胶的浓度下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳 完毕后进行蛋白质印迹；

步骤5、分别用S-LPS和R-LPS800ng刺激细胞系，收集细胞培养上清 液，Elisa检测细胞因子NO、TNF-α和IL-6，具体步骤如下：

5.1）将RAW264.7、siRNA-224.3细胞系和siRNA-NC细胞系用无双抗 培养基以2×10⁵个细胞/孔铺于两块12孔板，在37℃、5%的CO₂条件下过 夜；

5.2）在两块12孔板分别加入800ng的S-LPS和800ng的R-LPS，轻 轻摇匀后，在37℃、5%的CO₂条件下培养6-6.5小时，收集细胞培养上清液；

5.3）根据试剂盒说明书，检测细胞因子一氧化氮、肿瘤坏死因子α和白 细胞介素6，NO LPS组即阴性对照组为：RAW264.7、siRNA-NC、 siRNA-224.3；S-LPS刺激组：RAW264.7、siRNA-NC、siRNA-224.3分别用 S-LPS刺激；R-LPS刺激组：RAW264.7、siRNA-NC、siRNA-224.3分别用 R-LPS刺激，即成。

本发明的有益效果是，根据膜结合型白细胞分化抗原14基因的序 列，设计具有特异性的siRNA-224.3，并包装慢病毒载体，高效感染小鼠 巨噬细胞，克服了用转染试剂时的低效率，从而快速构建好稳定细胞系。 然后，应用酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) 检测分别用平滑型脂多糖和粗糙型脂多糖刺激条件下表达该小干扰核糖 核酸分子的小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)稳定细胞系细胞上清中的一 氧化氮（nitrogenmonoxide，NO）、肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor-α， TNF-α）和白细胞介素6（interleukin-6，IL-6），通过比较其差异，鉴别平 滑型脂多糖和粗糙型脂多糖。相比于现有的化学鉴别方法（酚-水法、苯 酚-氯仿-石油醚法）更为简单准确，从而为平滑型脂多糖和粗糙型脂多糖 区别研究及脂多糖的功能分析提供依据。

附图说明

图1是本发明方法中的慢病毒载体包装流程图；

图2是本发明方法稳定细胞系建立之后，通过实时荧光定量聚合酶 链式反应(real time PCR)检测转染小干扰核糖核酸分子(siRNAs)后，膜 结合型白细胞分化抗原14信使核糖核酸(mRNA)的表达水平图；

图3是本发明方法中的Western-blot检测其蛋白水平图；

图4是本发明方法中的RAW264.7、siRNA-NC稳定细胞系、 siRNA-224.3稳定细胞系分别用S-LPS和R-LPS刺激后收集细胞培养上 清，Elisa检测细胞因子NO的表达水平图；

图5是本发明方法中的RAW264.7、siRNA-NC稳定细胞系、 siRNA-224.3稳定细胞系分别用S-LPS和R-LPS刺激后收集细胞培养上 清，Elisa检测细胞因子TNF-α的表达水平图；

图6是本发明方法中的RAW264.7、siRNA-NC稳定细胞系、 siRNA-224.3稳定细胞系分别用S-LPS和R-LPS刺激后收集细胞培养上 清，Elisa检测细胞因子IL-6的表达水平图。

具体实施方式

实施例1

本发明是一种能快速鉴别平滑型脂多糖和粗糙型脂多糖的方法，按照 以下步骤具体实施：

步骤1、根据膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)基因的序列，按 照小干扰核糖核酸分子(siRNA)设计的基本原则，合成一对针对膜结合 型白细胞分化抗原14(mCD14)的小干扰核糖核酸分子(siRNA-224.3)， siRNA序列见附件中的序列表<400>1，可以选择通过上海吉玛技术有限 公司进行具体技术操作；

步骤2、将合成好的siRNA-224.3包装慢病毒载体

2.1）Oligo Design（制备寡核苷酸）：在Lentivirus-shRNA模板中的loop 结构选用了TTCAAGAGA，以避免形成终止信号；在正义链模板的5’端添加 了T，与Hpa I酶切后形成的粘端互补；在反义链模板的5’端添加了AGCT， 与Xho I酶切后形成的粘端互补；T4连接酶连接而成重组载体；

如图1，是慢病毒载体包装流程图，即将siRNA-224.3转化为shRNA 后，loop结构选用了TTCAAGAGA，在正义链模板的5’端添加了T，与Hpa I酶切后形成的粘端互补；在反义链模板的5’端添加了AGCT，与Xho I酶 切后形成的粘端互补。

2.2）对Lentivirus-shDNA模板退火，参照表1，配置退火体系：

表1Lentivirus-shDNA模板的退火体系

  组分   体积（ul）   10倍短发夹DNA退火缓冲液   5   正义链(100uM)   5   反义链(100uM)   5   水   35   总体积   50

条件是：95°C时为5min；85°C时为5min；75°C时为5min；70°C时为 5min；5°C的环境中保存；将得到的退火产物稀释50倍至终浓度为200nM， 用于连接反应；

2.3）构建Lentivirus-shRNA载体，参照表2配置连接体系：

表2Lentivirus-shRNA载体的连接体系

  组分   体积(ul)   10倍T4DNA连接酶缓冲液   2   XhoI+Hpa I酶切后的慢病毒载体   1   模板(100nM)   1   T4DNA连接酶(5weissU/ul)   1   水   15   总体积   20

在22℃环境中静置1h后，转化DH5α；

2.4）转染重组质粒以及制备病毒液

293T细胞常规培养于10%的FBS+DMEM，37℃，5%的CO₂环境条件中； 在转染前一天按3×10⁶cell/皿的密度接种293T细胞于10cm dish中，使转染时 细胞密度能达到95%，每皿加9ml的10%FBS+DMEM，37℃，5%的CO₂环境 中培养过夜；

2.4.1）转染前2h将6皿细胞进行换液，10%FBS+DMEM，每皿5ml；

2.4.2）取2个无菌的1.5ml的EP管，分别加入500ul的无血清DMEM，并 标记为①、②号管；

2.4.3）往①号管中加入穿梭质粒pGLV-U6-EGFP-shRNA-224共40ug，包 装质粒（PG-P1-VSVG、PG-P2-REV and PG-P3-RRE）共42ug，总计82ug， 将两者混匀；往②号管中加入65×6=390ul的转染试剂RNAi-mate，混匀，室 温静止5min；

2.4.4）5min后，将②号管液体缓慢的加入到①号管中，并轻轻的混匀， 室温静止20min；

2.4.5）在20min期间，将各皿293T细胞的上清液弃掉，并用预热的PBS 洗两遍，用tip头吸去剩余液体，然后每皿细胞加入5ml预热的DMEM培养基；

2.4.6）20min后，将①号管内的混合液平均分到各皿细胞中（注意要逐 滴的加入到细胞中），然后放入37℃，5%的CO₂培养箱中；

2.4.7）转染6h后，将各皿细胞上清液吸掉，加入10ml新鲜的 10%FBS+DMEM，然后放入37℃，5%的CO₂培养箱，培养72h；

2.4.8）转染72h后，将6个10cm的dish细胞上清液（共60ml）全部吸到两 个50ml离心管中，然后进行低速离心，离心转速1800rpm，离心时间3min；

2.4.9）低速离心后，取上清液经0.45um的过滤器过滤；

2.4.10）过滤后，取15ml病毒液到纯化管内进行高速离心，离心转速 8000rpm，离心时间18min；

2.4.11）去除底部的废液，将剩余病毒液加入到超滤管内进行第二次高 速离心，离心转速8000rpm，离心时间20min；离心到上清液到1ml，即病毒 纯化液1ml，分装5管，每管200ul，-80℃条件保存；

步骤3、慢病毒感染小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞，构建稳定细胞系， 具体步骤是：

3.1）感染前一天用完全培养基将0.5×10⁵个细胞/孔铺于24孔板；

3.2）移去细胞培养液，以MOI=10（infected at an MOI of 10），加入稀 释后的病毒液0.5ml，在37℃、5%的CO₂条件下过夜；

3.3）24h后移去细胞培养液，每孔加入0.5ml的完全培养液，在37℃、 5%的CO₂条件下过夜；

3.4）RAW264.7细胞感染96h后，加入终浓度为1ug/ml的嘌呤霉素（puro） 筛选，24h后换完全培养基，根据细胞状态换液，直至单克隆形成，并在显 微镜下挑取各阳性克隆扩增培养；

步骤4、采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real time PCR)技术检测稳 定细胞系信使核糖核酸(mRNA)的表达水平；采用蛋白质印迹(western blot) 检测稳定细胞系蛋白表达水平，具体步骤是：

4.1）收集细胞用于总RNA提取：吸出培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗 涤细胞2次，加1ml的Trizol反复吹打细胞后收集液体，设计引物采用上海 生工相应的合成物品；

膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)：

上游引物为：5′-AAC TCG CTC AAT CTG TCT TTCAC-3′，

下游引物为：5′-GCT CAT CTG GGC TAG GGT TC-3′；

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH)：

上游引物为：5′-TGT GTC CGT CGT GGA TCT GA-3′，

下游引物为：5′-CCT GCT TCA CCA CCT TCT TGA-3′，

根据核糖核酸提取试剂盒(PureLink TM RNA Mini Kit)说明书分提取总 核糖核酸(RNA)；使用第一链试剂盒(M-MLV first strand Kit)合成互补脱氧核 糖核酸(DNA)；采用ABI-7500系统，使用荧光定量聚合酶链式反应试剂盒 (Green qPCR SuperMix-UDG Kit)，利用比较CT法来测定 膜结合型白细胞分化抗原14的(mCD14)表达水平，结果见图2所示，表明 siRNA-224.3稳定细胞系与阴性细胞RAW264.7、siRNA-NC相比， siRNA-224.3稳定细胞系中小鼠膜结合型白细胞分化抗原14mRNA水平被 抑制95%；

4.2）收集蛋白进行蛋白质印迹(western blot)检测稳定细胞系蛋白表达水 平，具体步骤是：

洗掉培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2次，加入0.25%胰酶 -0.02%EDTA消化3min，再加入1ml的完全培养基终止消化，吹打细胞使其 从壁上脱落；在1000rpm条件下离心细胞，弃上清液，磷酸盐缓冲液(PBS)重 悬细胞，再次离心弃上清液后，加入一定量的IP裂解液（含千分之一的蛋 白酶抑制剂PMSF）在冰上裂解细胞，反复吹打；在12000rpm条件下离心 取上清液；利用二喹林甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白测定试剂盒测定总 蛋白浓度，将总蛋白等量上样，在12%的分离胶的浓度下进行聚丙烯酰胺凝 胶电泳(SDS-PAGE)，电泳完毕后进行蛋白质印迹(western blot)，

一抗为：兔抗膜结合型白细胞分化抗原14(mCD14)多克隆抗体(rabbit  polyclonal anti-mCD14，1：300倍稀释)，兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH) 单抗(GAPDH rabbit mAB，1：1000倍稀释)，

二抗为：辣根过氧化物酶标记山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)(HRP labeled  goat anti-rabbit IgG，1：3000倍稀释)。

结果见图3所示，表明siRNA-224.3稳定细胞系与阴性细胞RAW264.7、 siRNA-NC相比，siRNA-224.3稳定细胞系中小鼠膜结合型白细胞分化抗原 14蛋白水平被抑制90%；

步骤5、分别用S-LPS(E.coli 011:B4)和R-LPS（来源于沙门氏菌属） 800ng刺激细胞系，收集细胞培养上清液，Elisa检测细胞因子NO、TNF-α 和IL-6，具体步骤如下：

5.1）将RAW264.7、siRNA-224.3细胞系和siRNA-NC细胞系用无双抗 培养基以2×10⁵个细胞/孔铺于两块12孔板，在37℃、5%的CO₂条件下过 夜；

5.2）在两块12孔板分别加入800ng的S-LPS和800ng的R-LPS，轻 轻摇匀后，在37℃、5%的CO₂条件下培养6小时，收集细胞培养上清液；

5.3）根据试剂盒说明书，检测细胞因子一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子 α（TNF-α）和白细胞介素6（IL-6），结果见图4、图5、图6，横坐标为RAW264.7、 siRNA-NC、siRNA-224.3NO LPS组，S-LPS刺激组，R-LPS刺激组；纵坐 标为细胞培养上清中一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞 介素6（IL-6）的含量。NO LPS组即阴性对照组为：RAW264.7、siRNA-NC、 siRNA-224.3；S-LPS刺激组：RAW264.7、siRNA-NC、siRNA-224.3分别用 S-LPS刺激；R-LPS刺激组：RAW264.7、siRNA-NC、siRNA-224.3分别用 R-LPS刺激。其中，S-LPS组与R-LPS组中三种细胞因子都升高，但S-LPS 组中siRNA-224.3的细胞因子显著降低，R-LPS组中siRNA-224.3细胞因子 变化无差异。由此说明，CD14是与S-LPS结合，从而得到结论，本发明方 法利用siRNA-224.3细胞系能更加方便、准确地鉴别出S-LPS与R-LPS。

实施例2

根据实施例1的步骤，按照以下具体参数实施：

步骤1、根据膜结合型白细胞分化抗原14基因的序列，按照小干 扰核糖核酸分子设计的基本原则，合成一对针对膜结合型白细胞分化抗 原14的小干扰核糖核酸分子siRNA-224.3；

步骤2、将合成好的siRNA-224.3包装慢病毒载体

2.1）制备寡核苷酸：在Lentivirus-shRNA模板中的loop结构选用 TTCAAGAGA；在正义链模板的5’端添加T，与Hpa I酶切后形成的粘端互补； 在反义链模板的5’端添加AGCT，与Xho I酶切后形成的粘端互补；T4连接酶 连接而成重组载体；

2.2）对Lentivirus-shDNA模板退火，参照表1配置退火体系，

退火条件是：94°C时为5min；84°C时为6min；74°C时为6min；69°C时 为5min；4°C的环境中保存；将得到的退火产物稀释51倍至终浓度为210nM， 用于连接反应；

2.3）构建Lentivirus-shRNA载体，参照表2配置连接体系，

在22℃环境中静置1h后，转化DH5α；

2.4）转染重组质粒以及制备病毒液

293T细胞常规培养于10%的FBS+DMEM，37℃，5%的CO₂环境条件中； 在转染前一天按3×10⁶cell/皿的密度接种293T细胞于10cm dish中，使转染时 细胞密度能达到93%，每皿加9ml的10%FBS+DMEM，37℃，5%的CO₂环境 中培养过夜；

2.4.1）转染前2h将6皿细胞进行换液，10%FBS+DMEM，每皿5ml；

2.4.2）取2个无菌的1.5ml的EP管，分别加入500ul的无血清DMEM，并 标记为①、②号管；

2.4.3）往①号管中加入穿梭质粒pGLV-U6-EGFP-shRNA-224共40ug，包 装质粒，PG-P1-VSVG、PG-P2-REV以及PG-P3-RRE三者共42ug，总计82ug， 将两者混匀；往②号管中加入65×6=390ul的转染试剂RNAi-mate，混匀，室 温静止5min；

2.4.4）5min后，将②号管液体缓慢的加入到①号管中，并轻轻的混匀， 室温静止20min；

2.4.5）在20min期间，将各皿293T细胞的上清液弃掉，并用预热的PBS 洗两遍，用tip头吸去剩余液体，然后每皿细胞加入5ml预热的DMEM培养基；

2.4.6）20min后，将①号管内的混合液平均分到各皿细胞中，然后放入 37℃，5%的CO₂培养箱中；

2.4.7）转染6h后，将各皿细胞上清液吸掉，加入10ml新鲜的 10%FBS+DMEM，然后放入37℃，5%的CO₂培养箱，培养72h；

2.4.8）转染72h后，将6个10cm的dish细胞上清液共60ml全部吸到两个 50ml离心管中，然后进行低速离心，离心转速1850rpm，时间3min；

2.4.9）低速离心后，取上清液经0.45um的过滤器过滤；

2.4.10）过滤后，取15ml病毒液到纯化管内进行高速离心，离心转速 8200rpm，离心时间18min；

2.4.11）去除底部的废液，将剩余病毒液加入到超滤管内进行第二次高 速离心，离心转速8200rpm，离心时间20min；离心到上清液到1ml，即病毒 纯化液1ml，分装5管，每管200ul，-80℃条件保存；

步骤3、慢病毒感染小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞，构建稳定细胞系， 具体步骤是：

3.1）感染前一天用完全培养基将0.5×10⁵个细胞/孔铺于24孔板；

3.2）移去细胞培养液，以MOI=10，加入稀释后的病毒液0.5ml，在37℃、 5%的CO₂条件下过夜；

3.3）24h后移去细胞培养液，每孔加入0.5ml的完全培养液，在37℃、 5%的CO₂条件下过夜；

3.4）RAW264.7细胞感染96h后，加入终浓度为1.05ug/ml的嘌呤霉素筛 选，24h后换完全培养基，根据细胞状态换液，直至单克隆形成，并在显微 镜下挑取各阳性克隆扩增培养；

步骤4、采用实时荧光定量聚合酶链式反应技术检测稳定细胞系信使核 糖核酸的表达水平；采用蛋白质印迹检测稳定细胞系蛋白表达水平，具体步 骤是：

4.1）收集细胞用于总RNA提取：吸出培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤细 胞2次，加1ml的Trizol反复吹打细胞后收集液体，设计引物采用上海生工 相应的合成物品；

根据核糖核酸提取试剂盒说明书分提取总核糖核酸；使用第一链试剂盒 合成互补脱氧核糖核酸；采用ABI-7500系统，使用荧光定量聚合酶链式反 应试剂盒，利用比较CT法来测定膜结合型白细胞分化抗原14的表达水平；

4.2）收集蛋白进行蛋白质印迹检测稳定细胞系蛋白表达水平，具体步骤 是：

洗掉培养基，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞2次，加入0.25%胰酶 -0.02%EDTA消化3min，再加入1ml的完全培养基终止消化，吹打细胞使其 从壁上脱落；在1050rpm条件下离心细胞，弃上清液，磷酸盐缓冲液重悬细 胞，再次离心弃上清液后，加入一定量的IP裂解液，其中含千分之一的蛋 白酶抑制剂PMSF在冰上裂解细胞，反复吹打；在12500rpm条件下离心取 上清液；利用二喹林甲酸蛋白测定试剂盒测定总蛋白浓度，将总蛋白等量上 样，在12%的分离胶的浓度下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳完毕后进行蛋 白质印迹；

步骤5、分别用S-LPS和R-LPS800ng刺激细胞系，收集细胞培养上清 液，Elisa检测细胞因子NO、TNF-α和IL-6，具体步骤如下：

5.1）将RAW264.7、siRNA-224.3细胞系和siRNA-NC细胞系用无双抗 培养基以2×10⁵个细胞/孔铺于两块12孔板，在37℃、5%的CO₂条件下过 夜；

5.2）在两块12孔板分别加入800ng的S-LPS和800ng的R-LPS，轻 轻摇匀后，在37℃、5%的CO₂条件下培养6.5小时，收集细胞培养上清液；

5.3）根据试剂盒说明书，检测细胞因子一氧化氮、肿瘤坏死因子α和白 细胞介素6，NO LPS组即阴性对照组为：RAW264.7、siRNA-NC、 siRNA-224.3；S-LPS刺激组：RAW264.7、siRNA-NC、siRNA-224.3分别用 S-LPS刺激；R-LPS刺激组：RAW264.7、siRNA-NC、siRNA-224.3分别用 R-LPS刺激，即成。

其中，S-LPS组与R-LPS组中三种细胞因子都升高，但S-LPS组中 siRNA-224.3的细胞因子显著降低，R-LPS组中siRNA-224.3细胞因子变化 无差异。由此说明，CD14是与S-LPS结合，从而得到结论，本发明方法利 用siRNA-224.3细胞系能更加方便、准确地鉴别出S-LPS与R-LPS。

实施例3

按照实施例1的步骤，采用以下具体参数实施：

步骤1、根据膜结合型白细胞分化抗原14基因的序列，按照小干 扰核糖核酸分子设计的基本原则，合成一对针对膜结合型白细胞分化抗 原14的小干扰核糖核酸分子siRNA-224.3；

步骤2、将合成好的siRNA-224.3包装慢病毒载体

2.1）制备寡核苷酸：在Lentivirus-shRNA模板中的loop结构选用 TTCAAGAGA；在正义链模板的5’端添加T，与Hpa I酶切后形成的粘端互补； 在反义链模板的5’端添加AGCT，与Xho I酶切后形成的粘端互补；T4连接酶 连接而成重组载体；

2.2）对Lentivirus-shDNA模板退火，参照表1配置退火体系，

退火条件是：93-95°C时为5-6min；83-85°C时为5-6min；73-75°C时为 5-6min；68-70°C时为5-6min；4°C-5°C的环境中保存；将得到的退火产物稀 释50-52倍至终浓度为200-220nM，用于连接反应；

2.3）构建Lentivirus-shRNA载体，参照表2配置连接体系，

在22℃环境中静置1h后，转化DH5α；

2.4）转染重组质粒以及制备病毒液

293T细胞常规培养于10%的FBS+DMEM，37℃，5%的CO₂环境条件中； 在转染前一天按3×10⁶cell/皿的密度接种293T细胞于10cm dish中，使转染时 细胞密度能达到90%，每皿加9ml的10%FBS+DMEM，37℃，5%的CO₂环境 中培养过夜；

2.4.1）转染前2h将6皿细胞进行换液，10%FBS+DMEM，每皿5ml；

2.4.2）取2个无菌的1.5ml的EP管，分别加入500ul的无血清DMEM，并 标记为①、②号管；

2.4.3）往①号管中加入穿梭质粒pGLV-U6-EGFP-shRNA-224共40ug，包 装质粒，PG-P1-VSVG、PG-P2-REV以及PG-P3-RRE三者共42ug，总计82ug， 将两者混匀；往②号管中加入65×6=390ul的转染试剂RNAi-mate，混匀，室 温静止5min；

2.4.4）5min后，将②号管液体缓慢的加入到①号管中，并轻轻的混匀， 室温静止20min；

2.4.5）在20min期间，将各皿293T细胞的上清液弃掉，并用预热的PBS 洗两遍，用tip头吸去剩余液体，然后每皿细胞加入5ml预热的DMEM培养基；

2.4.6）20min后，将①号管内的混合液平均分到各皿细胞中，然后放入 37℃，5%的CO₂培养箱中；

2.4.7）转染6h后，将各皿细胞上清液吸掉，加入10ml新鲜的 10%FBS+DMEM，然后放入37℃，5%的CO₂培养箱，培养72h；

2.4.8）转染72h后，将6个10cm的dish细胞上清液共60ml全部吸到两个 50ml离心管中，然后进行低速离心，离心转速1840rpm，离心时间3min；

2.4.9）低速离心后，取上清液经0.45um的过滤器过滤；

2.4.10）过滤后，取15ml病毒液到纯化管内进行高速离心，离心转速 8100rpm，离心时间17min；

2.4.11）去除底部的废液，将剩余病毒液加入到超滤管内进行第二次高 速离心，离心转速8100rpm，离心时间21min；离心到上清液到1ml，即病毒 纯化液1ml，分装5管，每管200ul，-80℃条件保存；

步骤3、慢病毒感染小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞，构建稳定细胞系， 具体步骤是：

3.1）感染前一天用完全培养基将0.5×10⁵个细胞/孔铺于24孔板；

3.2）移去细胞培养液，以MOI=10，加入稀释后的病毒液0.5ml，在37℃、 5%的CO₂条件下过夜；

3.3）24h后移去细胞培养液，每孔加入0.5ml的完全培养液，在37℃、 5%的CO₂条件下过夜；

3.4）RAW264.7细胞感染96h后，加入终浓度为1.1ug/ml的嘌呤霉素筛选， 24h后换完全培养基，根据细胞状态换液，直至单克隆形成，并在显微镜下 挑取各阳性克隆扩增培养；

步骤4、采用实时荧光定量聚合酶链式反应技术检测稳定细胞系信使核 糖核酸的表达水平；采用蛋白质印迹检测稳定细胞系蛋白表达水平，具体步 骤是：

4.1）收集细胞用于总RNA提取：吸出培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤细 胞2次，加1ml的Trizol反复吹打细胞后收集液体，设计引物采用上海生工 相应的合成物品；

根据核糖核酸提取试剂盒说明书分提取总核糖核酸；使用第一链试剂盒 合成互补脱氧核糖核酸；采用ABI-7500系统，使用荧光定量聚合酶链式反 应试剂盒，利用比较CT法来测定膜结合型白细胞分化抗原14的表达水平；

4.2）收集蛋白进行蛋白质印迹检测稳定细胞系蛋白表达水平，具体步骤 是：

洗掉培养基，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞2次，加入0.25%胰酶 -0.02%EDTA消化3min，再加入1ml的完全培养基终止消化，吹打细胞使其 从壁上脱落；在1030rpm条件下离心细胞，弃上清液，磷酸盐缓冲液重悬细 胞，再次离心弃上清液后，加入一定量的IP裂解液，其中含千分之一的蛋 白酶抑制剂PMSF在冰上裂解细胞，反复吹打；在12200rpm条件下离心取 上清液；利用二喹林甲酸蛋白测定试剂盒测定总蛋白浓度，将总蛋白等量上 样，在12%的分离胶的浓度下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳完毕后进行蛋 白质印迹；

步骤5、分别用S-LPS和R-LPS800ng刺激细胞系，收集细胞培养上清 液，Elisa检测细胞因子NO、TNF-α和IL-6，具体步骤如下：

5.1）将RAW264.7、siRNA-224.3细胞系和siRNA-NC细胞系用无双抗 培养基以2×10⁵个细胞/孔铺于两块12孔板，在37℃、5%的CO₂条件下过 夜；

5.2）在两块12孔板分别加入800ng的S-LPS和800ng的R-LPS，轻 轻摇匀后，在37℃、5%的CO₂条件下培养6.25小时，收集细胞培养上清液；

5.3）根据试剂盒说明书，检测细胞因子一氧化氮、肿瘤坏死因子α和白 细胞介素6，NO LPS组即阴性对照组为：RAW264.7、siRNA-NC、 siRNA-224.3；S-LPS刺激组：RAW264.7、siRNA-NC、siRNA-224.3分别用 S-LPS刺激；R-LPS刺激组：RAW264.7、siRNA-NC、siRNA-224.3分别用 R-LPS刺激，即成。

其中，S-LPS组与R-LPS组中三种细胞因子都升高，但S-LPS组中 siRNA-224.3的细胞因子显著降低，R-LPS组中siRNA-224.3细胞因子变化 无差异。由此说明，CD14是与S-LPS结合，从而得到结论，本发明方法利 用siRNA-224.3细胞系能更加方便、准确地鉴别出S-LPS与R-LPS。

综上所述，本发明鉴别平滑型脂多糖和粗糙型脂多糖的方法，首先，合 成能有效干扰小鼠mCD14基因表达的小干扰核糖核酸分子(siRNA-224.3) 及阴性对照siRNA-NC，并制备成重组慢病毒；其次，将慢病毒感染小鼠巨 噬细胞RAW264.7，并用嘌呤霉素筛选出阳性克隆，构建稳定细胞系 siRNA-224.3、siRNA-NC；最后，应用酶联免疫吸附实验（enzyme linked  immunosorbent assay，ELISA)检测分别用平滑型脂多糖和粗糙型脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS)刺激条件下表达该小干扰核糖核酸分子的小鼠单核 巨噬细胞(RAW264.7)稳定细胞系细胞上清中的一氧化氮 （nitrogenmonoxide，NO）、肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α） 和白细胞介素6（interleukin-6，IL-6），通过比较其差异，实现鉴别平滑型脂 多糖和粗糙型脂多糖，相比现有方法，更加方便、准确。

附录

计算机可读基因序列表1

                                                      

<110>王凤阳

<120>抑制小鼠膜结合型白细胞分化抗原14基因表达的小核糖核酸分子

<160>1

<210>1

<211>21

<212>RNA

<213>小鼠

<400>1

gggcaguuca cugauauuatt 21