一种提高当归多糖免疫增强活性的硒化修饰方法

摘要

本发明为一种提高当归多糖免疫增强活性的硒化修饰方法，属于中药多糖的结构改造技术领域。提取、纯化当归多糖，用硝酸-亚硒酸钠法进行硒化修饰，以产物的增强免疫活性为指标，用L

说明书

一、技术领域

本发明一种当归多糖的硒化修饰方法，属于中药多糖的结构改造技术领域。

二、背景技术

多糖广泛存在于植物、微生物、藻类和动物体内，是构成生命的四大基本物质之 一。随着化学和生物学的快速发展和分离技术的提高，多糖的生物学功能，特别是作 为生命物质参与生命的全部时间和空间功能，突破了多糖作为支持组织和能量来源的 传统观念，发现其具有更广泛的生物学功效，如增强免疫、抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗 病毒、抗氧化、抗突变、抗衰老、降血糖、降血脂等，而且具有毒性小、安全性高等 优点。特别是多糖具有免疫增强、抗病毒等功能使得多糖物质成为人类及动植物医疗、 保健、病虫害防治领域的重要成员，也是食品功能化学关注的焦点。近年来，多糖研 究一直是国际前沿课题。

研究证实，多糖的活性直接或间接地受到其结构的制约。影响多糖生物学活性的 结构因素包括多糖的主链性质、支链性质和分子的高级结构，主链的糖单元组成和糖 苷键类型直接决定多糖的活性，支链的类型、聚合度和在糖链上的分布及其取代度决 定了多糖活性的大小，多糖分子的高级结构如链的柔韧性和空间构像与多糖的活性紧 密相关。因此，可根据需要选择合适的分子修饰方法对多糖进行结构改造。利用糖残 基上的羟基、羧基、氨基等基团进行化学修饰以引入新的基团，增强多糖的活性或使 多糖产生新的活性。

硒是生命必需的微量元素，是谷胱甘肽过氧化物酶的主要活性成分，可以直接或 间接地清除体内氧自由基，抑制脂氧化或过氧化，阻断活性氧和自由基的致病作用， 保护细胞免遭过氧化物的损伤，维护细胞膜的稳定性，对动物的生长、繁殖、免疫、 抗感染、抗应激等方面起着重要的作用，但是我国约72％的地区属于低硒或缺硒地区， 饲料和牧草硒含量小于0.05mg/kg，不能满足动物的正常生理需要，补硒成为一种必 要措施。硒的存在形式有无机硒和有机硒两种，常见的无机硒如亚硒酸钠和硒酸钠， 有机硒主要是硒蛋白和硒多糖。硒多糖是一种多糖有机硒化合物，具备了硒和多糖两 者的活性，而且其生物活性普遍高于多糖和硒。补无机硒具有蓄积性毒性和致突变作 用，使用时剂量难以控制；而有机硒的毒性低、副作用小，不但能够更好地发挥硒的 作用，而且在促进生长和激发免疫反应上比无机硒显著，更易于为机体吸收和利用。 然而天然硒多糖一般存在于植物或微生物中，含量较低，即使在高硒地区的植物或微 生物中，硒多糖中的硒含量也相对较低。除了通过一些富硒手段(如人工协迫富硒栽 培、富硒酵母培养等)使生物体中硒多糖的硒含量增加外，通过硒化修饰的方法获取 硒多糖是重要手段。

当归为伞形科植物当归Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根，其性温味甘、 辛，归肝、心、脾经，具有补血养血、活血止痛、润燥通便等功效，主治血虚劳伤、 血瘀疼痛、跌打损伤、痈肿疮疡、肠燥便秘、胎产诸病。现代药理学研究证实，当归 多糖是当归的主要活性成分，具有增强免疫、抗病毒、降血糖、抗肿瘤、抗氧化等作 用。本发明首次对当归多糖进行硒化修饰，建立了当归多糖的硒化修饰方法，基于产 物的增强免疫活性优化了修饰条件，发现硒化修饰能显著提高当归多糖的增强免疫活 性。

三、发明内容

技术问题本发明针对中药多糖生物活性低的问题，提供一种通过当归多糖免疫 增强活性的硒化修饰方法，达到显著提高当归多糖的增强免疫活性的目的。

技术方案

一种提高当归多糖免疫增强活性的硒化修饰方法，包括：提取、纯化当归多糖， 用硝酸-亚硒酸钠法对当归多糖进行硒化修饰，其特征在于，基于产物的增强免疫活性 比较，确定最佳修饰条件为亚硒酸钠用量200mg(500mg当归多糖)，反应温度70℃， 反应时间6h；并筛选出一种活性最好的硒化当归多糖产品。

有益效果

1.建立了当归多糖的硒化修饰方法，通过正交实验优化了当归多糖的硒化修饰条 件。

2.证明硒化修饰能够显著提高当归多糖的增强免疫活性，并筛选出一种增强免疫 活性最好的硒化当归多糖。

与现有技术相比，本发明优点如下：

1.当归多糖的硒化修饰国内外未见报道，本发明提供了一种提高当归多糖免疫增 强活性的硒化修饰方法及其优化的修饰条件，填补了国内外研究的空白。

2.通过本发明的实施，证明硒化修饰能够显著提高当归多糖的增强免疫活性，并 筛选出一种活性最好的硒化当归多糖，为研制新型免疫增强剂提供了材料和示范。

四、具体实施方式

1.当归多糖的提取

用水煎-醇沉法。取当归饮片1000g，粉碎成0.3～1cm³的小块，加95％乙醇2000mL 浸泡12h，80℃水浴回流2次，每次1h，药物晾12h，加20倍量水煎煮2次，每 次30min，合并滤液，浓缩至1000mL，2500rpm离心20min，弃去沉淀，加95％ 乙醇使醇含量达90％，4℃静置12h，回收乙醇，离心，沉淀60℃真空干燥，得到 粗的当归多糖。

2.当归多糖的纯化

将粗当归多糖用Sevage法去蛋白，真空干燥，加蒸馏水溶解成50mg·mL^-1的溶 液，上Sephadex G-200(2cm×100cm)柱，用蒸馏水洗脱，流速12mL·h^-1，自动收 集器收集洗脱液，每管4mL，苯酚-硫酸法检测各管是否含糖，绘制洗脱曲线(得到 1个峰)。合并含糖管洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，得到纯化的当归多糖(CAP)，用 苯酚-硫酸法测定糖含量为92.7％。

3.当归多糖的硒化修饰

用硝酸-亚硒酸钠法。

(1)修饰条件设计由于亚硒酸钠用量、反应温度、反应时间是影响多糖硒化修 饰的主要因素，在预实验的基础上，以亚硒酸钠用量(每500mg多糖)(A)、反应温 度(B)和反应时间(C)为因素，按3因素3水平的L₉(3⁴)正交试验设计9种修饰条 件(表1)。

表1L₉(3⁴)正交试验设计因素水平表

(2)修饰操作取当归多糖500mg9份，分别缓慢加入到装有50mL0.5％HNO₃的三颈瓶中，边加边搅拌至完全溶解。按表1设计的亚硒酸钠用量、反应温度和反应 时间滴加亚硒酸钠溶液搅拌反应，反应结束后冷却至室温，用无水碳酸钠调节pH至 5～6，离心，上清溶液装入透析袋，流水透析，每隔6小时抽样检测是否含亚硒酸钠， 至无亚硒酸钠残留时停止透析。透析液减压浓缩，冷冻干燥，分别得到9个硒化当归 多糖(selenizing CA P，sCAP)，依次标记为sCAP₁～sCAP₉。分别计算各硒化当归多糖 的得率、用原子荧光光谱法测定硒含量、用苯酚-硫酸法测定糖含量，用溴化钾压片法 测定红外光谱。

正交试验结果表明，sCAP₉的得率最高，为42.76％，其次是sCAP₆、sCAP₈和sCAP₂； sCAP₂硒含量最高，为12.98％，其次是sCAP₃、sCAP₄和sCAP₆；sCAP₈的糖含量最 高，为63.2％，其次是sCAP₆、sCAP₂和sCAP₇(表2)。

表2L₉(3⁴)正交试验结果

红外光谱测定结果显示，在CAP的红外光谱中，出现一些糖的特征性振动峰： 在3385cm^-1有1强而宽的吸收峰，为O-H键的伸缩振动；在1620cm^-1处有1吸收峰， 为乙酰氨基C＝O的伸缩振动；在1400～1000cm^-1处有1吸收峰，为C-H、C-O和C-C 振动吸收。sCAP的红外光谱图中，除了糖的特征吸收峰外，在668.54cm-¹处有1吸 收峰，这与硒酸酯的振动模式(Se-O-C，600～700cm^-1)吻合，提示sCAP存在硒酸 酯键，硒化修饰成功。

4.硒化当归多糖的增强免疫活性的比较

用MTT法。首先测定9个sCAP和未修饰的CAP对鸡外周血淋巴细胞的安全浓 度，然后比较它们对鸡外周血淋巴细胞增殖的影响。

(1)硒化当归多糖对淋巴细胞的安全浓度

将9个sCAPs分别用RPMI-1640培养液自100μg·mL^-1稀释至0.097μg·mL^-1、CAP 自500μg·mL^-1稀释至0.463μg·mL^-1共11个浓度。取成年鸡心脏无菌采血，肝素抗凝， 用Hank’s液稀释1倍，小心加在淋巴细胞分离液上层，2000rpm离心20min，吸取 中间云雾状白细胞层，用Hank′s液洗2遍，1500rpm离心15min，活细胞计数大于 90％后，用RPMI-1640培养液调整细胞浓度为2.5×10⁶个·mL^-1，接种到96孔细胞培 养板，每孔100μL，再加入各浓度的多糖，每孔100μl，每个浓度重复4孔，39.5℃、 5％CO₂培养44h，每孔加入MTT30μL，继续培养4h，每孔加裂解液DMSO100μL， 将细胞板置于微量震荡器上震荡5min使沉淀完全溶解，在酶联免疫仪上检测570nm 处的吸光度(A₅₇₀值)。选择A₅₇₀值不显著低于细胞对照组的多糖最大浓度作为该多糖 的最大安全浓度。测得各多糖的最大安全浓度在1.563～125μg·mL^-1，为了便于同水 平比较，将10个多糖的最大安全浓度统一设为1.563μg·mL^-1。

(2)硒化当归多糖对淋巴细胞增殖的影响

将9个sCAPs和未修饰的CAP分别用RPMI-1640自1.563μg·mL^-1倍比稀释至 0.098μg·mL^-1共5个浓度。同上法制备淋巴细胞，调整细胞浓度为2.5×10⁶个·mL^-1， 分成2份，1份加入PHA溶液(终浓度为10μg·mL^-1)，分别接种到96孔细胞培养板， 每孔100μL，然后每孔加入各浓度多糖100μL，每个样品重复4孔，另设细胞对照组 (CC，仅加细胞培养液)和PHA对照组(加细胞培养液和PHA)，同法测定细胞A₅₇₀值，作为淋巴细胞增殖的指标；同时按下式计算淋巴细胞增殖率，(为多糖5个浓度的平均值或对照组4个孔的 平均值)，比较各多糖的作用强度。结果如下：

(3)多糖单独刺激时淋巴细胞增殖的变化

sCAP₁～sCAP₄、sCAP₆和sCAP₈组在1.563～0.098μg·mL^-1、sCAP₅组在0.781～ 0.098μg·mL^-1、sCAP₇组在0.391μg·mL^-1和0.098μg·mL^-1、sCAP₉组在1.563～0.391 μg·mL^-1和0.098μg·mL^-1、CAP组在0.781～0.391μg·mL^-1的A₅₇₀值均显著大于细胞对 照组(P＜0.05)(表3)。说明它们在这些浓度单独能显著促进淋巴细胞增殖。

表3多糖单独刺激时各组淋巴细胞增殖的变化(A₅₇₀值)

淋巴细胞增值率值：sCAP₂组的淋巴细胞增殖率最高(29.90％)，其次为sCAP₆(24.61％)、sCAP₈(22.88％)组，这3组均极显著大于未修饰的CAP组(P＜0.01)； sCAP₄(17.88％)组大于未修饰的CAP组(P＞0.05)，说明它们促进淋巴细胞增殖的 作用强于未修饰的CAP，sCAP₂的作用最强。

(4)多糖协同PHA刺激时淋巴细胞增殖的变化

sCAP₂、sCAP₆～sCAP₉和CAP组在1.563～0.098μg·mL^-1、sCAP₁组在0.195～0.098 μg·mL^-1、sCAP₃组在1.563～0.195μg·mL^-1、sCAP₄组在0.781～0.098μg·mL^-1、sCAP₅组在0.195～0.098μg·mL^-1和1.563μg·mL^-1的A₅₇₀值显著大于PHA对照组(P＜0.05) (表4)，说明它们在这些浓度能协同PHA显著促进淋巴细胞增殖。

表3多糖协同PHA刺激时各组淋巴细胞增殖的变化(A₅₇₀值)

淋巴细胞增值率值：sCAP₂组的增殖率最高(16.84％)，显著大于未修饰的CAP 组(P＜0.05)；其次为sCAP₈(15.39％)、sCAP₆(14.22％)、sCAP₇(13.66％)和sCAP₃(11.61％)组，均大于未修饰的CAP组(P＞0.05)。说明它们在这些浓度协同PHA 促进淋巴细胞增殖的作用强于未修饰的当归多糖，sCAP₂的作用最强。

以上结果表明，硒化修饰能显著提高当归多糖的增强免疫活性，sCAP₂的作用最 强，可以作为新型免疫增强剂的组分药，其修饰条件可以作为当归多糖硒化修饰的最 佳条件，即亚硒酸钠用量200mg(500mg当归多糖)，反应温度70℃，反应时间6h。