成人肾母细胞瘤HANB细胞株及其培养方法和应用

摘要

一种成人肾母细胞瘤HANB细胞株，保藏编号为CCTCC NO：C201133；培养方法步骤为：将低分化间变型肾母细胞瘤患者离体的腹水培养传代、冻存、复苏；细胞生长速度快、数量多、质量均一，细胞培养方法简单；通过对该细胞株的细胞形态、蛋白结构、染色体和致瘤率等生物学特征进行评价，证实该细胞株保留了原肿瘤的生物学特性；成人肾母细胞瘤HANB细胞株在建立肾母细胞瘤模型中的用途，为研究肾母细胞瘤的发生、转移机理和临床治疗提供了研究模型。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种成人肾母细胞瘤细胞株及其培养方 法。

背景技术

肾母细胞瘤(Wilms’tumor or Nephroblastoma)又称韦尔姆斯瘤，90％发生 于6岁以前的儿童，其发病率在小儿腹部肿瘤中占首位，是常见的腹部实质性恶性 肿瘤。它起源于原始肾母组织，可形成胚胎性的结构，成人发病较罕见，并且对放 疗、化疗均不敏感，恶性程度高，易发生远处转移，往往预后不佳，因此研究成人 型肾母细胞瘤具有重要的临床意义。而目前无肾母细胞瘤永生化细胞株，为其体外 治疗实验研究、药物敏感性研究以及发生机制的研究带来了困难。

因此，获得永生化、质量均一、生物学特征保留了原肿瘤的生物学特性的肾母 细胞瘤细胞株是实现临床治疗相关研究的基础和关键。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是提供一种具有体内肿瘤组织病理学特点、恶 性程度高、动物致瘤率高、生长迅速的成人肾母细胞瘤HANB细胞株。

本发明所要解决的另外一个技术问题为成人肾母细胞瘤HANB细胞株提供一种 培养方法。

本发明所要解决的还有一个技术问题为成人肾母细胞瘤HANB细胞株提供一种 新用途。

解决上述技术问题所采用的技术方案是：成人肾母细胞瘤HANB细胞株，已于 2011年5月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201133。

上述的成人肾母细胞瘤HANB细胞株的培养方法步骤如下：

1、培养传代

将低分化间变型肾母细胞瘤患者术后离体的腹水离心，沉淀用1640培养液洗 涤，得到原代细胞，1640培养液由1640培养基配制成，1640培养基为市场上销售的 商品，由美国Life Tech公司生产，北京冬歌生物科技有限公司销售；在超净工作 台上，将原代细胞置于培养瓶中，用含有质量分数为5％～20％新生小牛血清的1640 培养液悬浮，在37℃、CO₂体积浓度为5％、95％湿度的细胞培养箱中培养，每隔24小 时换含有质量分数为5％～15％新生小牛血清的1640培养液一次，培养至细胞生长至 平台期，完成细胞的第一次传代培养，将生长至平台期的细胞进行传代，其方法如 下：

用质量分数为0.22％～0.28％的胰蛋白酶水溶液进行消化，吸弃胰蛋白酶水溶 液，用含有质量分数为1％～5％新生小牛血清的1640培养液吹打瓶壁，悬浮细胞，将 悬浮液移至离心管中800转/分钟离心，获取细胞沉淀，用第一次传代培养方法和条 件继续在细胞培养箱中进行分瓶培养，待细胞生长至瓶壁面积的75％，用传代的方 法收集细胞，细胞团用二甲基亚砜细胞冻存液吹打开，得保藏编号为CCTCC NO： C201133的成人肾母细胞瘤HANB细胞株。

上述的1640培养液的制备方法为：10g 1640培养基、5.0g HEPES、3.7g NaHCO₃、 3g L-谷氨酰胺溶于1L去离子水中，溶解后用0.22μm微孔滤器过滤，除菌分装，4℃ 冷藏。

2、冻存

将培养传代步骤1用传代的方法收集细胞，细胞团用二甲基亚砜细胞冻存液吹 打开，装入冻存管中置于-20℃冰箱冻存2～6小时，取出冻存管，置于-80℃冰箱冻 存2～12小时，取出冻存管，置于-120℃以下的液氮罐中保存。

上述的二甲基亚砜细胞冻存液由10mL的二甲基亚砜与90mL的新生牛血清混合 制成。

3、复苏

将冻存步骤2液氮中的细胞在40℃～42℃水浴中融化，将细胞悬液移至离心管 中800转/分钟离心，细胞沉淀移至细胞培养瓶中，用传代培养方法和条件继续进行 培养，培养液采用5％～15％新生小牛血清的1640培养液。

在成人肾母细胞瘤HANB细胞株的培养方法的培养传代步骤1中，在超净工作台 上，将原代细胞置于培养瓶中，用最佳含有质量分数为20％新生小牛血清的1640培 养液悬浮，在37℃、CO₂体积浓度为5％、95％湿度的细胞培养箱中培养，每隔24小时 换最佳含有质量分数为10％新生小牛血清的1640培养液一次，培养至细胞生长至平 台期，完成细胞的第一次传代培养，将生长至平台期的细胞进行传代。在进行传代 步骤中，用最佳质量分数为0.25％的胰蛋白酶水溶液进行消化，吸弃胰蛋白酶水溶 液，用最佳含有质量分数为5％新生小牛血清的1640培养液吹打瓶壁，悬浮细胞，将 悬浮液移至离心管中800转/分钟离心，获取细胞沉淀，用第一次传代培养方法和条 件继续在细胞培养箱中进行分瓶培养，待细胞长至瓶壁面积的75％，用传代的方法 收集细胞，细胞团用二甲基亚砜细胞冻存液吹打开，得保藏编号为CCTCC NO：C201133 的成人肾母细胞瘤HANB细胞株。在复苏步骤3中，将冻存步骤2液氮中的细胞在 40℃～42℃水浴中融化，将细胞悬液移至离心管中800转/分钟离心，细胞沉淀移至 细胞培养瓶中，用传代培养方法和条件继续进行培养，培养液最佳用10％新生小牛 血清的1640培养液。

上述培养方法培养的成人肾母细胞瘤HANB细胞株在建立肾母细胞瘤模型中的 用途。其使用方法如下：

将体外培养的每代成人肾母细胞瘤HANB细胞株离心收集细胞，用0.01mol/L的 磷酸盐缓冲液制成细胞悬液，合计细胞数为10⁶，每一代分别接种裸鼠、计量为每只 1mL，连续观察2周，建立肾母细胞瘤动物模型，可用于肾母细胞瘤细胞的发展、转 移机理的研究和放化疗药物临床治疗的疗效评价。

本发明的成人肾母细胞瘤HANB细胞株生长迅速、培养简单，通过对该细胞株 的细胞形态、蛋白结构、染色体和致瘤率等生物学特征进行评价，证实该细胞株基 本保留了原肿瘤的生物学特性，是肾母细胞瘤基础及临床研究的良好模型，为研究 肾母细胞瘤的发生、转移机理和临床治疗提供了研究模型。

附图说明

图1是实施例1培养的成人肾母细胞瘤HANB细胞株在光学显微镜下放大40倍 的照片。

图2是实施例1培养的成人肾母细胞瘤HANB细胞株在光学显微镜下放大200倍 的照片。

图3是实施例1培养的成人肾母细胞瘤HANB细胞株的透射电镜照片。

图4是实施例1培养的成人肾母细胞瘤HANB细胞株的生长曲线。

图5是实施例1培养的成人肾母细胞瘤HANB细胞株的生长周期图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施 例。

以下实施例以及实验中所涉及到的溶液的配制方法为：

1640培养液：10g 1640培养基、5.0g HEPES、3.7g NaHCO₃、3g L-谷氨酰胺溶 于1L去离子水中，溶解后用0.22μm微孔滤器过滤，除菌分装，4℃冷藏。

含有质量分数为1％新生小牛血清的1640培养液：1640培养液与新生牛血清按体 积比为9.9∶0.1混合。

含有质量分数为5％新生小牛血清的1640培养液：1640培养液与新生牛血清按体 积比为9.5∶0.5混合。

含有质量分数为10％新生小牛血清的1640培养液：1640培养液与新生牛血清按 体积比为9∶1混合。

含有质量分数为20％新生小牛血清的1640培养液：1640培养液与新生牛血清按 体积比为8∶2混合。

消化酶：0.25g胰蛋白酶粉溶于100ml去离子水中，配制成质量分数为0.25％的 胰蛋白酶水溶液，过滤消毒，4℃保存。

0.01M磷酸盐缓冲液：8.0g NaCl、0.2g KCl、1.56g Na₂HPO₄·12H₂O、0.2g KH₂PO₄溶于1L蒸馏水中，pH值为7.4，高压灭菌后4℃保存。

二甲基亚砜细胞冻存液：10mL二甲基亚砜与90mL新生牛血清混合，4℃保存。

实施例1

成人肾母细胞瘤HANB细胞株，保藏编号为CCTCC NO：C201133，其培养方法 如下：

1、培养传代

将低分化间变型肾母细胞瘤患者术后离体的腹水1000转/分钟离心10分钟，弃 去上层清液，沉淀用1640培养液洗涤，得到原代细胞，1640培养液由1640培养基配 制成，1640培养基为市场上销售的商品，由美国Life Tech公司生产，北京冬歌生 物科技有限公司销售；1640培养液的配制方法为：10g 1640培养基、5.0g HEPES、 3.7g NaHCO₃、3g L-谷氨酰胺溶于1L去离子水中，溶解后用0.22μm微孔滤器过滤， 除菌分装，4℃冷藏。在超净工作台上，将原代细胞置于细胞培养瓶中，用20％新生 小牛血清的1640培养液悬浮，在37℃、CO₂体积浓度为5％、湿度为95％环境中培养， 每隔24小时换新鲜的10％新生小牛血清的1640培养液一次，培养至细胞生长至平台 期，完成细胞的第一次传代培养，将生长至平台期的细胞进行传代，其方法如下：

用质量分数为0.25％的胰蛋白酶水溶液进行消化，吸弃胰蛋白酶水溶液，用含 有质量分数为3％新生小牛血清的1640培养液吹打瓶壁，悬浮细胞，将悬浮液移至离 心管中800转/分钟离心，获取细胞沉淀，用第一次传代培养方法和条件继续在细胞 培养箱中进行分3个瓶培养，待细胞生长至瓶壁面积的75％，用传代的方法收集细胞， 细胞团用二甲基亚砜细胞冻存液吹打开，得保藏编号为CCTCC NO：C201133的成人 肾母细胞瘤HANB细胞株。

2、冻存

将培养传代步骤1用传代的方法收集细胞，细胞团用二甲基亚砜细胞冻存液吹 打开，装入冻存管中置于-20℃冰箱冻存2～6小时，取出冻存管，置于-80℃冰箱冻 存2～12小时，取出冻存管，置于-120℃以下的液氮罐中保存。

上述的二甲基亚砜细胞冻存液由10mL的二甲基亚砜与90mL的新生牛血清混合 制成；

3、复苏

将冻存步骤2液氮中的细胞在40℃～42℃水浴中融化，细胞悬液移至离心管中 800转/分钟离心，细胞沉淀移至细胞培养瓶中，用传代培养方法和条件继续进行培 养，培养液采用10％新生小牛血清的1640培养液。

实施例2

成人肾母细胞瘤HANB细胞株，保藏编号为CCTCC NO：C201133，其培养方法 如下：

在成人肾母细胞瘤HANB细胞株的培养方法的培养传代步骤1中，在超净工作台 上，将原代细胞置于培养瓶中，用含有质量分数为5％新生小牛血清的1640培养液悬 浮，在37℃、CO₂体积浓度为5％、95％湿度的细胞培养箱中培养，每隔24小时换含有 质量分数为5％新生小牛血清的1640培养液一次，培养至细胞生长至平台期，完成细 胞的第一次传代培养，将生长至平台期的细胞进行传代；在进行传代步骤中，用质 量分数为0.22％的胰蛋白酶水溶液进行消化，吸弃胰蛋白酶水溶液，用含有质量分 数为1％新生小牛血清的1640培养液吹打瓶壁，悬浮细胞，将悬浮液移至离心管中800 转/分钟离心，获取细胞沉淀，用第一次传代培养方法和条件继续在细胞培养箱中 进行分瓶培养，待细胞生长至瓶壁面积的75％，用传代的方法收集细胞，细胞团用 二甲基亚砜细胞冻存液吹打开，得保藏编号为CCTCC NO：C201133的成人肾母细胞瘤 HANB细胞株；该步骤的其他步骤与实施例1相同。在复苏步骤3中，将冻存步骤2液 氮中的细胞在40℃～42℃水浴中融化，细胞悬液移至离心管中800转/分钟离心，细 胞沉淀移至细胞培养瓶中，用传代培养方法和条件继续进行培养，培养液用5％新 生小牛血清的1640培养液。

其他步骤与实施例1相同。

实施例3

成人肾母细胞瘤HANB细胞株，保藏编号为CCTCC NO：C201133，其培养方法 如下：

在成人肾母细胞瘤HANB细胞株的培养方法的培养传代步骤1中，在超净工作台 上，将原代细胞置于培养瓶中，用含有质量分数为20％新生小牛血清的1640培养液 悬浮，在37℃、CO₂体积浓度为5％、95％湿度的细胞培养箱中培养，每隔24小时换含 有质量分数为15％新生小牛血清的1640培养液一次，培养至细胞生长至平台期，完 成细胞的第一次传代培养，将生长至平台期的细胞进行传代；在进行传代步骤中， 用质量分数为0.28％的胰蛋白酶水溶液进行消化，吸弃胰蛋白酶水溶液，用含有质 量分数为5％新生小牛血清的1640培养液吹打瓶壁，悬浮细胞，将悬浮液移至离心管 中800转/分钟离心，获取细胞沉淀，用第一次传代培养方法和条件继续在细胞培养 箱中进行分瓶培养，待细胞生长至瓶壁面积的75％，用传代的方法收集细胞，细胞 团用二甲基亚砜细胞冻存液吹打开，得保藏编号为CCTCC NO：C201133的成人肾母细 胞瘤HANB细胞株；该步骤的其他步骤与实施例1相同。在复苏步骤3中，将冻存步骤 2液氮中的细胞在40℃～42℃水浴中融化，将细胞悬液移至离心管中800转/分钟离 心，细胞沉淀移至细胞培养瓶中，用传代培养方法和条件继续进行培养，培养液用 15％新生小牛血清的1640培养液。

其他步骤与实施例1相同。

实施例4

上述实施例1～3培养方法培养的成人肾母细胞瘤HANB细胞株在建立肾母细胞 瘤模型中的用途。其使用方法如下：

将体外培养的每代成人肾母细胞瘤HANB细胞株离心收集细胞，用0.01mol/L的 磷酸盐缓冲液制成细胞悬液，合计细胞数为10⁶，每一代分别接种裸鼠、计量为每只 1mL，连续观察2周，建立肾母细胞瘤动物模型，可用于肾母细胞瘤细胞的发展、转 移机理的研究和放化疗药物临床治疗的疗效评价。

为了验证本发明的有益效果，发明人采用本发明实施例1培养的成人肾母细胞 瘤HANB细胞株进行了实验，各种实验情况如下；

1、成人肾母细胞瘤HANB细胞株的形态

将收获的成人肾母细胞瘤HANB细胞株用含有质量分数为10％新生小牛血清的 1640培养液悬浮，制成细胞悬液，接种于放有高压灭菌盖玻片的6孔培养板中，在 37℃、CO₂体积浓度为5％、95％湿度的细胞培养箱中培养，每隔24小时换含有质量分 数为10％新生小牛血清的1640培养液一次，培养至细胞生长至平台期，吸弃培养液， 用0.01M磷酸盐缓冲液洗涤细胞生长的盖玻片(即细胞爬片)2次，吸弃缓冲液， 加入95％无水乙醇固定细胞，采用光学显微镜观察细胞形态，观察结果见图1～2。

将收获的成人肾母细胞瘤HANB细胞株先用质量分数为2.5％的戊二醛磷酸缓冲 液固定，用质量分数为7％的蔗糖磷酸缓冲液冲洗，再固定于体积分数为1％的OsO4(锇 酸)中，用丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，用枸橼酸铅、醋酸铀双重染 色，采用JEM1200型透射电镜观察细胞形态，观察结果见图3。

由图1～2可见，细胞呈多种形态，有小圆形、梭形和多边形，个别细胞有伪足， 呈片状聚集生长，核浆比例明显。由图3可见，肿瘤细胞极其丰富，细胞核密集、 核大、不规则、核仁多、贴边、包浆少，细胞表面的微绒毛丰富，可见核糖体、粗 面内质网及明显、丰富的脂滴，与原瘤体透射电镜观察表现相同。

2、成人肾母细胞瘤HANB细胞株的生长特性

将细胞按4×10个/mL接种于24孔板，每天计数3个孔细胞数，计算均值，连续 12天，绘制细胞生长曲线，根据Patterson公式

Td＝T×lg2/lg(Nt/No)

计算细胞群体倍增时间，式中Td是细胞倍增时间，T是细胞由Nt到No所需时间，Nt 是培养t天时接种孔内的细胞数，No是接种当天孔板中的细胞数。成人肾母细胞瘤 HANB细胞株接种后第4天后进入对数生长期，第9天进入平台期，细胞倍增时间为 45.6小时。

取对数生长期细胞，收集单细胞悬液，离心后重新悬浮于5mL、4℃预冷的用 0.01mol/L的磷酸盐缓冲液中，再缓慢加入4℃预冷的质量分数为95％乙醇15mL， 使终浓度质量百分数为75％，冰浴30分钟，用行流式细胞仪检测细胞DNA含量。流 式细胞仪测得G1期(DNA合成准备期)细胞83，G2期(有丝分裂的准备期)9.7， S期(DNA的合成期)7.3，G2/G1为1.9，为亚三倍体细胞，细胞生长周期符合肿 瘤细胞的特点。

3、成人肾母细胞瘤HANB细胞株的染色体分析

取培养48小时的肾母细胞瘤细胞，加入秋水仙素工作液至终浓度为0.02mg/mL， 继续培养4小时，收集细胞，离心，低渗固定，在真空干燥箱内干燥，制片，用姬 姆萨染色法染色，镜检50个中期分裂相，进行染色体分析。成人肾母细胞瘤HANB细 胞株经过连续32代传代，染色体保持人类肿瘤染色体的特点：染色体数分布在53～ 74，染色体众数为62～68，占75％，主要为三倍体核型，存在多数中央及亚中央着 丝粒染色体，均保持人类染色体核型。

4、用成人肾母细胞瘤HANB细胞株建立动物模型

裸鼠致瘤性试验中，将体外培养的第3、9代成人肾母细胞瘤HANB细胞株离心收 集细胞后，用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液制成细胞悬液，合计细胞数为10⁶，每一代 分别接种8只裸鼠、计量为1mL，连续观察2周，并设阴性对照2组、每组2只，注射 同等体积的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液。连续观察2周，试验结果见表1。

表1成人肾母细胞瘤HANB细胞株的致瘤率

由表1可见，随接种时间增加瘤体增大，每组成瘤率为100％(8/8)，而阴性对照 组无瘤体产生。

5、成人肾母细胞瘤HANB细胞株的标志性蛋白检测

采用免疫组化标记法(链亲和素-生物素放大体系)，分别进行波形蛋白和上皮 膜抗原免疫组织化学定位。组织切片脱蜡、水化，0.01mol/L的磷酸盐缓冲液洗组 织切片两次各5分钟，用蒸馏水或0.01mol/L的磷酸盐缓冲液配置新鲜的质量分数 为3％的过氧化氢，室温封闭细胞爬片和组织切片各5～10分钟，用蒸馏水洗3次， 抗原修复，0.01mol/L的磷酸盐缓冲液洗5分钟，滴加正常山羊血清封闭液，室温 20分钟，甩去多余液体，滴加I抗，I抗浓度∶波形蛋白1∶500(I抗由美国DAKO 生产公司生产)，上皮膜抗原1∶500，室温1小时或者4℃过夜或37℃1小时(4℃ 过夜后在37℃复温45分钟)，0.01mol/L的磷酸盐缓冲液洗三次，每次2分钟，滴 加生物素化二抗，20℃～37℃20分钟，0.01mol/L的磷酸盐缓冲液洗3次每次2分 钟，滴加试剂SABC(武汉博士德公司销售)，20℃～37℃20分钟，0.01mol/L的磷 酸盐缓冲液洗4次每次5分钟，用DAB(武汉博士德公司销售)显色：DAB显色试 剂盒或者自配显色剂显色(镜下掌握显色程度)，蒸馏水洗，苏木素复染2分钟、 盐酸酒精分化，脱水、透明、封片、镜检。实验结果见表2，

表2成人肾母细胞瘤HANB细胞株的标志性蛋白免疫组化结果

由表2可见，波形蛋白在各代肿瘤细胞中均可见表达；而上皮膜抗原这一标记 在本肿瘤中均无阳性表现，与体内原肿瘤免疫组化结果一致。