一种从沙蜇刺丝囊毒素中分离具有清除超氧阴离子活性蛋白

摘要

本发明涉及生物技术，具体的说是一种从沙蜇刺丝囊毒素中分离纯化具有清除超氧阴离子活性蛋白。并将该蛋白命名为SmP90，其分子量为90kDa，N末端氨基酸序列为：Asn-Leu-Asp-Thr-Pro-Tyr-Cys-Phe-Tyr-Ser-Gly-Asp-Tyr-Gly-Gly，对超氧阴离子的半清除率约为16μg/mL。本发明具快速、简便的特点，为从沙蜇毒素分离蛋白SmP90及研究其生理功能提供了重要的方法指导。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术，具体的说是一种从沙蜇(Stomolophus meleagris  L.Agassiz)刺丝囊细胞毒素中分离纯化的具有清除超氧阴离子活性蛋白 SmP90。

背景技术

水母(jellyfish)是一种胶质状的浮游动物，主要包括四大类群：刺 胞动物门的水螅水母类、管水母类、钵水母类以及栉水母门的栉水母类。 水母种类繁多，分布广泛，世界上已记录的水母种类大约有1000种左 右，其中我国海域已知的约有400种。我国是海岸线非常长的国家之一， 从北到南地跨寒温带、温带、亚热带和热带，而在我国的沿海地区几乎均 有大量水母分布，其中以沙蜇数量尤为丰富。沙蜇(Stomolophus meleagris  L.Agassiz)，是大型钵水母，伞径180-980mm。隶属于腔肠动物门 (Coelenterata)，钵水母纲(Scyphomedusae)，根口水母目(Rhizostomeae)， 口冠水母科(Stomolophidea)，口冠水母属(Stomolophus)。近年来，水母 经常暴发，造成众多游泳者被蜇伤，轻者皮肤出现皮疹、红肿、瘙痒，令 被蜇伤者痛苦不堪，重者昏厥、休克甚至死亡。而水母之所以能够给人们 带来如此大的危害，最主要的原因是：存在于水母触手上的刺丝囊细胞内 含有大量的水母毒素。水母毒素主要是蛋白类物质，其中包含多种具有不 同生物活性的毒素蛋白，如溶血活性、酶活性、抗氧化活性、致死毒性、 心脏血管毒性、肝脏毒性等。

相对于陆地生物，人们对于海洋生物研究的深度和广度都相对有很大 的差距，而海洋生物中存在很多至今仍未被发现的物质，这些物质无论在 结构功能还是生物活性上都可能与陆地生物存在较大的差异，因此从海洋 生物中分离纯化新颖的物质并且研究其结构、生理功能以及生物活性都具 有重要的意义，而水母毒素作为海洋活性提取物，其中富含有多种生物活 性组分以及新颖蛋白，这为开发新型的海洋药物提供了重要的先导化合物。

发明内容

本发明的目的是提供一种从沙蜇刺丝囊毒素中分离具有清除超氧阴离 子活性蛋白。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种从沙蜇刺丝囊毒素中分离具有清除超氧阴离子活性蛋白：所述具 有清除超氧阴离子活性的蛋白SmP90分子量为90kDa；其N末端氨基酸序列 为：Asn-Leu-Asp-Thr-Pro-Tyr-Cys-Phe-Tyr-Ser-Gly-Asp-Tyr-Gly-Gly。

所述具有清除超氧阴离子活性的蛋白SmP90的提取方法：将处理后的 沙蜇刺丝囊细胞上清液经微孔滤膜过滤，滤液经凝胶色谱柱，采用含NaCl 的PBS缓冲液以0.2～0.5mLmin^-1的流速进行纯化分离，收集洗脱体积处于 130-150mL的洗脱液，并且洗脱液在2～6℃下用3～5K的超滤管进行浓缩， 所得浓缩液即为从沙蜇刺丝囊毒素中分离出的分子量为90kDa；N末端氨基 酸序Asn-Leu-Asp-Thr-Pro-Tyr-Cys-Phe-Tyr-Ser-Gly-Asp-Tyr-Gly-Gly 的蛋白SmP90。

所述处理后的沙蜇刺丝囊细胞上清液为：将沙蜇刺丝囊细胞加入预冷 缓冲液中破碎，破碎后2～6℃离心，收集上清液，并将上清液在冰浴下加 入硫酸铵至上清液饱和度为50％，而后放置过夜后离心收集沉淀，沉淀经含 NaCl的PBS缓冲液溶解，并离心收集上清液，待用。所述含NaCl的PBS缓 冲液，缓冲液中NaCl浓度为0.15M，PBS浓度为10～50mM，pH7.0。所述 沙蜇刺丝囊细胞为：将置于-80～-20℃低温的沙蜇触手于2～6℃自 溶12～48h，自溶后利用20～60目的标准分样筛滤去触手残片，而后在2～ 6℃下10000～15000g离心5～20min，收集下部沉淀，2～6℃冷冻干燥， 待用。所述沙蜇刺丝囊细胞加入pH7.0，浓度10～30mM的2～6℃下预冷 PBS缓冲液中，而后将其置于冰浴下用超声波功率为200～400kw下破碎 20～60min中，工作/间隙为5s/30s。所述处理后的沙蜇刺丝囊细胞上清液 用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤。

本发明的优点：

1.本发明从沙蜇毒素中分离纯化具有清除超氧阴离子活性的蛋白 SmP90，为水母毒素蛋白的分离纯化提供了方法指导。

2.本发明采用硫酸铵分离沉淀和凝胶过滤法从沙蜇毒素中分离纯化新 蛋白SmP90，具有流速快、分辨率高、产率高的特点，而且分离步骤少，只 经过两步分离就能够得到较纯的蛋白SmP90。

附图说明

图1为本发明实施例提供的凝胶过滤Superdex75分离50％硫酸铵沙蜇 毒素沉淀的洗脱层析图。

图2为本发明实施例提供的分离到的蛋白SmP90的SDS-PAGE电泳图

图3为本发明实施例提供的分离到的蛋白SmP90的清除超氧阴子活性 图。

图4为本发明实施例提供的蛋白SmP90的酶解质谱鉴定结果图

图5为本发明实施例提供的蛋白SmP90的N末端测序结果图。

具体实施例

实施例1

1)沙蜇毒素刺丝囊细胞的制备：将1kg冰冻的沙蜇触手于2℃下自溶 过夜后，用滤筛过滤去除沙蜇触手残片，收集上清液倒掉。然后1000g， 2℃下冷冻高速离心5min并收集下层沉淀，用生理盐水(0.154mol·L^-1NaCl 溶液)于2℃反复洗涤3次至上层液澄清，并将刺丝囊细胞沉淀冷冻干燥后， -20℃下冷冻保存备用。

2)沙蜇毒素的提取：称取沙蜇刺丝囊细胞20mg，加入120mL pH7.0， 10mM在2℃下预冷的磷酸缓冲液中，而后将其置于冰浴中用超声波功率 为200kw下破碎20min中，工作/间隙为5s/30s。然后2℃，10000g 离心5min，取上清液待用。

3)硫酸铵分级沉淀法分离沙蜇毒素：

取0℃下预冷的沙蜇毒素提取液100mL，向其中缓慢加入29.1g硫酸铵， 在加入过程中每次加入1g左右的硫酸铵，待其完全溶解后再继续加入，并 且在此过程中利用磁力搅拌器进行搅拌加速溶解，以防止硫酸铵局部浓度 过高，待全部硫酸铵溶解完毕后，将其静置于2℃下过夜，然后10000g 离心5min，取沉淀待用。

4)凝胶过滤法Superdex75分离第一步沉淀：

①上样前样品的预处理：将上步分离得到的沉淀用0.15M NaCl，10mM， pH 7.0PBS溶解，然后0℃下10000g离心5min，取上清，用孔径为 0.45μm的微孔滤膜过滤，待用。

②上样和洗脱：将上述处理好的样品上Superdex75凝胶过滤柱，分离 时采用的洗脱液为含0.15M NaCl的20mM，pH 7.0PBS，流速为0.2mLmin^-1， 收集130～150ml处的洗脱液，2℃下用3K的超滤管进行浓缩，该浓缩液 即为蛋白SmP90(参见图1)。

5)SDS-PAGE检测蛋白纯度：将步骤4)分离到的蛋白进行SDS-PAGE电 泳检测其纯度，具体如下：使用5％的浓缩胶(含SDS)和12％的分离胶(含 SDS)以及Tris-Gly(含SDS)电泳缓冲液进行电泳，上样缓冲液中含有SDS 和DTT或β-巯基乙醇等还原剂，电泳结束后利用银染法进行染色。实验结 果显示SmP90的纯度在95％以上。(参见图2)。

6)清除超氧阴离子活性测定：采用PMS(吩嗪硫酸甲酯)-NADH(还原性 辅酶I)-NBT(硝基四氮唑蓝)体系来测定SmP90对超氧阴离子自由基的清除 作用。向试管中依次加入0.5mLNADH(8μmol/L)，0.5mLNBT(50μmol/L)， 0.5mL PMS(10μmol/L)，以及含不同量的SmP90的3.0mL Tris-HCl缓冲液 使体系。混匀后，采用分光光度法在560nm波长下测定反应液的吸光度。 空白组用相同体积的0.15M，pH8.0，Tris-HCl缓冲液替代样品SmP90和 NADH，对照组用相同体积Tris-HCl缓冲液替代样品SmP90。实验结果显示 SmP90对超氧阴离子的半清除率约为16μg/mL。(参见图3)。

7)将分离到的蛋白进行酶解质谱鉴定和N末端氨基酸测定蛋白SmP90， 分子量为90kDa；N末端氨基酸序为Asn-Leu-Asp-Thr-Pro-Tyr -Cys-Phe-Tyr-Ser-Gly-Asp-Tyr-Gly-Gly(参见图4和5)。

实施例2

1)沙蜇毒素刺丝囊细胞的制备：将2kg冰冻的沙蜇触手于4℃下自溶 过夜后，用滤筛过滤去除沙蜇触手残片，收集上清液倒掉。然后1200g， 4℃下冷冻高速离心10min并收集下层沉淀，用生理盐水(0.154mol·L^-1NaCl 溶液)于4℃反复洗涤3次至上层液澄清，并将刺丝囊细胞沉淀冷冻干燥后， -20℃下冷冻保存备用。

2)沙蜇毒素的提取：称取沙蜇刺丝囊细胞30mg，加入150mL pH7.0， 20mM在4℃下预冷的磷酸缓冲液中，而后将其置于冰浴中用超声波功率 为200kw下破碎20min中，工作/间隙为5s/30s。然后4℃，12000g 离心10min，取上清液待用。

3)硫酸铵分级沉淀法分离沙蜇毒素：

取0℃下预冷的沙蜇毒素提取液100mL，向其中缓慢加入29.1g硫酸铵， 在加入过程中每次加入1g左右的硫酸铵，待其完全溶解后再继续加入，并 且在此过程中利用磁力搅拌器进行搅拌加速溶解，以防止硫酸铵局部浓度 过高，待全部硫酸铵溶解完毕后，将其静置于0℃下过夜，然后12000g 离心10min，取沉淀待用。

4)凝胶过滤法Superdex75分离第一步沉淀：

①上样前样品的预处理：将上步分离得到的沉淀用0.15M NaCl，20mM， pH 7.0PBS溶解，然后6℃下12000g离心15min，取上清，用孔径 为0.45μm的微孔滤膜过滤，待用。

②上样和洗脱：将上述处理好的样品上Superdex75凝胶过滤柱，分离 时采用的洗脱液为0.15M NaCl，20mM，pH 7.0PBS，流速为0.2mLmin^-1， 收集130～150ml处的洗脱液，2℃下用3K的超滤管进行浓缩，该浓缩液 即为蛋白SmP90。

5)SDS-PAGE检测蛋白纯度：将步骤4)分离到的蛋白进行SDS-PAGE电 泳检测其纯度，具体如下：使用5％的浓缩胶(含SDS)和12％的分离胶(含 SDS)以及Tris-Gly(含SDS)电泳缓冲液进行电泳，上样缓冲液中含有SDS 和DTT或β-巯基乙醇等还原剂，电泳结束后利用银染法进行染色。实验结 果显示SmP90的纯度在95％以上。(参见图2)。

6)清除超氧阴离子活性测定：采用PMS(吩嗪硫酸甲酯)-NADH(还原性 辅酶I)-NBT(硝基四氮唑蓝)体系来测定SmP90对超氧阴离子自由基的清除 作用。向试管中依次加入0.5mLNADH(8μmol/L)，0.5mLNBT(50μmol/L)， 0.5mL PMS(10μmol/L)，以及含不同量的SmP90的3.0mL Tris-HCl缓冲液 使体系。混匀后，采用分光光度法在560nm波长下测定反应液的吸光度。 空白组用相同体积的0.15M，pH8.0，Tris-HCl缓冲液替代样品SmP90和 NADH，对照组用相同体积Tris-HCl缓冲液替代样品SmP90。实验结果显示 SmP90对超氧阴离子的半清除率约为16μg/mL。(参见图3)。

7)将分离到的蛋白进行酶解质谱鉴定和N末端氨基酸测定蛋白SmP90， 分子量为90kDa；N末端氨基酸序为Asn-Leu-Asp-Thr-Pro-Tyr -Cys-Phe-Tyr-Ser-Gly-Asp-Tyr-Gly-Gly(参见图4和5)。

实施例3：

1)沙蜇毒素刺丝囊细胞的制备：将3kg冰冻的沙蜇触手于6℃下自溶 过夜后，用滤筛过滤去除沙蜇触手残片，收集上清液倒掉。然后1500g， 6℃下冷冻高速离心15min并收集下层沉淀，用生理盐水(0.154mol·L^-1NaCl 溶液)于6℃反复洗涤3次至上层液澄清，并将刺丝囊细胞沉淀冷冻干燥后， -20℃下冷冻保存备用。

2)沙蜇毒素的提取：称取沙蜇刺丝囊细胞30mg，加入180mL pH7.0， 30mM在6℃下预冷的磷酸缓冲液中，而后将其置于冰浴中用超声波功率 为200kw下破碎20min中，工作/间隙为5s/30s。然后6℃，15000g 离心15min，取上清液待用。

3)硫酸铵分级沉淀法分离沙蜇毒素：

取0℃下预冷的沙蜇毒素提取液100mL，向其中缓慢加入29.1g硫酸铵， 在加入过程中每次加入1g左右的硫酸铵，待其完全溶解后再继续加入，并 且在此过程中利用磁力搅拌器进行搅拌加速溶解，以防止硫酸铵局部浓度 过高，待全部硫酸铵溶解完毕后，将其静置于0℃下过夜，然后15000g 离心15min，取沉淀待用。

4)凝胶过滤法Superdex75分离第一步沉淀：

①上样前样品的预处理：将上步分离得到的沉淀用0.15M NaCl，30mM， pH 7.0PBS溶解，然后6℃下15000g离心15min，取上清，用孔径 为0.45μm的微孔滤膜过滤，待用。

②上样和洗脱：将上述处理好的样品上Superdex75凝胶过滤柱，分离 时采用的洗脱液为0.15M NaCl，20mM，pH 7.0PBS，流速为0.2mLmin^-1， 收集130～150ml处的洗脱液，6℃下用5K的超滤管进行浓缩，该浓缩液 即为蛋白SmP90。

5)SDS-PAGE检测蛋白纯度：将步骤4)分离到的蛋白进行SDS-PAGE电 泳检测其纯度，具体如下：使用5％的浓缩胶(含SDS)和12％的分离胶(含 SDS)以及Tris-Gly(含SDS)电泳缓冲液进行电泳，上样缓冲液中含有SDS 和DTT或β-巯基乙醇等还原剂，电泳结束后利用银染法进行染色。实验结 果显示SmP90的纯度在95％以上。(参见图2)。

6)清除超氧阴离子活性测定：采用PMS(吩嗪硫酸甲酯)-NADH(还原性 辅酶I)-NBT(硝基四氮唑蓝)体系来测定SmP90对超氧阴离子自由基的清除 作用。向试管中依次加入0.5mLNADH(8μmol/L)，0.5mLNBT(50μmol/L)， 0.5mL PMS(10μmol/L)，以及含不同量的SmP90的3.0mL Tris-HCl缓冲液 使体系。混匀后，采用分光光度法在560nm波长下测定反应液的吸光度。 空白组用相同体积的0.15M，pH8.0，Tris-HCl缓冲液替代样品SmP90和 NADH，对照组用相同体积Tris-HCl缓冲液替代样品SmP90。实验结果显示 SmP90对超氧阴离子的半清除率约为16μg/mL。(参见图3)。

7)将分离到的蛋白进行酶解质谱鉴定和N末端氨基酸测定蛋白SmP90， 分子量为90kDa；N末端氨基酸序为Asn-Leu-Asp-Thr-Pro-Tyr -Cys-Phe-Tyr-Ser-Gly-Asp-Tyr-Gly-Gly(参见图4和5)。