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来源于链霉菌考干尼西斯的胞外透明质酸酶

摘要

本发明涉及链霉菌koganeiensis(Streptomyces koganeiensis,ATCC 313942)透明质酸酶,该酶分子量为21.6千道尔顿(kDalton),其活性和稳定性明显优于目前从此类微生物中所获得的其他透明质酸酶。本发明还涉及该透明质酸酶的分离与纯化过程,及其在制备药物组合物或作为分析试剂方面的应用。

著录项

法律信息

  • 法律状态公告日

    法律状态信息

    法律状态

  • 2014-05-21

    授权

    授权

  • 2012-06-27

    实质审查的生效 IPC(主分类):C12N9/26 申请日:20100512

    实质审查的生效

  • 2012-05-02

    公开

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说明书

背景技术

透明质酸酶为水解酶,它能以多种方式将透明质酸裂解为D-葡萄糖醛 酸和N-乙酰氨基葡萄糖,也能降解其他结缔组织的酸性粘多糖。例如,在水 蛭口器、蛇毒、蜂毒、蝎毒以及肺炎球菌、β-溶血链球菌、金黄色葡萄球菌 等致病菌的培养液上清中均存在高浓度的透明质酸酶。在人体内,透明质酸 酶存在于角膜、睫状体、脾脏、皮肤及睾丸内。另外,精子内也具有较多透 明质酸酶,可使其能够穿过保护卵细胞的透明质酸屏障。

透明质酸酶在医学上用于水肿、局部炎症反应、痔疮及冻疮的治疗,并 能有助于某些活性成分进行皮下给药。另有报道称,某些透明质酸酶确实能 够显著减少心肌梗死的面积[1]。在兽医领域,透明质酸酶也用于治疗诸如牛 乳腺炎等动物疾病的抗生素溶液中。此外,透明质酸酶还可用作某些生物学 检测的分析试剂,例如它可以用于透明质酸的定性-定量检测。

由于透明质酸酶在水溶液中不稳定并且在纯化中易失活,因此在工业规 模下生产和纯化细菌或动物来源的透明质酸酶非常困难。

美国专利US 4,258,134和相应的欧洲专利EP 0005751[2]披露了一种透 明质酸酶,该酶利用透析、DEAE-及CM-纤维素离子交换层析的方法从链霉 菌考干尼西斯(Streptomyces koganeiensis,ATCC 313942)的培养上清液中获 得。

目前已经发现,经上述两步层析获得的蛋白质组分,实际上由多个蛋白 质组成(二维电泳显示约68个),但其中只有一个具有较高的透明质酸酶活 性和显著的稳定性。

发明内容

本发明涉及来源于链霉菌koganeiensis(ATCC 31394)的透明质酸酶,包 含SEQ 1D No.1所示的N-末端氨基酸序列。

该酶的特征还在于分子量为21.6kDa,等电点(pI)在4.4-4.8之间,酶 活性等于或高于40,000IU/mg。

根据本发明,该透明质酸酶可通过包括以下步骤的方法获得:

a)将发酵链霉菌koganeiensis(ATCC 31394)得到的上清液进行弱阳离子 交换柱层析,分离具有透明质酸酶活性的蛋白质组分;

b)将步骤a)中获得的具有透明质酸酶活性的蛋白质组分进行透析及强 阴离子交换柱层析,分离具有透明质酸酶活性的蛋白质组分;

c)将步骤b)中获得的具有透明质酸酶活性的蛋白质组分进行强阳离子 交换柱层析,分离具有透明质酸酶活性的蛋白质组分;

d)将步骤c)中获得的具有透明质酸酶活性的蛋白质组分进行强阴离子 交换柱层析,分离具有透明质酸酶活性的蛋白质组分。

微生物发酵可利用已知的方法进行,具体而言,可利用美国专利US  4,258,134所披露的方法。发酵后取上清,然后进行收集、离心和过滤。此外, 根据本发明,在进行色谱层析步骤前,可利用本领域技术人员所公知的方法 对上清液进行进一步处理,以去除培养液中的残余颗粒。通常情况下,使用 适当的聚醚砜超滤膜对上清液进行超滤富集,超滤膜截留分子量为5~15 kDa,优选截留分子量为10kDa;通常上清液可富集8~12倍,优选富集倍 数为10倍。富集后的上清液一旦被合适的检测方法(例如Dorfman改良检 测法[3])证实具有透明质酸酶活性,则可对其进行透析;透析缓冲液根据在 步骤a)中所使用的弱阳离子交换树脂进行选择,以使透明质酸酶在此pH值 条件下能够与树脂结合。该树脂含有羧烷交换基团,优选为羧甲基基团,如 “CM-SepharoseFast Flow”树脂。利用透析缓冲液对树脂进行适当平衡后, 将样品上样,后用相同的缓冲液进行洗脱以除去未结合的蛋白质,尔后提高 缓冲液pH值直至能将结合蛋白质进行洗脱。使用“CM-SepharoseFast Flow” 树脂时,采用50mM pH 4.0的醋酸钠溶液进行透析、树脂平衡及洗脱未结合 的蛋白质,而对结合蛋白质的洗脱则采用50mM pH 4.5的醋酸钠溶液。将具 有高透明质酸酶活性的结合蛋白质收集为单一组分,并进行强阴离子交换柱 层析[步骤b)]。在开始进行前,可利用本领域技术人员所公知的方法对收集 的单一组分进行透析,所使用的透析缓冲液能够保证透明质酸酶与步骤b) 中使用的强阴离子树脂结合。此种树脂含有三烷基胺基团,一般为三甲基胺 基团,如“HiTrapQ XL”树脂(5ml柱)。利用透析缓冲液对树脂进行平 衡后,将步骤a)中获得的组分上样,后用相同的缓冲液进行洗脱以除去未 结合的蛋白质;然后逐步提高洗脱液的离子强度以对结合的蛋白质进行洗脱。 根据优选的实施方案,使用HiTrapQ XL树脂时,采用50mM pH 8的 Tris-HCl缓冲液进行透析、柱平衡及洗脱未结合的蛋白质,而在洗脱结合蛋 白时则向洗脱液加入浓度逐渐提高的NaCl溶液。洗脱时,首先使用50mM Tris-HCl、35mM NaCl pH 8溶液,然后使用50mM Tris-HCl、200mM NaCl  pH8溶液,由此可获得两个组分,但只有使用含有200mM NaCl的洗脱液洗 脱下来的第二组分才具有透明质酸酶活性。将该组分稀释8~12倍,优选稀 释10倍,所用稀释缓冲液能够保证透明质酸酶与步骤c)中使用的强阳离子 树脂结合。此种树脂含有磺酸基团,优选为磺酰烷基团,更优选为磺丙基团。 根据本发明具体优选的实施例,使用“HiTrapSP FF”树脂进行层析。就 具体操作来说,用稀释步骤b)所获得的透明质酸酶组分的稀释缓冲液平衡 树脂,上样,然后用相同的缓冲液进行洗脱(约20倍柱床体积),之后通过 逐步提高洗脱液的pH值对结合蛋白进行洗脱。一般而言,对于HiTrapSP FF树脂,稀释、柱平衡及洗涤均采用20mM pH4的磷酸钠缓冲液,而洗脱 则采用50mM pH 4.8的磷酸钠缓冲液。将具有高透明质酸酶活性的结合蛋白 质收集为单一组分,并进行强阴离子交换柱层析[步骤d)]。通常情况下,在 进行柱层析前,将该组分稀释8~12倍,优选稀释10倍,所用稀释缓冲液能 够保证透明质酸酶与所选树脂结合。步骤d)中所用树脂为含有季铵基团的 强阴离子交换树脂,优选使用“Resource Q”离子交换柱。上样后,采用 平衡时所用缓冲液进行洗涤,然后以0.5为单位逐步降低pH值直至4以对结 合蛋白进行洗脱。使用“Resource Q”离子交换柱时,透明质酸酶组分的 稀释、柱平衡及上样后的洗涤均采用20mM pH5.5的醋酸钠溶液,利用以上 所述逐步降低pH值的方法,在pH 5时可获得第一个蛋白质组分,在pH 4 时可获得另外两个蛋白质组分。如图2所示,在pH 4进行洗脱时所得的第二 组分在280nm处有吸收,其酶活也高于其他两个组分。将该组分进行12% SDS-PAGE电泳色谱法和银染(图6),可观察到单一蛋白质条带,其表观 分子量约25kDa。具体而言,经上述步骤纯化所得的透明质酸酶99%具有约 25kDa的表观分子量,此种蛋白质只包括了发酵上清液中约5%的透明质酸 酶;因此,该纯化过程达到了20倍的浓缩,其产量约30%。

对于目前已知的其他透明质酸酶而言,本发明所涉及的透明质酸酶在水 溶液中高度稳定,对蛋白水解酶类亦不敏感,HPLC纯度高于98%(图5a~ 5h),这些均为治疗用所必需之特性,因此,该酶可单独使用或与其他活性 成分联用,以制备人用或兽用药物组合物,用于降解器官或组织中的透明质 酸,以达到治疗某些疾病的需要。

由于在水溶液中高度稳定,本发明所涉及的透明质酸酶除了可以制成亲 脂性产品,如软膏剂或油性霜剂外,还可以制成以水相为基础的产品形式, 如溶液、亲水性霜剂、凝胶等。

就人体使用而言,本发明所涉及的透明质酸酶可用于制备药物组合物, 用于治疗水肿(特别是创伤性水肿)或炎症反应,如痔疮综合症等;此外, 它可以用于制备用于冻疮治疗的组合物本发明所涉及的透明质酸酶也与其他 药物联用,以适应提高生物利用度的需要。

例如,将本发明所述透明质酸酶与抗凝剂和/或纤维蛋白溶解剂进行组 合,特别适用于创伤性水肿的治疗。此类组合也可任意包含一种或多种甾体 或非甾体抗炎药。此外,对于不仅具有抗炎特性,还具有抗血栓和抗凝血特 性的硫酸化透明质酸来说,与上述成分进行组合也较为有利。在欧洲专利EP  0702699中,为此披露了一个使用硫酸化透明质酸的例子。

根据本发明,透明质酸酶与其他活性成分的组合也适用于含有高分子量 活性成分(例如通常用于静脉给药的单克隆抗体、细胞因子或酶)的注射剂。 根据所谓的酶增强皮下输注(EASI)过程,透明质酸酶能够使上述高分子活 性成分进行皮下给药。而EASI过程主要用于临终患者的补液治疗,以减轻 对患者的护理或使患者无需进行护理。根据本发明,透明质酸酶也可用于耐 药实体瘤治疗药物组合物的制备。事实上,通过降解透明质酸,透明质酸酶 可降低肿瘤内部的间质液压,以延缓或抑制其生长。基于同样原因,透明质 酸酶也可增加经优选组合的抗肿瘤活性成分的有效性。因此,本发明另外还 涉及含有透明质酸酶联合一种或多种抗肿瘤活性成分的药物组合物,如长春 花生物碱类(长春碱、长春新碱、长春瑞滨)和紫杉烷类(紫杉醇)。

根据本发明,透明质酸酶的另一个治疗用途为通过酶加强脱敏法(EPD, Enzyme Potentiated Desensitization)治疗IgE介导的过敏。酶加强脱敏法法则 是向疑似过敏者给予极低剂量的过敏原,从而达到脱敏目的。将透明质酸酶 与过敏原联合使用,由于过敏原更容易到达作用部位,因此治疗效果很有可 能得以提高。因此,本发明另外还涉及透明质酸酶与一种或多种过敏原的药 物组合物,上述过敏原可诱导产生IgE介导的过敏反应。透明质酸酶也可作 为口腔治疗药物的扩散因子用于口腔疾病的治疗,例如局部麻醉药和抗生素; 因此,本发明另外还涉及含有本发明所述透明质酸与一种或多种局部麻醉药 或抗生素联用的药物组合物。

对于眼科,透明质酸酶可明显促进自发性玻璃体出血的治疗,并可单独 或与其他活性成分联合制成眼科所用剂型(如溶液、悬液、凝胶,乳膏剂和 软膏剂),用于上述出血的治疗。

而对于兽医使用,本发明所述透明质酸酶可有效治疗的一种疾病为牛乳 腺炎;对于此种疾病,透明质酸酶可联合抗生素(如青霉素G、I-IV代头孢 菌素以及加强的氨苄青霉素)进行给药。

本发明所述药物组合物可根据本领域技术人员所公知的技术和赋形剂 获得,例如,可根据Remington第21版The Science and the Practice of  Pharmacy(Lippincott,Williams & Wilkins)所提供的信息。这些组合物具体 来说包括皮肤外用、透皮使用及眼科用的注射剂及局部用制剂。表皮用局部 制剂具体来说可选自乳膏剂、凝胶剂、软膏剂及喷雾溶液,而眼科用局部制 剂可选自乳膏剂、凝胶剂,软膏剂溶液及悬液。如前所述,本发明所涉及的 透明质酸酶由于其在水溶液中稳定,可制成以水相为基础的产品;而医药技 术领域专业人员可根据公知的知识,并依据组合物中其他成分在水相和油相 剂型之间做出选择。

最后,根据本发明的透明质酸酶可作为用于透明质酸的定性-定量测定的 生物化学化验试剂。

附图说明

图1:链霉菌koganeiensis(ATCC 31394)培养基上清液经CM-纤维素处 理后,透明质酸酶活性为阳性组分的2D电泳图。

图2:经Resource Q柱层析(步骤d)后获得的链霉菌koganeiensis透 明质酸酶色谱图。

图3:本发明所述每步纯化步骤后所获得的蛋白组分与上清蛋白组分的 12%SDS-PAGE电泳图对比。

图4:利用Bio-SIL SEC凝胶过滤柱[步骤d)]对透明质酸酶进行的HPLC 纯度分析图。

图5A-4H:步骤d)所获得的透明质酸酶SDS-PAGE分析结果及其N- 末端序列的吸收光谱。

图6:透明质酸酶活性测定的非变性SDS-PAGE分析结果,其中将步骤 d)所获得的透明质酸酶与根据美国专利US 4,258,134所获得的透明质酸酶 进行了比较。

图7:利用质谱对步骤d)所获得的透明质酸酶进行分子量测定的结果。

图8:步骤d)所获得的透明质酸酶的等电点测定结果

图9:几种市售透明质酸酶与本发明所述透明质酸酶的酶活性比较结果。

具体实施方式

实验部分

以下实验部分将对本发明进行更详细的描述,以求以一种最好的方式来 披露本发明,而不是对本发明进行限制。

材料与方法

微生物培养

S.koganeiensis获自美国菌种保藏中心(ATCC 31394),并按参考文献 [2]所述方法进行培养。简言之,菌种于1L培养基[含20g/L酵母提取物 (Organotechnie)及5g/L大豆蛋白胨(Solabia),pH 6.9]中在30℃条件下 以150rpm转速培养约16小时。生长结束后,将培养物接种于含30L适宜 培养基的50L发酵罐(BIOSTAT U,B.BRAUN)内,培养基含10g/L酵母 提取物(Organotechnie)、5g/L大豆蛋白胨(Solabia)、3g/L麦芽提取物 (Costantino)、3g/L I型糊精(Sigma)及0.2g/L消泡剂(Sigma)。在接 种前,pH值用NaOH调至7.0;在发酵过程中对pH值进行监测,但不需调 节,整个发酵温度保持在30℃,转速保持在300rpm,通气比为1.6VVM(每 分钟相对于单位发酵体积的通气量)。发酵持续48小时,该时间为发酵液上 清液产生最高透明质酸酶活性(1x105-1.3x105I.U./L)的时间。

发酵结束后,将发酵液于4℃、5000rpm离心30分钟(SORVALL  EvolutionRC),后用0.2μm聚醚砜切流过滤装置进行过滤,以此消除链霉 菌koganeiensis的生物量(以直径1-4mm的圆形菌丝体形式)并获得澄清的 含有透明质酸酶的上清液。

透明质酸酶的活性测定

透明质酸酶的活性通过改良的Dorfman法进行测定[3]。简言之,经DEAE 和CM-纤维素柱层析获得的产品0.03M、含0.82%NaCl、pH为6.3的磷酸 缓冲液稀释,取1ml稀释后溶液与1ml含0.5mg透明质酸的底物缓冲液(0.03 M磷酸缓冲液,含0.82%NaCl,pH为6.3)混合。于37℃进行酶解30分 钟,孵育接过程结束后向其中加入4ml马血清酸性溶液(Sigma)使之产生 浑浊。加入马血清酸性溶液30分钟后测定640nm下的光密度值。用哺乳动 物睾丸透明质酸酶(EDQM,FIP透明质酸酶,H1115000,单位活性为328 I.U./mg)作为标准品制作标准曲线,根据该标准曲线计算样品的单位活性。

柱层析

柱层析用树脂和色谱柱购自GE Healthcare Life Science,并按照厂商提 供的说明书进行保存。采用快速液相色谱系统(FPLC,AKTA Explorer 100, GE Healthcare)进行平衡和洗脱,对于第一次柱层析系统流速为40-50 ml/min,后续柱层析流速为5ml/min。在每个层析步骤过程的结束阶段均采 用前述改良的Dorfman法对透明质酸酶的活性进行检测。

对于纯度分析,则采用凝胶过滤法进行;在此使用LC-10AD高效液相 色谱(SHIMADZU)及Bio-Sil SEC色谱柱(BIO-RAD),以含0.05M NaH2PO4、 0.05M Na2HPO4、0.15M NaCl,pH6.6的溶液进行洗脱,洗脱速度为1ml/min。 检测用吸收波长为214nm(SPD-LOA,SHIMADZU)。蛋白质纯度用LC  Solution软件1.21SP1进行确定。

SDS-PAGE电泳

按Laemmli的方法[4]使用12%的聚丙烯酰胺凝胶进行SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。电泳按照厂商提供的说明在Mini PROTEAN 3 (BIO-RAD)电泳装置上进行根据。经纯化的蛋白质分子量通过与低分子量 标准蛋白(BIO-RAD)进行比较后估算。

二维电泳及等电聚焦

将需要进行分析的蛋白质组分与适当的上样缓冲液混合,然后上样于pH 3-10IPG胶条中(ReadyStrips 7cm胶条,BIO-RAD);胶条于25℃孵育直 至样品被胶条吸收,然后将胶条置入PROTEAN IEF Cell电泳装置上(BIO -RAD)进行等电聚焦(IEF)。

在等电聚焦(第一维)结束后,胶条用适当的上样缓冲液及电泳缓冲液 进行平衡,之后使用Mini PROTEAN 3Cells(BIO-RAD)在12%SDS-PAGE 上进行第二维电泳。

光密度分析

聚丙烯酰胺凝胶经银染(Silver Stain Plus,BIO-RAD)或考马斯 (BIO-RAD)染色后,可用凝胶成像系统(ImageQuant TL,GE Healthcare) 获取图像,而定量和定性分析可使用ImageQuant TL图像分析软件(GE  Healthcare)进行。对于二维SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶的图像分析,则采 用ImageMaster 2D Platinum 6.0软件进行(GE Healthcare)

质谱

对于测定分子量的质谱分析则使用UltraFlex III TOF/TOF质谱仪 (BRUKER)及Bruker Protein Mix 1标记蛋白进行;而对于蛋白质的鉴别, 则采用MALDI-MS Voyager DE-PRO系统(Applied Biosystems)对肽段进行 精确的分子质量测定后完成。

N末端测序

对于N-末端氨基酸序列的测定,则根据Edman降解法利用脉冲液相自 动化蛋白质测序仪(ABI-Perkin Elmer MOD.477A)完成。利用BLAST软件 [5]在Genbank数据库以及网络可用的链霉菌基因组项目中进行同源检索。

不同类型透明质酸酶之间活性的比较

我们将本发明所述透明质酸酶与一些最常用的市售透明质酸酶进行了 活力比较,以评估其应用潜力。这些市售透明质酸酶包括FIP透明质酸酶标 准品、I-S型牛睾丸透明质酸酶(Sigma)、VI-S型牛睾丸透明质酸酶(SIGMA)、 V型羊睾丸透明质酸酶(Sigma),产自链霉菌透明质酸酶(hyal urolyticus) 的透明质酸酶(SIGMA)。酶活用前述测定方法进行测定,活性数值以I.U./mg 为单位列于图9中(蛋白浓度测定则用PIERCE BCA蛋白测定试剂盒完成)。

实施例1(参考实施例)—根据美国专利US 4,258,134对链霉菌KOGANEIENSIS透明质酸酶进行制备、纯化及性质鉴定

依“材料与方法”中所述方法对链霉菌S.koganeiensis(31394 ATCC) 进行发酵培养。离心获得上清后,用合适的切流过滤装置进行过滤,之后进 行DEAE纤维素弱阴离子交换柱层析。简言之,1.2kg DEAE纤维素用25mM、 pH 7.0的磷酸钠缓冲液进行平衡后装柱,再用相同缓冲液对发酵上清液进行 透析后上样,上样后用含250mM NaCl的25mM、pH7.0磷酸盐缓冲液进行 洗脱。层析结束后,收集含有透明质酸酶活性的组分并用超滤法进行富集, 富集后用10倍体积的醋酸缓冲液(pH 5.0)进行透析,尔后进行CM-纤维素 弱阳离子交换柱层析,并用0.005~0.1M醋酸缓冲液进行梯度洗脱。收集透 明质酸酶活性为阳性的柱层析组分,超滤浓缩后用10倍体积的蒸馏水 (MilliQ,Millipore)进行透析;由此获得的产物经0.2μm聚醚砜滤膜过滤 后进行透明质酸酶活性测定、SDS-PAGE电泳、二维电泳及光密度分析。

对于二维电泳(结果如图1所示),从柱层析所得具有透明质酸酶活性 的组分中取600μl,然后用BIOMAX 5K超滤管(Millipore)浓缩至约20μl (约864单位的透明质酸酶)。将浓缩液与125μl上样缓冲液混合(上样缓 冲液含8M尿素、2%CHAPS、50mM二硫苏糖醇(DTT)、0.2%(W/V)BioLyte  2/10两性电解质及溴酚蓝),然后上样于pH 3-10IPG胶条中(ReadyStrips 7 cm胶条,BIO-RAD);胶条于25℃孵育11小时。待样品被胶条吸收后, 将胶条置入PROTEAN IEF Cell电泳装置上(BIO-RAD)进行等电聚焦(IEF)。

在等电聚焦(第一维)结束后,胶条首先用等电聚焦(第一维)电泳缓 冲液(6M尿素、2%SDS、0.375M Tris-HCl(pH 8.8)、20%甘油)平衡15 分钟,平衡后使用Mini PROTEAN 3Cells(BIO-RAD)在12%SDS-PAGE上 进行第二维电泳。电泳结束后,用快速凝胶考马斯蓝R(Coomassie PhastGel  Blue R)对凝胶进行染色,之后扫描并用“材料与方法”所述凝胶成像软件 进行分析(图1)。

实施例2-根据本发明对链霉菌KOGANEIENSIS透明质酸酶进行制备、纯化及性质鉴定

2A)制备与纯化

样品制备

按“材料与方法”所述方法对链霉菌koganeiensis(ATCC 31394)进行 发酵培养,所得澄明上清液(约30L)用截留分子量为10-kDa的聚醚砜滤 膜进行超滤,将其浓缩10倍后测定其透明质酸酶活性。浓缩后的上清液用 10倍体积50mM、pH 4.0的醋酸钠溶液进行透析后用于步骤a)。

步骤a)弱阳离子交换柱层析

浓缩及透析后的上清液上样于填充有200ml CM-SepharoseFast Flow 树脂(GE Healthcare)的XK-50层析柱内(GE Healthcare),并用10柱床 体积(BV)的50mM、pH 4.0醋酸钠缓冲液进行平衡。

上样后,用3BV的相同缓冲液洗涤层析柱,然后用3BV的50mM、pH 4.5醋酸钠缓冲液对结合蛋白质进行洗脱。将洗脱下的蛋白质收集为单一组 分,其体积约200毫升,之后进行透明质酸酶活性测定。

步骤b)透析及强阴离子交换柱层析

将步骤a)获得的具有透明质酸酶活性的组分用10倍体积的50mM Tris-HCl、pH 8的平衡缓冲液进行透析,之后上样于事先经20BV相同缓冲 液平衡的HiTrapQ XL柱(5ml)内。样品上样后,用20BV平衡缓冲液 进行洗涤,之后再用12BV的含35mM NaCl的50mM、pH 8Tris-HCl缓冲 液进行首次洗脱,以除去含有非活性蛋白质的杂质;而含有透明质酸酶活性 的组分则用14BV含200mM NaCl的50mM、pH8的Tris-HCl缓冲液进行洗 脱并收集,其终体积约50ml。平衡、洗涤及洗脱均在5ml/min的流速下进 行。

步骤c)强阳离子交换柱层析

将步骤b)获得的组分用20mM、pH4的醋酸钠缓冲液稀释10倍,并上 样于事先经20BV相同缓冲液平衡的HiTrapSP FF层析柱内。首先用20BV 的上述缓冲液进行洗涤,后用10BV的50mM、pH4的磷酸钠缓冲液对结合 蛋白进行洗脱。洗脱后蛋白收集为体积约45ml的单一组分,并进行透明质 酸酶的活性测定。平衡、洗涤及洗脱均在5ml/min的流速下进行。

步骤d)强阴离子交换柱层析 将步骤c)获得的具有透明质酸酶活性的组分用20mM、pH 5.5的醋酸 钠缓冲液稀释10倍,之后上样于事先经20BV相同缓冲液平衡的ResourceQ柱(5ml)内。上样后,先用20BV相同缓冲进行洗涤,然后将缓冲液pH 值降低至5并用10BV进行洗脱,以此除去含有非活性蛋白质的杂质。后将 缓冲液pH值进一步降低至4并用15BV进行洗脱。在此pH下收集具有较 高吸光值的第二个洗脱峰,其终体积约10-15ml,之后对其进行超滤并用10 倍体积MilliQ水(Millipore)进行透析。平衡、洗涤及洗脱均在5ml/min的 流速下进行。

对于所有洗脱的蛋白质组分,不管其是否具有透明质酸酶活性或其酶活 较低,均以“材料与方法”中所述方法进行12%SDS-PAGE分析,然后根据 生产商提供的方法对其进行银染染色;对于所有具有最高透明质酸酶活性的 组分,在大约25kDa处可见明显的蛋白质条带(图3)。

2b)分析及特性

凝胶过滤HPLC分析

对步骤d)获得的组分按“材料与方法”中所述方法进行凝胶过滤HPLC 分析,分析结果如图4所示。

质谱

对步骤d)获得的组分进行12%SDS-PAGE电泳。电泳结束后用考马斯 亮蓝G-250(BIO-RAD)对凝胶进行染色,并用胰蛋白酶(BIO-RAD)对从 凝胶上切下的蛋白质进行消化。利用MALDI-MS Voyager DE-PRO系统 (Applied Biosystems)获得其肽质谱图肽。所得肽段的分子质量用于数据库 检索以对蛋白质进行鉴定。

N-端测序

以前述方法对步骤d)获得的组分进行12%SDS-PAGE电泳,然后按生 产商提供的方法将其转移到聚偏氟乙烯膜(BIO-RAD)上并染色。用刀将蛋 白质条带切下,并使所切部分的尺寸尽可能小(3mm×10mm),然后置入 测序反应室内。

利用非变性SDS-PAGE进行透明质酸酶活性检测

将用于透明质酸酶活性分析的蛋白质样品(即(步骤d)中获得的透明 质酸酶及未结合的蛋白质,以及根据美国专利US4,258,134所获得的透明质 酸酶)在经0.17mg/ml透明质酸溶液饱和的8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上进 行分离,试验重复进行两次。电泳结束后,用含0.1M甲酸钠、0.05M NaCl、 pH 4.0的溶液洗涤三次,并在相同溶液中于37℃孵育过夜。之后用3%醋酸 将凝胶洗涤三次,并于室温下用0.5%(W/V)阿辛蓝(Sigma)及3%醋酸溶 液染色2小时。后用7%醋酸钠溶液脱色至少1小时。

具有透明质酸酶活性的蛋白质在凝胶蓝色背景上显示为白色条带[6]。对 照则采用相同的非变性PAGE电泳,但使用考马斯亮蓝G-250(BIO-RAD) 进行染色(图6)。

对非变性聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质进行被动洗脱

非变性聚丙烯酰胺凝胶经考马斯亮蓝G-250染色后,切下具有透明质酸 酶活性的蛋白质条带并置于1.5ml无菌离心管内。加入0.5ml洗脱缓冲液(50 mM Tris-HCl、150mM NaCl及0.1mMEDTA,pH7.5)使切下的胶块完全浸 没。之后用无菌研杵将胶块研匀并置于定轨振荡器中于30℃孵育过夜。孵 育结束后,将研匀后的胶块于5,000-10,000g(5402离心机,Eppendorf)离 心10分钟,小心取去上清液,并转移至一个新的1.5ml离心管中。使用 BIOMAX 5K超滤管(Millipore)将上清液浓缩10倍,用SDS-PAGE验证上 清液中存在洗脱下的蛋白,之后进行透明质酸酶的活性测定,并进行N-末 端测序以作确认(图5)。

利用质谱对蛋白质的分子量进行测定

将1μl透明质酸酶(约0.5μg)与1μl含50%乙腈与0.1%三氟乙酸(TFA) 的芥子酸(SA)溶液混合,其中芥子酸的浓度为20μg/μl。所得混合物置于 MALDI靶板上并按“材料与方法”中所述方法进行分析。分析结果如图7 所示。

等电聚焦

将20μl步骤d)获得的透明质酸酶(约20μg)与125μl上样缓冲液混 合(上样缓冲液含8M尿素、2%CHAPS、50mM二硫苏糖醇(DTT)、0.2% (W/V)BioLyte 2/10两性电解质及溴酚蓝),然后上样于pH 3-10IPG胶 条中(ReadyStrips 7cm胶条,BIO-RAD);胶条于25℃孵育11小时。待 样品被胶条吸收后,将胶条置入PROTEAN IEF Cell电泳装置上(BIO-RAD) 进行等电聚焦(IEF)。等电聚焦结束后,将胶条用滤纸(Whatman)吸干后 再用MilliQ水浸湿,接着用IEF凝胶染色液(BIO-RAD)染色45分钟。脱 色则用脱色液(Destain脱色液,考马斯亮蓝R-250,BIO-RAD)脱色1小时 或更长时间。样品等电点通过与等电点标准参照物(IEF Marker pH3-10, SERVA)对比进行确定。分析结果如图8所示。

不同类型透明质酸酶的活性比较

该试验的结果表明,本发明所述透明质酸酶的活性约是对比所用透明质 酸酶最高活性的3倍(图9)。

测序

按“材料与方法”中所述方法对N末端序列进行测定,可得N末端包含 以下氨基酸序列:

Ala-Gly-Glu-Asn-Gly-Ala-Thr-Thr-Thr-Phe-Asp-Gly-Pro-VaI-Ala(SEQ ID  No.1)

实施例3-药用剂型的制备

剂型1-亲水性凝胶

对羟基苯甲酸甲酯和丙酯于80℃溶于纯水中。将溶液冷却至室温后, 加入透明质酸酶,振摇至完全溶解,后加入聚乙二醇400,继续振摇至溶解。 将卡波姆974P加入至上述溶液中,继续振摇至其均匀分散和完全水化,然 后加入TEA以获得水相凝胶。最后,在振摇条件下加入甘油和丙二醇。

剂型2-亲水性乳膏剂(O/W型乳剂)

  组分   用量(I.U.或mg/1g乳膏)   透明质酸酶   150I.U.   特富赛(Tefose)1500   110mg   甘油   80mg   硬脂酸   33mg   液体石蜡   40mg   对羟基苯甲酸甲酯   1mg   纯水   适量至1g

对于油相的制备,将液体石蜡、硬脂酸及特富赛(Tefose)1500于50℃ 振摇融化。另外,水相的制备则以80℃的对羟基苯甲酸甲酯为初始溶液, 随后冷却至室温,加入甘油及透明质酸酶并振摇直至完全溶解。

将水相加入至油相并进行乳化,之后将获得的O/W型乳剂振摇并冷却至 室温。

剂型3-软膏剂

  组分   用量(I.U.或mg/1g软膏)   透明质酸酶   150I.U.   轻质液体石蜡   200mg   白凡士林   适量至1g

将轻质液体石蜡与白凡士林于70℃振摇融化作为软膏基质。冷却至室 温后,加入透明质酸酶,震荡直至获得均匀的悬浮液。

剂型4-脂凝胶

  组分   用量(I.U.或mg/1g脂凝胶)   透明质酸酶   150I.U.   氢化蓖麻油   10mg   十八十六醇   50mg   白凡士林   365mg   轻质液体石蜡   适量至1g

将轻液体石蜡。白凡士林及和十八十六醇于90℃振摇融化,之后加入 氢化蓖麻油(脂凝胶剂)直至生成均匀溶液。慢慢冷却至室温后,加入透明 质酸酶,震荡直至获得均匀的悬浮液。

剂型5-肌肉或或皮下注射用溶液

  组分   用量(I.U.或mg/ml溶液)   透明质酸酶   200I.U.   乳糖   0.93   磷酸氢二钾   0.36   磷酸二氢钾   0.23   氯化钠   9

将乳糖及透明质酸酶振摇溶解于室温制备的、pH为6.4-7.2的缓冲生理 盐水中,所得溶液经0.22μm滤膜过滤。

参考文献

[1]Maclean,D.,Fishbein,MC.,Maroko,PR.& AND Braunwald AND. 1976.Science,194:99-200.

[2]Yoshida,K.,Fujii,T.,Kikuchi,H.1981.US Patent:4258134 and  European patent EP 0 005 751

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[5]Altschul SF,Madden TL,Schaffer AA,Zhang J,Zhang Z,Miller W, Lipman DJ.1997.Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein  database search programs.Nucleic Acids Res.25:3389-3402.

[6]Guntenhoener,M.W.,Pogrel,M.A.,and  Stern,R.1992.Matrix 12, 388-396.

[7]Lachmann S,Rommeleare J,Nuesch JP.2003.Novel PKCeta is required  to activate replicative functions of the maj or nonstructural protein NSl of minute  virus of mice.J Virol 2003;77(14):8048-60.

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