靶向抑制PPP2R5C基因表达和肿瘤T细胞增殖的PPP2R5C-siRNA991及其应用

摘要

本发明公开了一种靶向抑制PPP2R5C基因表达和肿瘤T细胞增殖的PPP2R5C-siRNA991及其应用。PPP2R5C-siRNA991的正义链为5’-CAGUGGUGAUGGCACUUCUCAAAUA -3’；反义链为5’-UAUUUGAGAAGUGCCAUCACCACUG-3’。PPP2R5C-siRNA991能高效抑制PPP2R5C基因的表达，mRNA的下调程度达到2～4倍，蛋白表达明显得到抑制；同时其能有效抑制肿瘤性T细胞的增殖。本发明所提供的siRNA对于开发新的抗T细胞肿瘤基因药物和提高T细胞肿瘤的治疗效果有重要的意义，具有很大的应用前景和经济价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一种siRNA，特别涉及一种靶向抑制PPP2R5C基因表达和肿瘤 T细胞增殖的PPP2R5C-siRNA991及其应用。

背景技术

血液肿瘤是发病率较高的恶性肿瘤之一，每年全国约有10万初发病人，严 重危害人们、尤其是青少年的健康。T细胞肿瘤是血液肿瘤的一种主要类型， 主要由于T细胞恶性克隆增殖而形成，包括多种类型的T细胞白血病和淋巴瘤， 多数恶性程度高，治疗效果差，预后不良。临床治疗上一直存在难治疗、耐药 和易复发等难题，因此寻找更有效和特异的治疗方案一直是研究者的一个重要 目标。随着对肿瘤细胞分子特点的逐渐明确，不断发现肿瘤T细胞特异的分子， 设计和研制有效的靶向治疗药物，成为提高T细胞肿瘤治疗效果的一个重要手 段。

PPP2R5C基因是在1996年被发现并克隆出来的。是蛋白磷酸酶2A(PP2A) 的一个亚单位，在调节细胞增殖、分化和转化等过程中具有重要作用，目前研 究认为其属于一种抑癌基因。近期研究提示其表达模式的改变与细胞恶性转化 相关，我们的前期研究也发现PPP2R5C在T细胞肿瘤中有异常高表达情况。

近年来，利用RNA干扰技术，将化学合成的小干扰RNA(small interfering  RNA，siRNA)转导至特定的细胞，沉默相关基因的表达，是研究基因功能最 有效的手段之一，也是靶向基因治疗最有吸引力的方法之一。选择特异性的靶 基因合成有效的siRNA，并且选择合适转染方式，使其在宿主细胞中高效作用， 是实施这一靶向治疗措施的重点。靶向针对PPP2R5C基因的siRNA序列对于 开发新的抗T细胞肿瘤基因药物和提高T细胞肿瘤的治疗效果有重要的意义， 具有很大的应用前景和经济价值。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种靶向抑制PPP2R5C基因表达和肿瘤T细胞 增殖的siRNA，名称为PPP2R5C-siRNA991。

本发明的另一目的在于提供上述PPP2R5C-siRNA991的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种靶向抑制PPP2R5C基因表达和 肿瘤T细胞增殖的PPP2R5C-siRNA991，核糖核苷酸序列如下所示：

正义链5’-CAGUG GUGAU GGCAC UUCUC AAAUA-3’

反义链5’-UAUUU GAGAA GUGCC AUCAC CACUG-3’。

所述的靶向抑制PPP2R5C基因表达和肿瘤T细胞增殖的 PPP2R5C-siRNA991用于制备抑制PPP2R5C基因表达的制剂。

所述靶向抑制PPP2R5C基因表达的siRNA应用于制备治疗T细胞肿瘤的 药物。

所述T细胞肿瘤为T细胞白血病。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明所提供的PPP2R5C-siRNA991能高效抑制PPP2R5C基因的表达， mRNA的下调程度达到2～4倍，蛋白表达明显得到抑制，如图2和图3所示。

2、本发明所提供的PPP2R5C-siRNA991能有效抑制肿瘤性T细胞的增殖， 如图4所示。

3、本发明所提供的PPP2R5C-siRNA991对于开发新的抗T细胞肿瘤基因药 物和提高T细胞肿瘤的治疗效果有重要的意义，其具有很大的应用前景和经济 价值。

附图说明

图1是实施例1中通过流式细胞仪检测Molt-4细胞转染效率图，其中：

A为转染Alexa Red Oligo的柱形图；

B为对照组的柱形图。

图2是实施例2的实验组和对照组的实时定量PCR结果图。

图3是实施例2的实验组和对照组的PPP2R5C蛋白水平变化Western Blot 图(RNA干扰后48h)。

图4是通过Annexin V/PI双染后流式细胞仪得到的实验组和对照组的细胞 凋亡图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方 式不限于此。

实施例1

siRNA的合成和转染T淋巴细胞白血病细胞株(Molt-4)(购自中科院上海 细胞所)细胞条件的稳定，具体步骤如下：

(1)设计和得到siRNA

在GenBank(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)里查找PPP2R5C基因 序列(ACCESSION NM_178587)，然后根据Invitrogen公司(www. invitrogen.com)提供的Stealth^TMRNAi设计法则，在线设计针对PPP2R5C的 siRNA。本发明所涉及的靶向抑制PPP2R5C基因表达的siRNA是从PPP2R5C 基因序列991bp开始的25nt siRNA(称为siRNA-991)，同时设计与目的基因序 列无同源性的无关序列siRNA(non-silencing scrambled control，SC，25nt)为 对照组，siRNA均由美国Invitrogen公司化学合成。

siRNA-991的序列如下：

正义链序列：5’-CAGUGGUGAUGGCACUUCUCAAAUA-3’；

反义链序列：5’-UAUUUGAGAAGUGCCAUCACCACUG-3’。

无关序列siRNA的序列如下：

正义链序列：5’-UAGUCUACCUAGCUUAACCCAGUAA-3’；

反义链序列：5’-UUACUGGGUUAAGCUAGGUAGACUA-3’。

(2)准备处于对数生长期的Molt-4细胞

将Molt-4细胞接种于含体积分数10％新生牛血清、100U/mL青霉素和 100U/mL链霉素的RPMI1640培养基中，在含体积百分数5％CO₂的培养箱37℃ 连续培养，2～3天传代一次，得到处于对数生长期的Molt-4细胞。

(3)PPP2R5C-siRNA991转染Molt-4细胞

A、收集2.5×10⁶个Molt-4细胞，200g离心10min，完全去除上清；

B、用100μl预热至室温的Nucleofector^TM Solution和Supplement混合液 (Amaxa，德国)悬浮细胞；

C、加入100nM Alexa Red Oligo(Invitrogen，美国)，混匀后加入核转杯 (Amaxa，德国)，启动Molt-4特异性程序C-005；同时设置对照组，对照组为与 转染Alexa Red Oligo的步骤相同，但是没有加入Alexa Red Oligo；

D、程序完成后立刻用核转染试剂盒(Amaxa，德国)里配套的移液器将转 染后的细胞液接种于培养瓶中，终体积为5ml；

E、放入培养箱10小时后利用荧光显微镜和流式细胞仪检测荧光值，分析转 染效率。

通过荧光显微镜和流式细胞仪检测的结果如图1所示，可见通过上述转染 方法的转染效率稳定在56.2±14.14％。

实施例2

将siRNA-991转染Molt-4细胞后，检测PPP2R5C基因在mRNA和蛋白水 平的表达，明确其干扰效应。

(1)实验分组：实验组为转染siRNA-991，对照组分别为无关序列对照组 (SC)、转染条件对照组(MOCK)和空白对照组(NC)，实验方法同实施例 1步骤(3)，各组的siRNA量均为3μg。转染条件对照组系不加入siRNA，其 余处理条件同实验组，空白对照组是未经任何实验处理的细胞。

(2)荧光实时定量PCR检测：分别收集各组转染后24h、48h和72h的细胞， 按照TRIZol试剂盒(invitrogen，USA)说明书操作步骤提取RNA，并使用AMMLV (promega，USA)和OLIGO dT合成cDNA(根据AMMLV的说明书操作)。应用 于荧光实时定量PCR的引物序列见表1，以β2M基因作为内参照。总反应体积为 20μl，包括Real Master Mix 9μL，上、下游引物的终浓度分别为0.5μmol/L以及1μl cDNA。在95℃、3min变性后，共进行40循环扩增，每一循环包括95℃、10s和 62℃、30s。采用相对定量法(2^ΔCt×100％，ΔCt＝Ct_目的基因-Ct_内参基因)计算 PPP2R5C mRNA的相对表达量。结果显示，转染后24h、48h和72h，与各对照组 相比，siRNA-991组PPP2R5C的mRNA表达水平均明显下调，下调倍数约为2～4 倍不等(如表2和图2所示)。

表1应用于实时定量PCR的引物序列

表2：实时定量PCR检测转染后PPP2R5C基因mRNA水平变化

*：P＜0.05  siRNA-991 VS 其余各组

(3)蛋白水平检测：分别收集转染后48h和72h的细胞，应用蛋白裂解液 试剂盒，提取总蛋白，Western blot ECL发光法显影成像、分析转染后各组 PPP2R5C蛋白水平的表达情况。具体方法如下：

A、收集各组不同时间段的细胞，数目为1×10⁶个，用RIPA蛋白提取试剂 盒(碧云天，上海)提取总蛋白；

B、SDS-PAGE电泳：将各组样品按常规方法定量并变性后加样于10％的 SDS-PAGE胶中(每孔加样量约为30μg)，恒压80V，30min后改为100V， 60min；

C、转膜：将切好的PVDF膜(PALL，美国)和脱脂棉预先泡在转膜液中 15～30min，用半干转仪(Bio-Rad，美国)按照安全盖+电转盖+脱脂棉+ SDS-PAGE胶+PVDF膜+脱脂棉+电机板的顺序从上向下排列，恒压10V， 25min；

D、封膜：用浓度为30g/L脱脂奶粉作为Blocking Reagent(封闭试剂)封膜 2h后用0.05％PBST洗涤液{500μl吐温-20(SIGMA，USA)+1L PBS，PBS的浓度 为0.01mol/L、pH值为7.4}洗涤3次，每次5min。

E、一抗、二抗的孵育：将PVDF膜按所需要的蛋白分子量大小(β-actin为 42kD，PPP2R5C蛋白为61kD)和预染Marker的位置剪成两条，分别放入体积 比1∶500的小鼠抗人β-actin一抗(武汉博士德公司)和1∶200的兔抗人PPP2R5C 一抗(Santa，美国)4℃过夜，或37℃1h后用0.05％PBST洗涤液洗涤3次， 每次5min。再分别放入1∶500的羊抗小鼠和羊抗兔二抗(eBioscience，美国) 37℃孵育1h，用0.05％PBST洗涤液洗涤3次，每次5min；

F、ECL显色：通过ECL显色试剂盒显色(碧云天，上海)，经化学发光后 观察内参β-actin和目的蛋白PPP2R5C的表达量，最后利用UVI Alliance 4.7凝 胶成像仪(UVI，UK)进行拍照，根据实验结果调整曝光时间。

Western blot结果(见图3)显示，与各对照组相比，转染后48h后siRNA-991 组PPP2R5C蛋白水平表达均明显下调，，与SC组相比，蛋白表达明显得到抑制 即本发明提供的靶向抑制PPP2R5C基因表达的siRNA能有效下调Molt-4细胞 中PPP2R5C基因的表达

实施例3

此实施例表明了siRNA-991下调Molt-4细胞PPP2R5C表达后所产生的生 物学效应。包括形态学变化、细胞增殖和凋亡和细胞周期的变化等。

(1)形态学变化：各组取约1×10⁴细胞，按Hoechst 33258试剂盒(碧云 天，上海)操作步骤进行核染色，染色后用荧光显微镜观察细胞形态。结果显 示siRNA-991组细胞呈明显的细胞凋亡形态学改变：细胞核呈致密浓染，或呈 碎块状致密浓染，而其余各对照组细胞核呈正常的蓝色。

(2)CCK-8法检测细胞增殖情况：转染结束立即取各组细胞约1×10⁴个， 每组平行取3孔，放入培养箱中72h后加入10μl的CCK-8溶液(同仁化学研究 所，日本)，37℃孵育2h后于450nm(SYNERGY4全自动酶标仪，Bio-TEK， USA)处检测各组OD值，计算抑制率。结果显示，与各对照组相比，siRNA-991 组可以明显抑制细胞的增殖(如表3所示)。

表3：CCK-8法检测转染72h后对Molt-4细胞增殖的影响

*：P＜0.05 siRNA-991 VS其余各组

(3)流式细胞仪检测细胞凋亡情况：转染72h后取各组细胞约1×10⁵个， 用预冷(4℃)的PBS(浓度0.01M，pH 7.4)洗涤细胞2次，1ml Annexin V-FITC 结合缓冲液洗细胞2次，离心(1000rpm，5min)去上清，加入200μl Annexin V-FITC结合缓冲液，重悬细胞后，分别加入10μl Annexin V和5μl PI溶液，轻 轻混匀，避光反应30min，立即上机检测，Winmdi软件分析结果。结果显示， 与各对照组相比，siRNA-991组细胞早期和中晚期凋亡均有所增加(图4)。

上述实验结果说明了本发明提供的靶向抑制PPP2R5C基因表达的siRNA 具有明显的抑制T淋巴肿瘤细胞增殖、同时也有一定的诱导T淋巴肿瘤细胞凋 亡的功能。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施 例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替 代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。