一种猪TLR4基因T611A碱基突变的检测方法

摘要

本发明涉及一种猪

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种猪TLR4基因T611A碱基突变的检测方法，属基因工程技术领域。 用此方法，能快速检测到猪TLR4基因的单核苷酸碱基突变，为猪免疫防御系统受体基因 分子结构、功能研究提供帮助。

(二)背景技术

Toll样受体(TLRs)作为重要的模式识别受体，通过对病原体相关分子模式(PAMPs) 的识别及信号级联反应，介导机体的天然免疫和获得性免疫，是机体抵抗感染的第一道 屏障；TLRs基因变异导致宿主对革兰阳性菌、阴性菌的反应能力丧失，改变机体对病原 的抗性或易感性。

TLR4在病原微生物跨膜信号传导具重要作用，研究已证实TLR4是机体对LPS免疫 应答的主要受体，敲除该基因的小鼠对细菌性病原的刺激应答明显减弱，TLR4基因缺陷 小鼠对病毒的抵抗能力降低。

目前有关猪TLR4基因的SNP检测偶见报道，但基本局限在个别外显子的单个碱基 突变。本发明根据GenBank数据库猪TLR4基因序列设计引物，对中外不同品种猪TLR4 基因整个编码区进行特异性PCR扩增，找寻可能存在的单核苷酸碱基突变，并分析碱基 突变导致的编码氨基酸及蛋白活性、基因功能的改变，为猪Toll样受体与机体免疫力的 关系研究奠定基础，同时，为猪抗病育种研究提供基因工程技术帮助。

(三)发明内容

技术问题

本发明的目的在于提供一种猪TLR4基因T611A碱基突变的检测方法，有助于研究猪 TLR4基因的分子结构、功能及机体抗病原免疫模式和机理，为猪疫病防控及抗病育种提供 依据。

技术方案

一种猪TLR4基因T611A碱基突变的检测方法，包括：

设计猪TLR4基因序列特异性扩增引物，对猪模板cDNA进行PCR扩增；分离、纯化 特异性扩增产物进行核酸序列测定、比对，找寻不同检测个体TLR4基因存在的单核苷酸 碱基突变，分析基因突变导致的编码氨基酸及蛋白活性、功能的改变。其特征在于如下步 骤：

步骤一，据GenBank数据库猪TLR4基因序列设计特异引物：

正义引物5′-TTTCTAACCTGCCCAACCTG-3′

反义引物5′-GAACCAGCCAGACCTTGAAT-3′

应用上述对待检测猪模板cDNA进行PCR扩增。

PCR扩增反应体系(12μl)：10×PCR buffer 1.2μl，2mM/L dNTPs 1.2μl，25mM/L MgCl₂0.8μl，10pmol/μl primer 1.0μl，5U/μl Taq polymerase 0.2μl，50ng/μl DNA 0.8μl，ddH₂O 6.8μl；

反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，34个 循环；72℃延伸8min；

其中，扩增片段长度为247bp。

步骤二，对特异性扩增产物进行分离、纯化，获得特异核酸；

步骤三，对分离纯化的扩增产物进行序列测定、比对分析，得出待检猪TLR4基因是 否存在T611A单核苷酸碱基突变。

有益效果

本发明根据GenBank数据库猪TLR4基因序列设计引物，对中外不同品种猪TLR4 基因整个编码区进行特异性PCR扩增，找寻可能存在的单核苷酸碱基突变，并为猪Toll 样受体与机体免疫力的关系研究奠定基础，同时，为猪抗病育种研究提供基因工程技术 帮助。

本发明通过研究，确定了检测猪TLR4基因编码区T611A碱基突变合适的特异引物 SEQ ID NO：1-2，优化的PCR扩增程序和条件，明确了猪TLR4基因有效的单核苷酸突变 碱基及相应的编码氨基酸改变，分析碱基突变导致的编码氨基酸及蛋白活性、基因功能的 改变，为TLR4受体基因遗传变异导致分子结构及功能变化提供理论依据，同时，为TLR4 作为免疫模式受体基因发生变异而引起机体对部分传染性疾病免疫能力的改变等研究提 供技术支持。

(四)附图说明

图1：PCR扩增产物PAGE电泳示例

图2：突变点测序结果示例

(五)具体实施方式

本发明针对猪TLR4基因编码区的筛查，检测到猪该基因存在T611A单核苷酸碱基突 变，引起Leu204His编码氨基酸的改变。

针于猪TLR4基因碱基突变的检测技术较多，包括DNA直接测序、杂交测序、酶切测 序、DNA芯片技术、变性高效液相色谱等。较常规简易的实施方式为：

1、以GenBank数据库猪TLR4基因序列为模板，应用生物软件设计特异引物，如SEQ  ID NO：1-2，要求引物针对模板序列易扩增，特异性好。

2、对PCR反应体系和条件进行优化，检测产物浓度和质量；应用核酸纯化试剂盒， 割胶回收PCR扩增产物，测序。

3、用核酸分析软件比对各样本产物序列，找寻单核苷酸碱基突变；分析突变性质及 由此引起的编码氨基酸、蛋白结构的变化。

用于本发明的测试样本没有特别限制，可以任何含有猪TLR4基因的核酸序列，对单 个突变位点，甚至可以从血液、组织等样品抽提DNA样本直接应用。

下面结合实施例进一步阐述本发明。本实施例仅用于说明本发明但不用于限制本发明 范围。实施例中未注明的具体实验条件和方法，通常按照常规条件进行，如分子克隆实验 手册所述条件或制造厂商建议条件。

实施例1

猪TLR4基因cDNA的获取及引物设计

用Trizol Reagent(Invitrogen)提取猪(长白猪，购自江苏常州康乐农牧有限公司猪场) 总RNA，紫外分光光度计检测核酸浓度及纯度；M-MLV反转录酶(Promega)及Oligo (dT)18(Promega)反转录cDNA；根据GenBank数据库猪TLR4基因序列(AB188301、 AJ628065)，用Primer 5.0设计特异引物，用于PCR扩增。引物序列为：

正义引物5′-TTTCTAACCTGCCCAACCTG-3′(SEQ ID NO：1)

反义引物5′-GAACCAGCCAGACCTTGAAT-3′(SEQ ID NO：2)

实施例2

PCR扩增及产物纯化

应用引物SEQ ID NO：1-2对待检测猪模板cDNA进行PCR扩增。

PCR扩增反应体系(12μl)：10×PCR buffer 1.2μl，2mM/L dNTPs 1.2μl，25mM/L MgCl₂0.8μl，10pmol/μl primer 1.0μl，5U/μl Taq polymerase 0.2μl，50ng/μl cDNA 0.8μl，ddH₂O 6.8μl；

反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，34个 循环；72℃延伸8min；

其中，PCR扩增片段长度为247bp(图1)。应用核酸纯化试剂盒，参照厂商提供方案 对PCR扩增产物进行分离、纯化。

实施例3

测序及单核苷酸多态检测

对纯化的猪TLR4基因SEQ ID NO：1-2引物PCR扩增产物直接测序，比对不同样本PCR 产物测定序列。结果，在被检测的10头长白猪实验样本中，TLR4基因cDNA序列第611 位点表现为6个T、4个A，揭示实验猪在TLR4基因编码区第611位点存在T/A单核苷酸 碱基突变(图1、2)。

而且，猪TLR4基因第611位点的T611A突变，直接导致编码氨基酸出现Leu204His 改变，氨基酸性质随之发生变化，造成TLR4基因功能域超螺旋结构的改变，影响TLR4 作为模式识别受体对特异病原的免疫应答，进而表现对特定疾病具备不同的免疫能力。为 猪疫病防控及抗病育种提供依据，同时，为猪抗病育种研究提供基因工程技术帮助。

应当明确，在阅读本发明上述讲授内容后，相同领域技术人员可以对本发明作出各种 技术修改，其等价形式同样属于本申请所附权力要求书限定范围。

SEQUENCE LISTING

 

 

<110>  江苏省农业科学院

 

 

<120>  一种猪TLR4基因T611A碱基突变的检测方法

 

 

<130>  0

 

 

<160>  2    

 

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

 

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

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<221>  正义引物

<222>  (1)..(20)

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<400>  1

tttctaacct gcccaacctg                                                 20

 

 

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<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

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<221>  反义引物

<222>  (1)..(20)

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<400>  2

gaaccagcca gaccttgaat                                                 20