一种检测降钙素原的试剂盒及降钙素原的检测方法

摘要

本发明公开了一种检测降钙素原的试剂盒，包括发光底物、磁微粒偶联抗体、生物素化抗体和酶标记物，所述酶标记物是辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，所述抗体为降钙素原单克隆抗体。本发明试剂盒以磁微粒偶联抗体作为固定分离相，生物素-链霉亲和素多级放大体系，用辣根过氧化物酶为催化酶催化发光底物发光，提高了试剂的检测灵敏度和准确性。

说明书

技术领域

本发明涉及免疫分析领域，特别是涉及一种检测降钙素原的试剂盒及降钙素原的检测方法。

背景技术

近些年来，对全身性感染的病理、生理过程有了更多了解，支持强化治疗也获得显著改善，但在非心脏重症监护病房中患者的首位死因仍然是全身性感染及其并发症，美国每年大约有500000例全身性感染患者，约40％最终死亡。因此，需要一种标记物能更有效地反映感染导致的炎症损伤程度。降钙素原(procalcitonin，缩略词为PCT)是具有高灵敏度、特异性的新指标，它在细菌或真菌感染合并严重全身系统反应或器官低灌注时显著升高，而在病毒或局灶感染时水平正常或轻度升高，这个特性使得PCT用来鉴别系统感染和非感染性炎症或局灶感染。 

PCT是人类降钙素的前体物，来自定位于第11号染色体上(11p15，4)的单拷贝基因，该基因由2800个碱基对组成，含6个外显子和5个内含子，基因全长M_r约7600，转录后在甲状腺滤泡旁细胞粗面内质网内翻译而成，PCT由116个氨基酸残基组成，相对分子量为13KD，包括N端84个氨基酸、具有激素活性的降钙素(CT，32肽)和降钙蛋白(katacalcin，21肽)三部分，PCT作为一种糖蛋白但无激素活性，在正常情况下，具有激素活性的降钙素是在甲状腺滤泡旁细胞产生与分泌，并由细胞内特殊蛋白酶分解PCT成降钙素。

正常健康人体内PCT水平很低(<0.05ng/mL)，血清PCT浓度≤0.5ng/mL出现重症败血症和／或败血症休克的风险较低；血清PCT浓度≥2ng/mL出现重症败血症和／或败血症休克的风险较高。在细菌感染(特别是脓毒血症、革兰阴性杆菌)引起的全身炎症反应时血清PCT水平常显著增高，其增高程度与感染严重程度和死亡率呈正相关，在全身细菌感染患者血清PCT浓度升高比C-反应蛋白（CRP）及其它炎性因子出现早，在感染2h出现升高，6h急剧上升，8～24h维持高水平，且对全身与局部细菌性感染的鉴别具有特殊价值，在非细菌感染时血清PCT浓度不升高。PCT在血中半衰期为22～29h，检测不受临床用药影响，在全身严重细菌感染、败血症及多种器官功能失调综合征的辅助诊断方面， PCT是一个具高灵敏度、高特异性的新指标，不仅能早期鉴别细菌与非细菌感染，更是败血症的预警和诊断指标，且PCT与细菌感染的程度成正相关，因此越来越受到临床重视。

PCT作为一种新的、具有创新意义的严重细菌性感染等疾病的实验指标，提高了临床诊断的准确性，为重症监护、放化疗、服用免疫抑制剂或器官移植等患者合并发热时提供了极其重要的诊断、进一步的检查和治疗的临床依据：PCT可广泛应用于ICU病房、血液科、肿瘤科、儿科、早产儿及新生儿监护室、外科、内科、器官移植科、急诊科、介入诊断和治疗实验室等。

目前用于检测PCT的方法主要有放射性免疫分析法（RIA）、酶联免疫吸附试验（ELISA），胶体金免疫层析法（GICA）和化学发光免疫分析法（CLIA）。RIA有很高的检测灵敏度，但由于标记物具有放射性危害，标记物稳定性差，废弃物难以处理等缺点，已逐渐退出临床检验领域；ELISA法采用辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，缩略词为HRP)或碱性磷酸酶标记抗体，并催化底物产生颜色变化，具有操作简单，试剂稳定期长的特点，但ELISA法的检测灵敏度较低，目前主要应用于传染性疾病筛查等对检测灵敏度要求较低的项目；GICA具有操作简单，检测速度快等优点，但也存在灵敏度低，试剂不稳定，重复性较差，难以进行定量的缺点。

从免疫诊断技术的发展看，CLIA将是取代ELISA方法的主流分析技术。CLIA是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化，形成一个激发态的中间体，当这种激发态中间体回到稳定的基态时，发射出光子，利用发光信号测量仪器测量光子数。目前市场出现的用于PCT检测的CLIA主要有以下两种：一是吖啶酯直接标记发光法，利用双抗体夹心法检测血清或血浆中的PCT的含量，两株针对PCT的鼠单克隆抗体，其中一株针对PCT的抗体包被反应管或板孔，另一株抗体标记发光物质，与样本中的PCT形成夹心复合物，发光物质在一定pH值下发光，被检测器检测到发光信号；二是中国专利申请CN 101029897A公开的一种检测降钙素原的试剂盒及其测试方法，该方法以两株针对PCT的单克隆抗体为基础，其中一株单克隆抗体直接标记发光物质异鲁米诺衍生物，另一株抗体标记FITC（Fluorescein Isothiocyanate，异硫氰酸荧光素的简称），磁微粒偶联羊抗FITC抗体，经过免疫反应，形成磁微粒-羊抗FITC抗体-FITC抗体-PCT-发光标记抗体复合物，在碱性环境下，发光标记物发出光子，由检测器检测到发光信号。以上两种方法的共同点都是采用抗体标记发光物质直接发光，主要区别是，一种采用普通的管式或板孔式直接包被，另一种采用磁微粒作为固定分离相。

生物素-亲和素系统应用于化学发光试剂领域，明显的提高了试剂的检测灵敏度水平。生物素（又称维生素H）相对分子质量为244.31，呈环形结构，分为I环和II环，I环是亲和素结合的主要部位，II环是标记抗体和酶的唯一结构，可有效结合不同的抗原或抗体等蛋白。链霉亲和素（Streptavidin，缩略词为SA）是一种略偏酸性蛋白，其相对分子质量为65000，由4条相同的肽链构成，每个肽链可以结合1个生物素分子，即1个SA分子可以结合4个生物素分子，所以采用生物素与多种标记物结合起到有效的生物放大作用，其生物素化形成的许多“触角”的多价试剂，使整个反应系统出现多级放大反应，对检测物的检测具有极高的灵敏度，且反应速度比较快，表现出了极佳的性能。目前，对于PCT的检测，市场上已经出现了应用生物素-亲和素系统的电化学发光产品，该产品采用SA标记磁微粒，两株针对PCT的单抗，其中一株标记生物素与SA结合，另一株标记三联吡啶钌作为发光标记物，三联吡啶钌在电场加压下，发生电化学发光反应，发出620nm的光子。

以上检测PCT的方法存在以下缺点：1）采用吖啶酯或异鲁米诺直接标记抗体（或抗原）的发光效率低，标记物不稳定，这种直接标记法都属于瞬间发光型（即整个发光过程在不到1s内完成），很难保证结果的重复性，且需要复杂、精确的原位检测机构，增加了检测仪器的设计难度；2）反应管或发光板孔直接包被作为固定相，具有内表面积有限，无法达到更高的抗体包被密度，限制了灵敏度的提高，另整个免疫反应过程近似从液相扩散到固相，导致整个免疫过程非常缓慢，延长了反应时间；3）应用生物素-亲和素系统检测PCT的电化学发光产品，目前都属国外进口产品，该产品属于电极激发发光反应，电极激发和检测模块设计复杂，且试剂盒采用封闭式全自动电化学发光体系，需要昂贵的全自动电化学发光检测仪器。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：弥补上述现有技术的不足，提出一种检测降钙素原的试剂盒及降钙素原的检测方法，具有检测灵敏度高，特异性好，检测过程较简单，不需要复杂仪器等优点。

本发明的技术问题通过以下的技术方案予以解决：

一种检测降钙素原的试剂盒，包括发光底物、磁微粒偶联抗体、生物素化抗体和酶标记物，所述酶标记物是辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，所述抗体为降钙素原单克隆抗体。

优选的，所述生物素化抗体为生物素N羟基丁二酰亚胺酯与降钙素原单克隆抗体的偶联产物。 

优选的，所述磁微粒大小为200nm～5μm，磁微粒表面的活性基团为-COOH或-NH₂。

优选的，所述磁微粒表面的活性基团为-COOH。

优选的，所述磁微粒偶联抗体中用于偶联的磁微粒的浓度为1~10mg/mL，用于偶联的抗体的浓度为1～5mg/mL。

优选的，所述磁微粒偶联抗体的保存液为PBS缓冲液和牛血清白蛋白的混合液。

优选的，所述发光底物包括A液和B液，所述A液主要是鲁米诺与增强剂，或异鲁米诺与增强剂，所述B液主要为氧化剂。

优选的，所述试剂盒还包括用于稀释所述生物素化抗体和酶标记物的稀释液；或所述生物素化抗体和酶标记物溶解在所述稀释液中混合成工作液，所述工作液中，所述酶标记物与所述工作液的体积比为1：2500～1：5000，所述生物素化抗体与所述工作液的体积比为1：1500～1：3500。

优选的，所述试剂盒还包括降钙素原标准品和洗涤液中的至少一种。

一种使用上述任意一项的试剂盒进行降钙素原检测的方法，包括如下步骤：

(1) 分别将所述酶标记物和生物素化抗体稀释后混合得到工作液，所述工作液中，所述酶标记物与所述工作液的体积比为1：2500～1：5000，所述生物素化抗体与所述工作液的体积比为1：1500～1：3500；

(2) 分别将所述工作液、磁微粒偶联抗体溶液和发光底物在室温下平衡至少30min； 

(3) 在反应容器中加入50μL待测血清和100μL所述工作液，混匀后37℃反应20min后继续以下步骤，或者混匀后直接进行以下步骤：

(4)在步骤(3)的混合溶液中加入50μL的所述磁微粒偶联抗体溶液，混匀，于37℃反应10~30min，形成磁微粒偶联抗体-降钙素原-生物素化抗体-酶标记物复合物，磁性分离，弃去上层未反应的液体，得到下层的所述复合物，洗涤所述复合物后混匀，置于磁性分离器中，分离3min，弃去洗涤液上清液，重复洗涤直到未反应的液体去除干净，以去除未结合的反应物；

(5)将所述发光底物中的A液和B液等体积混合后加入步骤(4)中的所述复合物中，混匀放入化学发光检测仪，检测发光强度值;

(6)根据所述发光强度值与降钙素原的浓度的比例关系计算得到所述待测血清中的降钙素原浓度值。

本发明与现有技术对比的有益效果是：本发明的方法属于磁微粒酶促化学发光法，以磁微粒偶联抗体作为固定分离相，生物素-链霉亲和素多级放大体系，用辣根过氧化物酶为催化酶催化发光底物发光，提高了试剂的检测灵敏度和准确性；具体具有如下优点：1）采用生物素-链霉亲和素多级放大体系，链霉亲和素与生物素的结合，虽不属于免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定，由于1个链霉亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体，因此把生物素-链霉亲和素系统与高灵敏度的化学发光法结合起来，可以大大提高化学发光试剂产品的敏感度，实现pg级别甚至更低水平的检测灵敏度；2）磁微粒偶联抗体作为固定分离相，具有更大的抗体包被表面积，增大了与被检测物的接触几率，整个免疫反应均在近似液态中进行，能大大缩短反应时间，可以缩短到板式或管式试剂所需时间的1/5～1/2；3）用辣根过氧化物酶为催化酶催化发光底物发光，与发光底物直接标记抗体相比具有发光效率高，发光时间长，发光平台期在30分钟以上，避免了直接标记发光效率降低，稳定性差的问题，且对检测仪器的要求降低，可应用于半自动的检测仪器，也可实现全自动仪器检测；实验证明，生物素-链霉亲和素的化学发光法结合免疫磁微粒固定分离体系是一种检测PCT的有效方法，可以实现对血清中PCT浓度的检测。

附图说明

图1是本发明实施例二采用二步法检测PCT时的标准曲线及曲线方程；

图2是本发明试剂盒与Biomérieux PCT试剂盒的检测结果相关性比较。

具体实施方式

下面对照附图并结合优选具体实施方式对本发明进行详细的阐述。

在一个实施例中，检测降钙素原的试剂盒，包括发光底物、磁微粒偶联抗体、生物素化抗体和酶标记物，所述酶标记物是辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，所述抗体为降钙素原单克隆抗体。

以下通过更优选的实施例进行详细说明，本发明中的百分比如无特别说明，均为体积分数。

实施一：

1. 磁微粒偶联抗体的制备

试剂盒中的磁微粒偶联抗体用作固定分离相，磁微粒偶联抗体中的抗体为降钙素原单克隆抗体，用于偶联的磁微粒的浓度为1~10mg/mL，用于偶联的抗体的浓度为1～5mg/mL，磁微粒大小为200nm～5μm，磁微粒表面的活性基团为-COOH或-NH₂，通过化学交联试剂活化磁微粒，使之分别与降钙素原单克隆抗体的-NH₂或-COOH基团共价结合，形成稳固的磁微粒结合物，本实施例首选活性基团为-COOH的磁微粒，-COOH基团的磁微粒在化学交联剂EDC（碳二亚胺）作用下，与降钙素原单克隆抗体的-NH₂基团形成酰胺键而共价结合，磁微粒偶联抗体保存在PBS缓冲液和牛血清白蛋白的混合液中，参与免疫反应后，在磁场的作用下，与未结合的其他组分分离。

取-COOH活性基团的磁微粒5mg，置于磁分离器上4min，弃去上清液；加入0.1mol/mL PBS缓冲液3mL，吹打均匀，置于磁分离器上分离4min，弃去上清液，重复洗涤2次。清洗完毕后，加入10mg/mL EDC溶液（pH 7.0）1500μL活化磁微粒，吹打均匀后，置于振荡器上，反应30min~1h。然后加入PCT单克隆抗体进行偶联，PCT单克隆抗体用10mmol PBS 缓冲液溶解，向活化后的磁性微粒中加入1 mg/mL PCT单克隆抗体溶液500μL，置于振荡器上反应3～6 h；偶联完成后，加入1 mol／L甘氨酸3mL封闭磁微粒表面的-COOH，混匀后，置于振荡器上反应30 min；加入0.1mol/mL PBST缓冲液3mL，混合均匀，置于磁分离器上分离，弃去上清液，重复洗涤2次；最后加入0.1mol/mL PBS和0.5%牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，缩略词为BSA）的保存液复溶，使磁微粒偶联抗体的浓度为0.5～2mg/mL，置于4℃备用。

2. 生物素化抗体的制备

由于生物素是小分子物质，不能直接与抗体进行偶联，需要经过修饰之后，才能与蛋白偶联，本实施例优选N-羟基丁二酰亚胺酯修饰生物素后形成生物素N羟基丁二酰亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，缩略词为BNHS），再与PCT单克隆抗体偶联。用于偶联生物素的PCT单克隆抗体与偶联磁微粒的PCT单克隆抗体为针对PCT不同表位的抗体。

（1）BNHS的制备：取生物素，N-羟基丁二酰亚胺和二环己基碳二亚胺各1mmol，一并加入二甲基甲酰胺溶液6mL中，室温（18～25℃）搅拌18h，过滤，滤液减压抽干，干燥物反复用乙醚洗涤后复溶于异丙醇，再用真空抽干法使浓缩成原量一半体积，置于低温冰箱中结晶，滤纸过滤，收集结晶物，用乙醚洗后即得到BNHS。

（2）抗体的生物素化：用0.1mol/L NaHCO₃溶液将PCT单克隆抗体稀释成1mg/mL的抗体溶液，每毫升抗体溶液中加入二甲基甲酰胺溶解的BNHS（20mg/mL）10μL，混匀，于室温（22℃）反应1h，在4℃环境中置于0.1mM PBS缓冲液中透析24h。

3. HRP标记SA

采用改进的过碘酸钠氧化法制备得到HRP标记SA：取HRP 5mg溶于蒸馏水0.5mL中，加入60mmol/L NaIO₄ 0.5mL，放置4℃，混合均匀，氧化30min，然后加入0.16mol/L乙二醇 0.5mL，再置4℃终止30min；加入SA 5mg，用0.05mol/L碳酸盐缓冲液透析，4℃过夜，加KBH₄（5mg/mL）0.3mL，置4℃终止3h，加与上述混合溶液等容积的饱和硫酸铵，4℃沉淀30min后用4000r/min离心15min。沉淀物用pH 7.4，0.02mol/L PBS缓冲液 0.5mL溶解，用PBS缓冲液透析除铵，完成后-20℃保存。

4. 生物素化抗体和链霉亲和素酶标记物混合液（以下简称工作液）的制备

（1）稀释液的制备

稀释液用于稀释生物素化抗体和酶标记物，稀释液的组成包括：50mM PB缓冲液（pH7.4），150mM NaCl，2.5%鱼明胶，1%BSA，0.1%Proclin 300。

可以在使用试剂盒时，才将稀释液用于稀释生物素化抗体和酶标记物，并按一定的浓度要求混合成工作液，或者也可以按一定的浓度要求，将稀释液稀释生物素化抗体和酶标记物并混合成工作液后存放在试剂盒中。

（2）工作液的制备

取步骤2制备得到的生物素化抗体和步骤3制备得到的HRP标记SA按照棋盘滴定法，选定使用浓度混合，分别用稀释液稀释生物素化抗体和HRP标记SA后混合得到工作液，工作液中，生物素化抗体与工作液的体积比可以为1：1500～1：3500，本实施例中为1：2000，HRP标记SA与工作液的体积比可以为1：2500～1：5000，本实施例为1：5000。

5. PCT标准品的制备

PCT标准品为基因重组的人降钙素原蛋白（即PCT重组蛋白），使用时，用马血清将PCT重组蛋白（蛋白纯度>95%）稀释成PCT标准品，稀释浓度为0ng/mL，0.2ng/mL，0.8ng/mL，6.25ng/mL，25ng/mL，50ng/mL，用于制作标准曲线。

6.洗涤液的配置

配置2L的洗涤液：十二水磷酸氢二钠102g、二水磷酸二氢钠19.5、氯化钠 310g、吐温-20 20mL，用双蒸水定容至2L体积，加入0.1%防腐剂 Proclin300。使用时再稀释20倍使用。

7. 发光底物

发光底物包括A液和B液，其中A液主要为鲁米诺和增强剂，或异鲁米诺和增强剂，B液主要为氧化剂过氧化氢，使用时，将A，B液等体积混合使用。本实施例用的是商品名为SuperStar^TM ECL的发光底物，当然也可以用其它商业化产品。

使用本发明的试剂盒时，会形成一个磁微粒偶联抗体作为固相、分离试剂，生物素-链霉亲和素放大系统以及HRP-鲁米诺或异鲁米诺发光体系的检测系统。

实施例二：

降钙素原的检测方法，检测过程可采用一步法或二步法反应模式：一步法中，将工作液、待测血清和磁微粒偶联抗体溶液同时加入到反应管中，反应一定时间后，磁性分离并洗涤，加入发光底物，鲁米诺或异鲁米诺在HRP的催化下发出光子，由检测器检测到发光信号。二步法中，将待测血清和工作液先加入到反应管中反应一定时间，然后加入磁微粒偶联抗体溶液，一定时间后磁性分离并洗涤，加入发光底物，鲁米诺或异鲁米诺HRP的催化下发出光子，由检测器检测到发光信号。具体包括：

1）使用前，将工作液、磁微粒偶联抗体溶液、降钙素原标准品和发光底物在室温下平衡至少30min。

2）二步法检测

准备好需要数量的反应管，在一个反应管中加入50μL的待测血清，其他反应管中分别加入PCT标准品溶液（采用实施例1步骤5中PCT标准品的浓度），在每一个反应管中依次加入100μL的工作液，振荡混合均匀，放置37℃水浴中反应20分钟，形成PCT-生物素化抗体- HRP标记SA复合物，然后加入50μL的磁微粒偶联抗体溶液，37℃水浴反应10分钟，形成磁微粒偶联抗体-PCT-生物素化抗体- HRP标记SA复合物，在外加磁场作用下，磁微粒偶联抗体-PCT-生物素化抗体- HRP标记SA复合物被吸附在反应管底部，磁性分离，弃去上层血清中其他成分和未反应的成分，于反应管中加入用蒸馏水稀释20后的洗涤液400μL，充分混合均匀，置于磁性分离器中，分离3min，弃去洗涤液上清，重复洗涤5次直到未反应的液体去除干净。然后加入A和B液等体积混合后的发光底物100μL，充分混合均匀，放入到化学发光检测仪，5分钟后检测各管的发光强度值（relative light unit, 缩略词RLU）。如图1所示，以PCT标准品的不同浓度值为横坐标，相应的浓度的RLU为纵坐标，按照线性拟合建立标准曲线，得出曲线方程；将待测血清的RLU值带入曲线方程，可计算出待测血清中PCT的浓度值。

或者

2）一步法检测：

准备好需要数量的反应管，在一个反应管中加入50μL的血清样品，其他反应管中分别加入PCT标准品溶液（采用实施例1步骤5中PCT标准品的浓度），在每一个反应管中依次加入100μL的工作液，然后加入50μL的磁微粒偶联抗体溶液，混合均匀，于37℃水浴反应30分钟，形成磁微粒偶联抗体-PCT-生物素化抗体- HRP标记SA复合物，在外加磁场作用下，磁微粒偶联抗体-PCT-生物素化抗体- HRP标记SA复合物被吸附在反应管底部，磁性分离，弃去上层血清中其他成分和未反应的成分；于反应管中加入用蒸馏水稀释20后的洗涤液400μL，充分混合均匀，置于磁性分离器中，分离3min，弃去洗涤液上清，重复洗涤5次直到未反应的液体去除干净。然后加入混合后的反应底物A和B液100uL，充分混合均匀，放入到化学发光检测仪，5分钟后检测各管的RLU值。以标准品的不同浓度的值为横坐标，相应的浓度的RLU值为纵坐标，按照线性拟合建立标准曲线，得出曲线方程；将待测血清的RLU值带入到曲线方程，可计算出待测血清中PCT的浓度值。

二步法优于一步法。

实施例三：本发明试剂盒的方法学评价

1. 准确性

准确性测量是指用已知量PCT标准品加入到正常人的血清标本中，测量加入后浓度值与加入的理论值进行比较，计算PCT的回收率。检测结果如下：

2. 精密性

选取3份不同浓度的标本，分别按照本发明所述的方法重复测量20次。根据20次的测量结果，计算平均偏差C.V.%值。

3. 分析灵敏度

分析灵敏度的定义为：是指在统计学意义上能与零剂量区别的量。重复20次测量零剂量点，计算其平均值（X）和标准差（SD），以X+2SD的计算的浓度值即为该试剂盒的分析灵敏度。本发明试剂盒的分析灵敏度为0.05ng/mL。

 4．特异性

与降钙素（CT）和其他容易产生交叉反应的物质的反应值均在允许的范围内。

5. 相关性

  如图2所示，与Biomérieux（生物梅里埃）PCT化学发光试剂盒的相关性为：

   Y=0.8623X+0.3673

   R²=0.9891

本发明与现有方法和产品相比，具有检测灵敏度高、特异性好、成本较低，对检测仪器要求低的优点。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，做出若干等同替代或明显变型，而且性能或用途相同，都应当视为属于本发明的保护范围。