繁缕黄酮苷类提取物、其制备方法及制药用途

摘要

本发明涉及繁缕黄酮苷提取物，其含有以提取物重量计18.69-28.03 w/w％的芹菜素-6-C-β-D-半乳糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷和芹菜素-6-C-α-L-阿拉伯糖-8-C-β-D-半乳糖苷。本发明还涉及所述繁缕黄酮苷提取物的提取方法，含有该提取物的药物组合物及其用于制备降血脂药物的用途。

说明书

本申请是申请日为2006年7月14日、申请号为200610105623.0的同名申请的分案申请。 

技术领域

本发明涉及中药繁缕的黄酮苷提取物，其提取方法，含有该提取物的药物组合物及其用于制备降血脂药物的用途。 

技术背景

繁缕[Stellaria media(L.) Cyr.]是石竹科(Caryophyllaceae)繁缕属(Stellaria L.)植物，具有清热解，活血止痛，消肿等功效，主治痢疾，痈疮肿毒，乳痈，肠痈，疖肿，跌打损伤，产后瘀滞腹痛。 

繁缕为石竹科 Caryophyllaceae繁缕属 Stellaria L.植物繁缕Stellaria media(L.) Cyr.的全草。别名蔜(《尔雅》)、蘩蒌(《别录》)、滋草(《千金·食治》)、鹅肠菜、鹅儿肠菜(《纲目》)、五爪龙(《湖南药物志》)、狗蚤菜(《广西药植名录》)、鹅馄饨(苏医《中草药手册》)。繁缕属植物，全世界约120种，中国产63种15变种和2变型，原植物繁缕为常见田间杂草，广布全国(仅新疆、黑龙江未见记录)，亦为世界广布种。繁缕资源丰富，具有悠久的药用历史。多种医药古籍对繁缕均有记载，如《本草纲目》记载“活血，去瘀，下乳，催生。治产后瘀滞腹痛，乳汁不多，暑热呕吐，肠痈，淋病，恶疮肿毒，跌打损伤”；《药性论》记载：“主治产后血块，炒热和童子小便服”；《本草拾遗》：“主破血，下乳汁，下恶血”；《湖南药物志》：“止小便利，遗尿，洗手足风丹，遍身痒痛”；《贵州民间方药集》记载：″解热利尿，催生，催乳，活血去瘀。治跌打损伤，消伤肿，又治无名肿毒。贵州民间将其作为降血脂草药使用，效果较好。 

对繁缕的化学成分研究始于20世纪70年代。研究表明，繁缕中含有以黄酮(Budzianowski J.等人，Studies on the antioxidative activity of  some C-glycosylflavones， J.Pharmacol Pharm.，1991，43(5)：395；Kitanov G. Phenolic acids and flavonoids from  Stellaria media(L.) Vill.(Caryophyllaceae)， J.Pharmazie，1992，47(6)：470；陈兴荣等人，繁缕的黄酮类化学成分研究，现代中药研究与实践，2005，19(4)41；Budzianowski  J.等人，TwoC，O-glycosylflavones  from  Stellaria  media， J. Plate Med，1991，57(3)：290)、皂苷(Hodisan V等人，Triterpenoid saponins from Stellaria media(L.)Cyr， J. Farmacia，1989，37(2)：105)、甾体(陈兴荣等人，繁缕的黄酮类化学成分研究，现代中药研究与实践，2005，19(4)：41)、香豆素(Tsotsoriya G G，等人，Study of Stellaria media for its content of biologically active compounds[M].Russian：Tbilis Gos，Med Inst. 1977.172)、木脂素(Sun B等人，Bioactive constituents from Chinese natural medicines. XIV.New glycosides of beta-carboline-type alkaloid，neolignan，and phenylpropanoid from Stellaria dichotoma L.var.lanceolata and their antiallergic activities， J.Chemical and Pharmaceutical Bulletin，2004，52(10)：1194)、酚酸(Kitanov G.Phenolic acids and flavonoids from Stellaria media(L.) Vill.(Caryophyllaceae)，J. Pharmazie，1992，47(6)：470)、亚麻酸酯(HohmannJ等人，Monoacylgalactolipids from Stellaria media，J. Fitoterapia，1996，67(4)：381)等为主的多种化学成分。 

有关繁缕的现代药理学研究和临床应用方面的报道较少。其药理研究还很不充分，主要为解热、抗炎作用(王英华等人，引种与野生银柴胡化学成分比较研究，中国药学杂志，1991.26(5)：266)和抗氧化作用(Budzianowski J.等人，Studies on the antioxidative activity of some C-glycosylflavones， J. Pharmacol Pharm.，1991，435)：395)。 

从现有文献报导可见，尚无关于繁缕系统化学成分及其活性的研究报道，尤其是没有关于其降血脂活性成分的报道。 

发明内容

为阐明繁缕药理活性的物质基础，本发明人对繁缕进行了系统的 化学研究，得到了系列黄酮苷类化合物和其他成分。在此基础上，对其中的一个黄酮苷部位进行了降血脂药理活性试验、制备工艺和质量控制研究，并发现按照本发明所述工艺得到的繁缕的黄酮苷提取物能够明显地降低实验动物血液总胆固醇和甘油三酯水平，具有显著的降血脂作用，显示出良好的治疗高血脂相关疾病的广阔应用前景。基于以上发现，本发明得以完成。 

因此，本发明的一个方面涉及中药繁缕的黄酮苷提取物，其中包括以提取物重量计18.69-28.03w/w％的芹菜素-6-C-β-D-半乳糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷(化合物1)和芹菜素-6-C-α-L-阿拉伯糖-8-C-β-D-半乳糖苷(化合物2)。 

本发明的另一个方面涉及中药繁缕的黄酮苷提取物的提取方法。 

本发明的再一个方面涉及含有中药繁缕黄酮苷提取物及一种或多种药用载体或赋形剂的药物组合物。 

本发明进一步的一个方面涉及中药繁缕黄酮苷提取物用于制备降血脂的药物的用途。 

根据本发明的一个实施方案，以提取物重量计，本发明提取物中含有9.64-14.46 w/w％的芹菜素-6-C-β-D-半乳糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷。 

根据本发明的另一个实施方案，以提取物重量计，本发明提取物中含有9.05-13.57 w/w％的芹菜素-6-C-α-L-阿拉伯糖-8-C-β-D-半乳糖苷。 

根据本发明，所述的繁缕黄酮苷类提取物可按照图6的工艺路线获得： 

具体来说，将新鲜采集的繁缕全草晾干，揉碎。该揉碎药材用含水醇提取，过滤，得提取液。提取液浓缩，除去醇，水溶解后离心，得到上清液。上清液进行大孔吸附树脂柱层析，依次用水和极性有机溶剂洗脱，极性有机溶剂洗脱部位浓缩除去溶剂后冷冻干燥，即得到繁缕黄酮苷提取物。 

因此，本发明繁缕黄酮苷提取物的制备方法包括以下步骤： 

i)将繁缕药材用含水醇提取两次，合并提取液； 

ii)浓缩除去醇，得到浓缩液；水溶解后离心，得到上清液； 

iii)将上清液进行大孔吸附树脂柱层析，依次用水和极性有机溶剂洗脱，洗脱液浓缩后冷冻干燥，得到本发明繁缕黄酮苷提取物。 

根据本发明，上述工艺路线中所用的大孔吸附树脂可为任何型号的弱极性大孔吸附树脂；提取所用的醇可为任何低级链烷醇，如：甲醇、乙醇、正丙醇和异丙醇等，其中醇的浓度范围为5％-85 v/v％；大孔吸附树脂层析洗脱所用的极性有机溶剂为大孔树脂允许使用的任何有机溶剂，如：甲醇、乙醇、丙醇和丙酮等，其浓度范围为5％-95 v/v％。 

根据本发明，本发明的繁缕黄酮苷提取物可按如下方法定性鉴别： 

(1)α-萘酚反应(Molish反应) 

提取物以适量水溶解，加10％α-萘酚乙醇溶液三滴，然后沿试管壁缓缓加入浓硫酸，使形成上下两层，稍后在两层界面处可见紫色环，表示有苷类成分存在。 

(2)AlCl₃反应： 

提取物以适量水溶解，用毛细管点在层析纸上，喷洒1％ AlCl₃乙醇溶液显色，干燥后，黄色斑点于紫外荧光灯下显明显荧光，表示有黄酮成分。 

(3)FeCl₃反应： 

提取物以适量水溶解，取1ml于试管中，加入3滴3％ FeCl₃水溶液，溶液变为灰褐色，表示有酚羟基。 

(4)提取物中以上述化合物1和2为代表的黄酮苷类成分的定性检查： 

提取物适量10％乙醇溶解为待测液。以已经分离提纯的化合物1和2的10％乙醇溶液作为对照品。将待测液和对照液分别点样于聚酰胺层析薄膜上，以展开剂(乙醇/水，40∶60)展开，喷洒1％ AlCl₃乙醇溶液显色，紫外灯下观察，待测液中有与对照液相同Rf值的黄色荧光斑点。 

(5)繁缕黄酮苷提取物的HPLC-MS指纹图谱及其中主要成分的分析： 

液相色谱条件 

高效液相分离条件：乙腈-水(10∶90)；流速：1.2ml/mi n；柱温：室温(24℃)。 

质谱条件：负离子检测方式，Ion Spray离子源，源电压：-4000V，DP电压：-60V，FP电压：-290V，NEB：8，CUR：11。 

根据本发明，本发明的繁缕黄酮苷提取物可按如下方法定量鉴别： 

仪器与试剂 

高效液相色谱仪：HITACHI L-2130Pump、HITACHI L-2420UV-VIS Detector、天美T-2000L色谱工作站、Dikma Diamonsil C18色谱柱 (240×4.6mm，5μm) 

对照品：芹菜素-6-C-β-D-半乳糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷(对照品1)和芹菜素-6-C-α-L-阿拉伯糖-8-C-β-D-半乳糖苷(对照品2)均由本实验室分离纯化所得，并经现代光谱技术确定结构，HPLC面积归一化法测得其纯度在95.0％以上。 

试剂：甲醇(色谱纯)Fisher公司，水为去离子水。 

实验方法 

标准溶液的配制：精密称取黄酮对照品1和2各2.0mg，分别置于25ml容量瓶中，加入水溶解并定容至刻度，得各对照品溶液(0.08mg/ml)。 

称取黄酮对照品1和2各2.0mg，混合置于5ml容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，得混合标准样品。 

样品溶液的配制：精密称取繁缕黄酮苷提取物干燥品50.0mg，加入5ml 30％甲醇水溶解，过滤，取1ml，移至10ml容量瓶中定容至刻度，得样品溶液(1mg/ml)。 

实验色谱条件：柱温25℃，检测波长335nm，流速1.0ml/min。流动相为甲醇∶水＝35∶65(水中加入0.01％乙酸)，50mi n，这样混合标准样品中成分基本不受杂质干扰。 

峰的归属：以同样的流动相分析各对照品、混合标准样品及样品液，通过对照其保留时间来确定混合标准样品及样品液中各成分的相应峰位，结果见表1。 

表1.峰的归属 

  编号>  对照品(min)>  混合标准样品(min)>  品液(min)>  1>  13.94>  13.78>  13.92>  2>  18.91>  18.60>  18.88>

标准曲线：精密称取黄酮对照品1和2各5.0mg，混合后用甲醇水溶解定容于5ml容量瓶中为标准液。稀释成系列浓度作为代测液。在上述色谱条件下，取各待测液及标准液各20μl依次进样，计算标 准液和各待测液中各对照品的浓度，再分别计算出相应标准曲线。结果见表2(X代表峰面积，Y代表进样浓度μg/ml)。 

表2.对照品1、2的标准曲线 

  编号>  线形方程>  相关系数>  线形范围(μg)>  1>  Y＝3.12×10^-5X+5.47>  0.999703>  0.04-20>  2>  Y＝2.11×10^-5X+9.31>  0.999487>  0.04-20>

重现性实验：取混合标准样品，按上述色谱条件，每次进样20μl，重复5次，计算各组分的相对标准偏差(RSD)。结果见表3。 

表3.重现性实验结果 

精密度实验：取混合标准样品，按上述色谱条件，每次进样20μl，重复5次，计算各组分的相对标准偏差(RSD)。结果见表4。 

表4.仪器精密度实验结果 

稳定性试验：取同一样品溶液按色谱条件于0、1、2、3、4h进样，测定其中对应对照品1、2的化合物的含量，结果表明该样品溶液在4h内稳定性良好。 

回收率实验：精密称取繁缕黄酮苷提取物干燥品3份，每份20.0mg，分别加入对照品1和对照品2标准溶液1ml，用甲醇水溶解定容于25ml容量瓶中，得到3份待测液，各待测液依次进样20μl，计算添加回收率。结果表明对照品1、对照品2的平均回收率分别为105.33％和99.65％，RSD分别为1.91％和2.56％。 

繁缕黄酮苷提取物中两个主要黄酮化合物(化合物1和化合物2)的含量测定：精密称取繁缕黄酮苷提取物干燥品3份，每份15.0mg，加入10ml水溶解，过滤，取1ml，移至25ml容量瓶中定容至刻度，得样品溶液，按前面的色谱条件，每次进样20μl，测定各自峰面积，代入各自回归方程，计算其含量。 

实验结果 

在上述色谱条件下，分别对2个对照品进行HPLC分析，对照品1和2的保留时间分别为13.6-14.0和18.5-19.0mi n。结果见图5。 

对照品1的标准曲线方程为Y＝3.12×10^-5X+5.47，r＝0.999703，线性范围0.04-20μg.ml^-1；对照品2的标准曲线方程为Y＝2.11×10^-5X+9.31 r＝0.999487，线性范围0.04-20μg. ml^-1。 

样品含量测定结果表明，以提取物重量计，样品中对应对照品1和2的化合物1和2的平均含量范围分别为9.64-14.46 w/w％和9.05-13.57 w/w％，二者总和为18.69-28.03 w/w％。 

如前所述，根据本发明所述工艺得到的繁缕的黄酮苷提取物能够明显地降低实验动物血液总胆固醇和甘油三酯水平，具有显著的降血脂作用。 

根据本发明，本发明繁缕黄酮苷提取物可单独或以药物组合物的形式使用，给药方式可根据具体情况而定，并可根据需要按照药剂学领域的常规方法制成适合口服、直肠给药、肌肉注射等给药方式的剂型，如：片剂、胶囊、膏剂、贴剂、悬浮液，注射液，滴注液等剂型。 

本发明药物组合物中含有的载体或赋形剂包括药剂学常规应用的载体和赋形剂，例如填充剂、粘合剂、防腐剂、矫味剂、稀释剂、着色剂等。本发明药物组合物可按本领域已知方法制备。 

作为活性成分的本发明繁缕黄酮苷提取物的用量取决于使用对象的年龄、体重和疾病的类型及严重程度等因素。 

附图说明

图1为以繁缕黄酮苷提取物的总离子流色谱图表示的该提取物的 指纹图谱。 

图2(-)ESI方式下繁缕黄酮苷提取物的选择离子色谱图(左上图为选择593至594质量单位，左下图为选择563至564质量单位)和相应的质谱图(中上下和右上下)。 

图3繁缕黄酮苷提取物中m/z 593的黄酮苷的二级质谱扫描色谱图(左上)和各谱峰相应的质谱图。 

图4繁缕黄酮苷提取物中m/z 563的二级质谱扫描色谱图(左上)和各谱峰相应的质谱图。 

图5繁缕黄酮苷提取物中两个主要成分芹菜素-6-C-β-D-半乳糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷和芹菜素-6- C-α-L-阿拉伯糖-8- C-β-D-半乳糖苷的HPLC图谱。 

图6繁缕黄酮苷提取物提取工艺路线图。 

具体实施方式

下面的实施例和生物活性实验，是对本发明的进一步详细说明，但不意味着对本发明构成任何限制。 

实施例1：繁缕黄酮苷提取物的制备(1) 

将繁缕全草晾干，揉碎。该繁缕揉碎物6公斤，加8倍量70v/v％乙醇回流提取，过滤，得到乙醇提取液。同法再提取一次，合并两次提取液，浓缩除去乙醇，得到浸膏。浸膏用水溶解，离心处理(2500转/分，25min)，除去不溶物，上清液进行HP-20大孔吸附树脂柱层析，树脂柱床体积(毫升)与上样量(克)比为10∶1。水洗脱后，再用35v/v％乙醇洗脱，该洗脱部位浓缩除去溶剂后冷冻干燥，得到80克棕黄色粉末，为繁缕黄酮苷提取物，其具有前述的定性反应特征，表明繁缕黄酮苷提取物中含有系列黄酮碳苷类化合物。具体结果见附图1-4。 

按照前述描述的方法测得本实施例所得提取物中两个主要黄酮苷化合物1和化合物2的含量分别为12.05 w/w％和11.31 w/w％，RSD分别为2.23％和3.62％。 

实施例2：繁缕黄酮苷提取物的制备(2) 

将繁缕全草晾干，揉碎，称取12公斤，加8倍量60v/v ％乙醇回流提取，过滤，得到乙醇提取液。同法再提取一次，合并两次提取液，浓缩除去乙醇，得到浸膏。浸膏用水溶解，离心处理(2500转/分，25min)，除去不溶物，上清液进行HP-20大孔吸附树脂柱层析，树脂柱床体积(毫升)与上样量(克)比为10∶1。水洗脱后(用7个柱床体积水)，再用30v/v ％乙醇洗脱，该洗脱部位浓缩除去溶剂后冷冻干燥，得到152克棕黄色粉末，为繁缕黄酮苷提取物，其具有前述的定性反应特征。 

按前述所给方法测得本实施例所得提取物中两个主要黄酮苷化合物1和化合物2的含量分别为14.15 w/w％、13.12w/w％，RSD分别为2.12％、3.40％。 

实施例3：繁缕黄酮苷提取物的生物活性实验 

观察指标：高脂饲料致高脂血症大鼠的总胆固醇和甘油三脂水平。 

实验材料 

动物：成年SD大鼠，200g左右，雄性，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。 

试剂：胆酸钠(北京双旋微生物培养基制品厂，批号20041102)，丙基硫氧嘧啶(苏州恒益医药原料有限公司，批号20050220)；胆固醇：购自北京化学试剂公司；力平之胶囊(菲诺贝特，法国利博福尼制药公司生产，批号65719)。总胆固醇(CHO)试剂盒、甘油三酯(TG)试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)试剂盒均为北京北化康泰临床试剂有限公司产品；非水溶性试剂均采用羧甲基纤维素钠溶液配制成混悬液使用。 

高脂饲料：由15％猪油、2％胆固醇和83％普通饲料组成，北京维通利华实验动物技术有限公司加工制作。 

仪器：Fluostar微板光学测定仪，离心机。 

实验方法和结果 

雄性SD大鼠60只，随机分为六组，每组10只。空白对照组、高脂血症模型组、力平之(3.5mg/kg)对照组、受试药品高(500mg/kg)、低剂量组(100mg/kg)。除空白对照组大鼠喂养普通饲料以外，其它各组大鼠都给予高脂饲料喂养30天，每日上午灌服受试药物；下午灌服胆酸钠(300mg/kg)和丙基硫氧嘧啶(150mg/kg)。连续给药30天时，眼眶取血，静置，离心(2000转/分)15min，取出血清，放于-40℃冰箱备用。严格按照试剂盒说明书进行检测，测定血清中CHO、TG、LDL-C、HDL-C的含量，以便观察受试药物在高脂饲料致大鼠高脂血症模型的降血脂作用，结果见表5。 

表5.繁缕黄酮苷提取物对高脂血症大鼠的总胆固醇、 

甘油三脂和高及低密度脂蛋白胆固醇水平的影响 

*与空白组比较 P＜0.05。^#与模型组比较 P＜0.05 

表5结果显示，模型组比空白组的总胆固醇、甘油三脂和低密度脂蛋白胆固醇含量明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。与模型组相比较，阳性对照药力平之组的总胆固醇、甘油三脂和低密度脂蛋白胆固醇含量显著降低。高剂量组与模型组比较，总胆固醇和甘油三脂含量显著降低，而低密度脂蛋白胆固醇含量虽虽有下降趋势，但差异没有统计学意义。 

上述实验结果表明，与模型组比较，繁缕黄酮苷提取物在500mg/kg剂量下能显著降低高脂饲料致高脂血症大鼠的总胆固醇和甘油三 脂水平，表明具有降血脂作用，该结果提示繁缕黄酮苷提取物对于高血脂相关疾病可能具有良好的治疗作用。