用于缓解神经突生长抑制的蛋白激酶A和/或酪蛋白激酶Ⅱ

摘要

本发明涉及一种用于缓解神经元的神经突生长抑制的方法，其中所述神经元包含Nogo受体，所述方法包括使所述神经元与能够导致Nogo受体磷酸化的组合物接触，其中所述组合物包含蛋白激酶A或酪蛋白激酶。

说明书

技术领域

本发明涉及神经损伤或神经疾病领域，具体地，本发明涉及缓解神经元 再生(例如神经突生长，neurite outgrowth)的抑制。

背景技术

神经元延伸神经突以与其他神经元或其靶组织进行通讯。成体中枢神经 系统(CNS)中的这种神经元网络在损伤后仅不良地再生。这在本领域中是 个问题，导致患者神经元网络损伤后的不良结局。

成体哺乳动物中枢神经系统不能再生部分归因于与损伤的髓鞘质相关的 神经突生长抑制剂。髓鞘质相关的糖蛋白(MAG)、Nogo-A(也称为网状蛋 白4A，Reticulon 4A)和少突胶质细胞髓鞘质糖蛋白(OMgp)为可结合Nogo 受体1(NgR1)的髓鞘质相关的神经突生长抑制剂。这些髓鞘质相关蛋白， Nogo-A、MAG以及OMgp通过结合Nogo受体将来自少突胶质细胞的信号 传输至神经元中。该Nogo信号传导在中枢神经系统(CNS)的发育和维持 中具有关键作用。它可抑制神经元的分化、迁移以及神经突生长，导致损伤 的成体中枢神经系统恢复不良。

Nogo-A通过被称为Nogo-66的结构域结合NgR1。Nogo-66结构域由66 个氨基酸组成，单独的Nogo-66结构域(无Nogo-A的其他区域)足以抑制 神经突生长。MAG(但既非Nogo-A也非OMgp)不仅能通过NgR1而且能 通过NgR2(NgR1同源性蛋白)抑制神经突生长(6)。

NgR1使得信号传导复合物含有LINGO-1和p75^NTR或TAJ/TROY(McGee 和Strittmatter Trends Neυrosci 26，193-198(2003)；Schwab等，Trends Mol Med  12，293-297(2006))。p75^NTR和TAJ/TROY均属于TNFα受体家族，且提出其 作为用于启动抑制神经突生长的细胞内信号的主要组分。不确定NgR2是否 使复合物含有LINGO-1和p75^NTR或TAJ/TROY。

尽管关于Nogo信号传导的信息在扩展，但关于控制该信号传导的机制 的信息有限。这在本领域是个问题。已知细胞内cAMP的水平增加克服了 Nogo信号传导对于神经突生长的抑制性作用(16)。然而，cAMP克服Nogo 信号传导的作用的详细机制尚未知。

BDNF(神经营养因子神经生长因子家族的成员)不仅在体外刺激数种 神经细胞的神经突生长(17-19，20)，而且部分地促进脊髓损伤的恢复 (21-24)。使用BDNF预处理提高了培养的神经元中细胞内cAMP的水平， 甚至在存在髓鞘质相关抑制剂的情况下也允许神经元延伸神经突(25)。另外， BDNF参与海马中损伤诱导的神经突萌发(26)。这些报道表明，甚至在存在 神经突生长的髓鞘质相关抑制剂的情况下，BDNF也可潜在辅助中枢神经系 统中神经网络的再生。然而，该作用有限，且不足以实现神经元网络的完全 再生。

人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y显示了在使用维甲酸(RA)处理5天 之后的BDNF依赖性神经突生长(18)。SH-SY5Y细胞响应RA启动向神经 元样细胞的分化，并开始表达神经元特异性蛋白。然而，通过RA自SH-SY5Y 细胞分化的神经细胞仅显示有限的形态学变化。对于SH-SY5Y衍生的神经 细胞的有效神经突生长，需要BDNF处理，否则需要使用RA进行较长时间 的处理(27)。在神经元方面已经研究了酪蛋白激酶II(CK2)。酪蛋白激酶 II参与神经元中两种不同表面蛋白的磷酸化。这两种蛋白都与Nogo受体无 关。另外，在该领域中的研究完全依赖于对于酪蛋白激酶II抑制剂的使用。 由此，本领域中已经研究了细胞内CK2的功能。已知细胞内CK2活性为神 经突自身生长所需。已知存在细胞外CK2。然而，如上所述，关于细胞外 CK2的信息很大程度上尚属未知。更具体地，有信息表明，淀粉状蛋白β前 体蛋白和神经蛋白聚糖C(neuroglican C)可在神经元表面通过内源性细胞 外CK2而被磷酸化。然而，这些磷酸化对于神经突生长的作用(如果存在的 话)尚属未知。

酪蛋白激酶II已经在某些体外制剂中用于处理胶原/层粘连蛋白。这些处 理从未涉及细胞。这些处理仅涉及诸如胶原或层粘连蛋白之类的基质蛋白的 体外制剂。

现有技术中，细胞的酪蛋白激酶II处理尚属未知。将外源性酪蛋白激酶 II应用于细胞在现有技术中尚属未知。

Ulloa等(1993EMBO，卷12，第1633-1640页)使用了反义寡核苷酸 (antisense oligos)和特异性抑制剂来抑制N2A小鼠神经母细胞瘤细胞系的 CK2活性。在既不使用维甲酸(RA)也不使用BDNF的情况下，N2A细胞 也延伸神经突。通过使用N2A细胞系，他们发现，N2A细胞的神经突生长 受到CK2耗竭的抑制，还发现CK2耗竭改变了微管相关蛋白MAP1B的磷 酸化。MAP1B是细胞骨架重排所需要的，而细胞骨架重排为神经突生长所 需。由此，他们得出结论，MAP1B磷酸化的改变通过CK2耗竭而导致神经 突生长抑制。MAP1B磷酸化是细胞内的。已知与细胞骨架重排相关的其他 蛋白在细胞内通过CK2磷酸化。这些细胞内磷酸化事件为神经突自身生长所 需。由于正常神经元以及N2A细胞可在不受任何刺激的情况下而延伸神经 突，推断这些细胞内磷酸化事件是由神经元内基础水平的细胞内CK2所催 化。该论文不涉及Nogo信号传导。

至今尚不了解磷酸化和Nogo信号传导之间的关系。迄今，Nogo信号传 导调节机制尚未知。

本发明设法克服现有技术相关的问题。

发明内容

成体神经组织再生不良或根本不发生再生是一个问题。这在由诸如损伤 或疾病之类的因素引起的损害之后尤其是一个问题。已经识别了控制再生抑 制的多种机制。一种这样的机制是通过Nogo的受体信号传导而抑制神经突 生长。尽管该途径中的多种配体和受体得以良好表征，但现有技术中尚未揭 示缓解该抑制的可靠途径。

本发明已经解决了这些问题。通过对于Nogo信号传导的详细研究，本 发明人已经识别了可抑制所述信号传导的途径。另外，本发明人已经识别了 对于调节Nogo信号传导来说关键的Nogo受体内的特定分子靶。该靶是Nogo 受体的丝氨酸281。该残基的磷酸化消除了神经突生长抑制剂与受体结合， 由此缓解神经再生抑制。另外，本发明人教导并证实了可通过诸如使用蛋白 激酶A和/或酪蛋白激酶II处理而实现该目的的有效途径。本发明基于这些 令人惊讶的发现。

因此，一方面，本发明提供了一种用于缓解神经元的神经突生长抑制的 方法，其中所述神经元包含Nogo受体，所述方法包括使所述神经元与能够 导致Nogo受体磷酸化的组合物接触，其中所述组合物包含蛋白激酶A或酪 蛋白激酶II。

合适地，所述组合物包含蛋白激酶A和酪蛋白激酶II。

合适地，所述磷酸化是与所述Nogo受体的丝氨酸281对应的氨基酸残 基的磷酸化。

合适地，所述Nogo受体是人NgR1。

另一方面，本发明涉及蛋白激酶A多肽在制备用于脊髓损伤的药剂中的 用途。

另一方面，本发明涉及用于治疗脊髓损伤的蛋白激酶A多肽。

另一方面，本发明涉及酪蛋白激酶II多肽在制备用于脊髓损伤的药剂中 的用途。

另一方面，本发明涉及用于治疗脊髓损伤的酪蛋白激酶II多肽。

另一方面，本发明涉及用作药剂的组合物，其包含蛋白激酶A和酪蛋白 激酶II。

另一方面，本发明涉及上文所述的组合物在制备用于脊髓损伤的药剂中 的用途。

另一方面，本发明涉及用于治疗脊髓损伤的上文所述的组合物。

另一方面，本发明涉及蛋白激酶A多肽或酪蛋白激酶II多肽在制备用于 导致神经突生长的药剂中的用途。

另一方面，本发明涉及用于导致神经突生长的蛋白激酶A多肽或酪蛋白 激酶II多肽。

另一方面，本发明涉及一种治疗受试者的脊髓损伤的方法，所述方法包 括给所述受试者施用有效量能够导致Nogo受体磷酸化的组合物，其中所述 组合物包含蛋白激酶A或酪蛋白激酶II。合适地，所述施用定位于损伤部位。

具体实施方式

Nogo信号传导可抑制中枢神经系统中神经元的神经突生长(3，4)、分 化(9，10)、迁移(12)以及突触形成(11)。因此，Nogo信号传导已被鉴 定为中枢神经系统再生(在生理条件下不发生)的主要抑制因子。

本发明人发现，Nogo受体的磷酸化(例如，通过酪蛋白激酶II(CK2)) 抑制髓鞘质相关蛋白的结合，所述鞘质相关蛋白抑制诸如神经突生长之类的 神经元再生。本发明人证实，脑源性神经营养因子(BDNF)可任选用于诱 导Nogo受体的磷酸化，这阻抑神经母细胞瘤衍生的神经元的神经突生长的 Nogo依赖性抑制。在进一步的实施方式中，细胞外CK2处理通过髓鞘质相 关蛋白克服了神经突生长抑制。这例如在成体大鼠神经元中得以证实。因此， 本发明提供了用于控制Nogo信号传导并由此调节神经元再生的新策略。

本发明人首次揭示了磷酸化与Nogo信号传导之间的关系。本发明人首 次揭示了胞外结构域磷酸化对于神经突生长的Nogo依赖性抑制的作用。 Nogo受体的磷酸化可能不为神经突自身生长所需，但它是克服神经突生长抑 制所需要的。神经突生长的抑制发生在体内条件下，例如在中枢神经系统的 损伤之后。

另外，本发明人揭示了，Nogo信号传导抑制哺乳动物细胞(例如 SH-SY5Y衍生的神经细胞)的神经突生长，并且该抑制受到使用CK2而无 BDNF的细胞外处理的阻抑。CK2处理抑制Nogo-66、MAG以及OMgp与 其受体的结合，允许在这些神经突生长抑制剂的存在下的神经突生长。由此， 本发明人有利地揭示了本发明的BDNF依赖性作用。合适地，BDNF不用于 本发明的方法。合适地，特别从本发明的方法中省略了BDNF。合适地，本 发明的组合物不包含BDNF。

定义

术语“包含”(包括、含有)应理解为在本领域中具有其常规含义，即， 包括指明的特征或特征组，但该术语不排除还存在任何其他指明的特征或特 征组。

Nogo受体

从广义上，“Nogo受体”可指介导神经突生长的Nogo依赖性抑制的任何 蛋白，不仅特别指在经典膜定位意义上的受体(NgR)，还可指任何介导Nogo 信号传导的任何Nogo结合蛋白(例如通过除NgR家族成员以外的蛋白)； 实际上，本发明人使用正常神经元获得的结果显示了CK2处理可阻断这种 NgR非依赖性Nogo信号传导，以及NgR依赖性信号传导。然而，合适地， 除非上下文另有指明，术语“Nogo受体”可具有本领域中的常规含义。

NgR1与其同源性蛋白NgR2和NgR3属于具有8个富亮氨酸重复子区域 的糖基磷脂酰肌醇(GPI)连接蛋白的家族，所述蛋白不具有细胞内结构域。 尽管NgR1可与Nogo-A、MAG以及OMgp相互作用，但NgR2仅以维甲酸 依赖性方式与MAG相互作用。该相互作用也可抑制神经突生长。尚不知晓 NgR3的配体。

NgR1使得复合物包含LINGO-1和神经营养因子受体p75^NTR。可选地， 神经元中广泛表达的孤儿肿瘤坏死因子受体成员TAJ/TROY代替p75^NTR包含 在所述复合物中。尚不知NgR2是否可使复合物具有LINGO-1、p75^NTR或 TAJ/TROY(如见于NgR1)。

因此，Nogo信号传导可至少通过少突胶质细胞中的至少三种配体启动， 可通过至少两种受体将信号转导至神经元中。Nogo信号传导中特异性的配体 -受体系统对于神经突生长抑制的相对作用在不同神经细胞类型中可不同。

本发明涉及存在于细胞表面的Nogo受体。事实上，本发明的具体教导 是，外源性物质用于激发靶细胞的细胞表面上Nogo受体的磷酸化。因此， 合适地，本文所使用的术语“Nogo受体”是指存在于靶细胞的细胞表面的 Nogo受体蛋白。合适地，所述靶细胞是脊椎动物靶细胞，更合适地，是哺乳 动物靶细胞，最合适地，是人靶细胞。在一些实施方式中，所述靶细胞最合 适地是待治疗的受试者所具有的人细胞，例如人神经元，例如成体神经元。

广义上，术语“Nogo受体”是指任何已知的Nogo受体(例如NgR1、NgR2 或NgR3)的多肽。另外，在靶向Nogo受体中，多于一种的Nogo受体可被 磷酸化。这可给本发明带来有利之处，例如缓解不依赖于特定Nogo受体类 型(表达于所选的特定靶细胞)的神经突生长抑制。另外，可通过靶向多种 Nogo受体蛋白而实现较强和/或较迅速的作用。

重要的是要注意到各Nogo受体在氨基酸残基281处具有保守丝氨酸。 因此，根据本发明的Nogo受体突变体可同样包括任何已知的NgR多肽，条 件是它们具有所讨论的特定突变或取代。

合适地，根据本发明的Nogo受体是NgR1、NgR2或NgR3中的一种或 多种。更合适地，根据本发明的Nogo受体是NgR1或NgR2中的一种或多种。 这样一个优点是这些Nogo受体表征较好，并因此适于在体内产生更特定或 确定的作用。最优选地，根据本发明的Nogo受体是NgR1。这具有许多优点， 其中一些优点列出在实施例部分。

本发明主要涉及脊椎动物(例如哺乳动物)应用。因此，合适地，本发 明的Nogo受体是脊椎动物(例如哺乳动物)Nogo受体。最合适地，本发明 的Nogo受体是人Nogo受体。人Nogo受体具有与人Nogo受体氨基酸序列 对应的多肽序列。自然地，根据本发明的Nogo受体多肽可通过任何合适的 方法来制备，例如从非人宿主细胞重组制备。然而，为了便于理解，如果其 氨基酸序列与人氨基酸序列对应，则将非人细胞制备的Nogo受体多肽认为 是人Nogo受体。

本文揭示并讨论了Nogo受体突变体。从上述讨论应理解，这些突变体 可包含多种各Nogo受体亚型个体(例如NgR1、NgR2、NgR3等)中的一种。 为了便于理解，在Nogo受体参考序列的上下文中讨论了特定的氨基酸或特 定的突变。

参考序列

应理解，将使用其在多肽上的编号位置来讨论特定的氨基酸残基，这是 本领域常规的方法。当使用编号位置来引用特定的氨基酸残基时，使用人 NgR1的氨基酸序列作为参考序列来取编号。最合适地，Nogo受体参考序列 是NM023004的人NgR1氨基酸序列：

MKRASAGGSRLLAWVLWLQAWQVAAPCPGACVCYNEPKVTTSCPQQGLQAVPVGIPAASQR

IFLHGNRISHVPAASFRACRNLTILWLHSNVLARIDAAAFTGLALLEQLDLSDNAQLRSVDPATF

HGLGRLHTLHLDRCGLQELGPGLFRGLAALQYLYLQDNALQALPDDTFRDLGNLTHLFLHGNRI

SSVPERAFRGLHSLDRLLLHQNRVAHVHPHAFRDLGRLMTLYLFANNLSALPTEALAPLRALQY

LRLNDNPWVCDCRARPLWAWLQKFRGSSSEVPCSLPQRLAGRDLKRLAANDLQGCAVATGP

YHPIVWTGRATDEEPLGLPKCCQPDAADKASVLEPGRPASAGNALKGRVPPGDSPPGNGSGPR

HINDSPFGTLPGSAEPPLTAVRPEGSEPPGFPTSGPRRRPGCSRKNRTRSHCRLGQAGSGGG

GTGDSEGSGALPSLTCSLTPLGLALVLWTVLGPC

如在本领域中所公知的，这用于对目的残基进行定位。这并非总是严格 的计数-必须注意上下文。例如，如果目的蛋白(例如，人EHD2)的长度稍 有不同，则人序列中对应于(例如)S281的正确残基的定位可需要对序列进 行比对，且需要选取等同或对应的残基，而非仅取目的序列的第281位残基。 这在本领域技术人员的技术范围之内。附图中给出了示例的比对。

对于本领域技术人员显而易见的是，本发明主要参考NgR1来举例说明。 应注意，NgR1表现出与其他NgR家族多肽具有高序列同源性。因此，在一 些方面，本发明涉及NgR1在开发用于应用其他NgR家族蛋白的治疗剂中的 用途。

在本发明的一些方面，期望采用测试特定的多肽是否被认为是NgR家族 多肽的功能性试验。除了(或替代)上文所述基于序列的标准，还可使用下 述功能性标准：结合配体，例如本文所述的那些配体。另外，还可使用神经 突生长测定中起作用的能力，例如，通过在实施例部分描述的使用RA处理 而导致的SH-SY5Y细胞中的过表达。因此，为了确定特定多肽是否实际上 被认为是NgR家族多肽，可检测该多肽是否在神经突生长测定中起作用。如 果NgR蛋白支持本文中的Nogo信号传导，该多肽可被认为是Nogo受体(NgR 家族多肽)。当然，本发明的目的是缓解神经突生长抑制，当评价NgR蛋白 时应注意，野生型蛋白在该测定中抑制神经突生长，特别在未使用本发明的 激酶处理的情况下。

本发明的Nogo受体突变体

本发明涉及Nogo受体多肽，其特征在于，丝氨酸281被除了丝氨酸以 外的任何其他氨基酸取代。合适地，S281被非磷酸基受体氨基酸取代，因此， 合适地S281不是S、T或Y。

合适地，本发明提供了具有S281A的NogoR，其优点在于该位点不可磷 酸化。这意味着，该受体具有抵抗配体结合的CKII/PKA抑制的生物学特性。 换句话说，这样的突变体具有甚至在存在CKII/PKA的情况下响应Nogo配 体而进行信号传导的新功能。

合适地，本发明提供了具有S281D的NogoR，其优点在于模仿S281的 磷酸化。这意味着该受体具有被永久“关闭”的生物学特性，这样通过使用 该受体使得神经突生长抑制得以永久缓解。更具体地，该受体不结合Nogo 配体。换句话说，这样的突变体具有不响应Nogo配体而结合(或信号传导) 的新功能，不管是否存在CKII/PKA均如此。

合适地，除非特别指明(例如在对应于S281的残基处)，否则本发明的 Nogo受体多肽(NogoR)包含NM023004序列。

本发明还涉及下述NogoR：与NM023004具有至少60％同一性，合适地 与NM023004具有至少70％同一性，合适地与与NM023004具有至少75％同 一性，合适地与NM023004具有至少80％同一性，合适地与NM023004具有 至少85％同一性，合适地与NM023004具有至少90％同一性，合适地与 NM023004具有至少95％同一性，合适地与NM023004具有至少97％同一性， 合适地与NM023004具有至少98％同一性，合适地与NM023004具有至少 99％同一性，所述NogoR总是具有残基S281不是丝氨酸的特征。

合适地，截短形式与跨越所述截短形式的长度的该序列对应。合适地， 根据本发明的NogoR多肽包含至少30个氨基酸，合适地至少80个氨基酸， 合适地至少130个氨基酸，合适地至少180个氨基酸，合适地至少230个氨 基酸，合适地至少280个氨基酸，合适地至少330个氨基酸，合适地至少380 个氨基酸，合适地至少382个氨基酸(例如，全长NgR2)，合适地至少402 个氨基酸(例如，全长NgR3)，合适地至少417个氨基酸(例如，NgR1)。

多肽和突变体

Nogo受体序列可以被修饰以用于本发明。通常，所进行的修饰使包含丝 氨酸281(或在所述位置的取代)的序列区域得到保持。所进行的氨基酸取 代可以是例如1、2或3至10、20或30个取代，条件是所修饰的序列保留所 需的S281残基。氨基酸取代可包括使用非天然存在的类似物，例如用于增 加治疗上施用的多肽的半衰期。修饰同样适用于本发明的PKA或CKII多肽， 在该情况下总是需要在引入任何突变或取代之后保留PKA/CKII激酶活性。

可例如根据下表来进行保守性取代。第二列中相同区块中的氨基酸和优 选地第三列中相同行中的氨基酸可相互取代：

本发明的蛋白质通常通过重组方法来制备，例如，如下文所述。然而， 也可使用本领域技术人员公知的技术通过合成方法来制备，例如固相合成。 本发明的蛋白质也可作为融合蛋白来制备，例如以有助于分离和纯化。融合 蛋白配偶体(partners)的实例包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、6xHis、GAL4 (DNA结合和/或转录激活结构域)和β-半乳糖苷酶。也可方便地在融合蛋 白配偶体和目的蛋白序列之间包括蛋白酶剪切位点以允许去除融合蛋白序 列。

本发明的蛋白质可为基本分离形式。应理解，可将所述蛋白质与不干扰 该蛋白的预期目的的载体或稀释剂混合，并仍旧被认为是基本分离形式。本 发明的蛋白质还可为基本纯化形式，在该情况下，通常在下述制剂中包括所 述蛋白质，即，其中所述制剂中超过90％(例如95％、98％或99％)的蛋白 质为本发明的蛋白质。

本发明的应用

本领域技术人员应注意的是，本发明涉及抑制Nogo信号传导的新方法。 该新方法涉及Nogo受体的磷酸化。本文揭示的技术还涉及Nogo受体突变体。 明显地，这些轻微差异的技术变化形式中各自均为涉及Nogo信号传导的相 同发明的一部分。为了便于理解，本发明的描述主要涉及结合缓解或减轻神 经突生长抑制。这在诸如脊髓损伤之类的领域中具有特定的应用。然而，本 发明更广泛的方面可涉及操控神经元的其他特性，例如其迁移或分化。事实 上，原则上可使用本文揭示的技术(例如，Nogo受体的磷酸化)来调节或控 制受Nogo信号传导控制或影响的任何过程(例如神经突生长抑制，例如神 经元迁移，或例如受Nogo信号传导影响的任何其他生物现象)。

不希望受到理论的限制，神经突生长的精确生物力学仍旧是活跃的科研 中的主题。本发明揭示的Nogo信号传导技术可在影响控制信号的意义上影 响神经突生长的调节，或本发明揭示的Nogo信号传导技术可影响神经突生 长系统(machinery)，例如，参与纤维形成(可与产生神经突生长的作用密 切相关)的蛋白质。本发明本身不涉及神经突生长的精确生物力学。本发明 的重要教导是，对于Nogo受体的磷酸化状态的操控，或事实上使用本文揭 示的特定Nogo受体突变体可用于调控神经突生长。该教导和将本发明付诸 实践的方式通常不依赖于在生理神经突自身生长的位点发生的精确分子机 制。

本发明的重要应用是用于治疗脊髓损伤。具体地，本发明可用于促进脊 髓损伤后的再生。特别地，本发明用于缓解或减轻经Nogo受体的信号传导 而导致的神经突生长抑制。通过阻抑或减少经Nogo受体的信号传导，神经 突生长抑制被有用地减轻。这提供了有利地允许神经突生长并由此允许其再 生的条件。

本发明提供的多个实施例涉及对受试者进行插管，以应用本发明的组合 物。应注意，当所述受试者是人时，有利地避免了插管。可不使用插管，而 合适地进行本发明的组合物的局部注射或系列注射。

在实施例部分描述了体内应用。总体上，通常可如下应用本发明：

在例如脊髓损伤之后，任选地与100μM ATP一起添加ng至μg的激酶 (例如CK2)。

在实验系统中，可在脊髓中制造损伤并将导管置于病灶(lesion)处。通 过该导管，可在该区域应用激酶，例如CK2。还可使用注射而非插管来应用 激酶，例如CK2。这优选用于人受试者。然而，对于实验系统而言，插管更 易于激酶，例如CK2的间或添加。

然后，可检查是否可观察到神经突萌发，例如使用组织切片免疫荧光。

在观察萌发之后，可进行行为试验，以评估功能恢复。

合适地，可单独使用CK2，或将CK2与软骨素酶ABC联合使用，软骨 素酶ABC能够降解硫酸软骨素，这是中枢神经系统再生的另一种抑制剂。

合适地，可使用PKA，或将PKA与软骨素酶ABC联合使用。

合适地，本发明的方法可以是体外使用的方法。

合适地，本发明的方法可以为体内使用的方法，例如在治疗受试者(例 如人受试者)中。

Nogo受体的磷酸化

本发明考虑到，本发明的主要实际应用或实施方式可通过诱导Nogo受 体的磷酸化而影响其信号传导。本发明涉及Nogo受体突变体的实施方式在 下文讨论。然而，关于Nogo受体磷酸化的考虑，本发明人令人惊讶地鉴定 了介导本发明有利作用的Nogo受体中的特定位点。该位点是Nogo受体的丝 氨酸281。

本发明人将注意力转移到丝氨酸281及其周围的氨基酸残基的研究。使 用了下文实施例中提供的一系列实验技术，包括序列分析以及直接实验，来 证实该令人惊讶的发现。

本发明人揭示的一个关键观点是Nogo受体的丝氨酸281作为本发明的 靶至关重要。另外，本发明人揭示了其中Nogo受体的丝氨酸281可被靶向 并磷酸化的多种方式。实现该目的的最合适的方式中的两种方式是使用蛋白 激酶A和/或酪蛋白激酶II直接对Nogo受体的丝氨酸281进行磷酸化。因此， 尽管蛋白激酶A和酪蛋白激酶II不一定彼此物理相关，但在本发明中它们形 成了可实施本发明的可选方式的单合并性技术群。换句话说，酪蛋白激酶II 和蛋白激酶A表现了实施相同单一构思发明的两种相同有效方法。因此，权 利要求书中这两种结构上不同的可选物的存在完全符合单一发明构思。另外， 这两种酶在本发明中共有相同的技术优点，即催化Nogo受体的丝氨酸281 的磷酸化。出于至少这些原因，可清楚地看出本发申请涉及单一发明构思。 本发明描述了实现本发明技术优点的不同方式，以有助于理解，且确保本领 域技术人员在实践本发明中没有困难。

丝氨酸281

如上所述，本发明核心构思的重要部分是可实施本发明的不同技术方式 实际上各自指引产生相同技术效果，即，Nogo受体的丝氨酸281的磷酸化。 本发明人在其研究过程中发现该残基是CK2和PKA二者的预测磷酸受体位 点的一部分。另外，该重要发现得到了下述实验性研究的支持：即，证实CK2 和PKA均催化该重要残基的磷酸化，并由此缓解了神经突生长抑制的实验性 研究。

酪蛋白激酶II

合适地，酪蛋白激酶II是脊椎动物的酪蛋白激酶II，更优选地是哺乳动 物酪蛋白激酶II。更合适地，酪蛋白激酶II是人酪蛋白激酶II。

酪蛋白激酶II最常作为杂四聚体存在。该杂四聚体通常包含由两个α多 肽构成的催化亚单位，和由两个β多肽构成的调节性亚单位。这样的复合物 通常在具有激酶活性的意义上具有组成性活性。另外，所述催化亚单位自身 (即，两个α多肽的同二聚体)甚至在不存在调节性亚单位的情况下也具有 催化活性。

因此，CK2的杂四聚体形式或CK2的同二聚体形式均可用于本发明， 特别是α-β杂四聚体CK2或α同二聚体CK2。

最合适地，以商业制剂形式(例如来自New England Bio Labs)使用CK2。 这合适地是CK2的全酶形式。

最合适地，所使用的CK2由两条多肽链组成，各多肽链具有人CK2α亚 单位的序列，例如：基因名称：CSNK2A1，登录号NM001895.3，NM177559.2； NM177560.2(3个亚型)；基因名称CSNK2A2，登录号NM001896.2。

尽管CSNK2A1、NM001895和NM177559具有不同的5′非编码区，但 它们可产生相同的蛋白质。NM177560编码具有较短的N末端区域的同种型 b。最合适地，使用NM001895和NM177559的蛋白质序列，该蛋白质序列 是如下的同种型a：

MSGPVPSRARVYTDVNTHRPREYWDYESHVVEWGNQDDYQLVRKLGRGKYSEVFEAINI

TNNEKVVVKILKPVKKKKIKREIKILENLRGGPNIITLADIVKDPVSRTPALVFEHVNN

TDFKQLYQTLTDYDIRFYMYEILKALDYCHSMGIMHRDVKPHNVMIDHEHRKLRLIDWG

LAEFYHPGQEYNVRVASRYFKGPELLVDYQMYDYSLDMWSLGCMLASMIFRKEPFFHGH

DNYDQLVRIAKVLGTEDLYDYIDKYNIELDPRFNDILGRHSRKRWERFVHSENQHLVSP

EALDFLDKLLRYDHQSRLTAREAMEHPYFYTVVKDQARMGSSSMPGGSTPVSSANMMSG

ISSVPTPSPLGPLAGSPVIAAANPLGMPVPAAAGAQQ

关于CSNK2A2，最合适地，使用如下序列：

MPGPAAGSRARVYAEVNSLRSREYWDYEAHVPSWGNQDDYQLVRKLGRGKYSEVFEAIN

ITNNERVVVKILKPVKKKKIKREVKILENLRGGTNIIKLIDTVKDPVSKTPALVFEYIN

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蛋白激酶A

合适地，蛋白激酶A是脊椎动物的蛋白激酶A，更合适地是哺乳动物蛋 白激酶A。更合适地，蛋白激酶A是人蛋白激酶A。

所使用的蛋白激酶A可由两个α亚基和两个β亚基构成。β亚基同二聚 体是抑制性结构域，需要cAMP将β同二聚体与α同二聚体解离。

更合适地，所使用的蛋白激酶A由具有人PKA α亚基的序列的2条α 多肽链(即，PKAα亚基同二聚体)构成：基因名称PRKACA，登录号 NM002730.3，NM207518.1(2个亚型)。这具有避免使用β亚基的优点(需 要cAMP来激活PKAα-β杂四聚体)并因此具有避免使用cAMP的优点。关 于PRKACA，NM 002730编码遍在表达的同种型1。NM207518编码生精子 细胞特异性PKA，同种型2。最合适地，使用如下同种型1序列：

MGNAAAAKKGSEQESVKEFLAKAKEDFLKKWESPAQNTAHLDQFERIKTLGTGSFGRVM

LVKHKETGNHYAMKILDKQKVVKLKQIEHTLNEKRILQAVNFPFLVKLEFSFKDNSNLY

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QGYIQVTDFGFAKRVKGRTWTLCGTPEYLAPEIILSKGYNKAVDWWALGVLIYEMAAGY

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KWFATTDWIAIYQRKVEAPFIPKFKGPGDTSNFDDYEEEEIRVSINEKCGKEFSEF

高特异性活性PKA可获自New England Biolabs。

合适地，使用α同二聚体PKA。

不希望受理论限制，明显地，蛋白激酶A在神经突生长中不具有生理学 作用。换句话说，可以存在的情况是，在天然存在的体内生物系统中，PKA 不会与Nogo受体接触和/或不会将其磷酸化。然而，本发明清楚地证实了PKA 确实催化该关键的磷酸化事件。出于这些原因，使用PKA治疗可提供避免任 何天然生物过程干扰的其他优点。

不希望受到理论的限制，从对于可用于靶向丝氨酸281的酶进行的比较 来看，明显地，CK2更有可能是用于Nogo受体的“天然”磷酸化的生物学候 选物。出于该原因，相对于使用其他可能的酶，例如PKA，使用CK2来用 于本发明的治疗可提供其他优点，原因是通过使用最可能的天然或生物学激 酶-底物配对可实现较高的生物学保真性或特异性。尽管如此，如本发明人所 证实的，CK2是用于引起Nogo受体的丝氨酸281磷酸化的有效催化剂。

应注意，本文所述的目的特定激酶的亚基可同样适用于本发明。亚基可 以是通常在体内装配活性酶的蛋白集合的亚群，或者亚基可以指目的激酶的 多肽之一的片段或截短形式。具体地，仅使用目的酶的催化亚基是有利的。 这可提供下述优点，例如活性较强的酶形式，和/或可避免免疫原性，或可能 源于使用较大的分子或复合物的其他此类并发症。事实上，使用发生截短或 突变的多肽的意于落在本发明的范围内。所进行的突变可使得例如提高所使 用的酶的活性或提供所使用的酶对于已知辅助因子的非依赖性。如果本领域 技术人员期望确定目的酶的特定片段或截短形式是否落入本发明的范围内， 则所使用的酶保留其功能性催化活性是必需的。更特别地，只要本发明中所 使用的激酶能够催化磷酸基掺入Nogo受体(例如在Nogo受体的残基281)， 则它就是目的酶。这可以容易地检测，例如通过在允许磷酸化的条件下将目 的激酶或片段与Nogo受体组合，并之后测定Nogo受体以确定是否确实发生 磷酸化。另外，可以功能性评价目的激酶的活性，例如通过将其应用于细胞 并检测其对神经突生长抑制的缓解作用。明显地，只有能够产生这种功能性 缓解神经突生长抑制的那些酶或片段才是目的酶或可应用于本发明。在实施 例部分给出了可进行该功能性测定的示例方式。

因此，除非上下文另有指明，则对于本发明中有关于诸如“蛋白激酶A” 或“酪蛋白激酶II”的目的酶描述应包括所述激酶的任何亚基、片段、突变体 或截短形式，条件总是它们保留上文所述的对于Nogo受体的激酶催化活性， 最合适地，在用于缓解神经突生长抑制的功能性测定中保留上文所述的对于 Nogo受体的激酶催化活性。

合适地，本发明使用的蛋白激酶A或酪蛋白激酶II包括全长多肽。更合 适地，本发明使用的蛋白激酶A或酪蛋白激酶II包括与人野生型酶对应的多 肽。最合适地，本发明使用的蛋白激酶A或酪蛋白酶II如实施例部分所描述。

合适地，本发明使用的蛋白激酶A或酪蛋白激酶II包括大肠杆菌(E-coli) 表达的重组蛋白。

合适地，本发明使用的蛋白激酶A或酪蛋白激酶II是外源性的，即，并 非在位于给药位点附近的细胞中产生，而是在例如本发明的组合物中，外部 或外源性地提供。

组合物

本发明的组合物包括一种或多种催化剂，例如能够引起NogoR丝氨酸 281磷酸化的酶。合适地，这样的酶是PKA。合适地，这样的酶是CKII。

本发明的组合物可包括PKA和CKII。

合适地，CK2以500-1200U/ml CK2终浓度存在，或在所述组合物被干 燥/冻干或浓缩(例如，用于储存)时以等同量存在。

在一种实施方式中，本发明提供了一种包含10-100μM ATP、5-0.5μg CK2、1-10mM MgCl₂或醋酸镁以及10-50mM KCl或醋酸钾的组合物。

当所述使用的酶是CK2α亚基同二聚体时，K离子是任选的(事实上， 不需要K离子)，因此，合适地，作为酶仅含有CK2α亚基同二聚体的组合 物仅包含Mg和ATP作为其他组分。

使用CK2α和β杂四聚体具有下述优点：即，β亚基提高CK2磷酸化的 底物特异性，K离子促进β亚基的这种作用。因此，当使用CK2α和β杂四 聚体作为酶时，合适地，包含K离子，以获得上述优点。

在一种实施方式中，本发明提供了一种包含10-100μM ATP、5-0.05μg  PKA以及1-10mM MgCl₂或醋酸镁的组合物。

本发明的多肽优选可与多种组分组合以产生本发明的组合物。优选地， 所述组合物与药学上可接受的载体或稀释剂组合以产生药物组合物(可用于 人或动物)。合适的载体和稀释剂包括等渗盐水溶液，例如磷酸盐缓冲液。

本方面的组合物可通过直接注射来施用。

可配制本发明的组合物以用于向神经组织部位(例如脊髓)施用，并可 因此经配制而与脑脊液或其他此类组织相容。

通常，可在特定活性剂量而非特定的mg/kg体重的量来施用各蛋白。用 于施用的示例活性水平在实施例部分给出。例如，关于体积，对于小鼠，本 发明人通常在中枢神经系统中注射大约2μl。因此，对于人，通常注射50-200 μl的激酶+ATP溶液。活性成分的剂量如本文所描述。

配制/施用

合适地，使用注射来递送本发明的组合物，例如CKII和/或PKA。

本发明的组合物(例如，包含激酶、ATP和/或离子)可在脊柱减压手术 过程中局部施用。

如果不需要手术，可将手术用作施用的可选方法。

在手术之后，可通过经有效的周期(例如达1个月或更长时间，例如达 3个月)定期注射来施用。

基质，例如基质胶(BD Bioscience)可有利地用于将试剂保持在施用区 域。可使用任何缓释物质和/或装置替代基质以用于控制给药/释放周期。

ATP

由于有些神经元可分泌ATP，ATP不是本发明组合物的必需组分。在体 外条件下，本发明人证实了不添加ATP的外源性激酶(例如CK2)的作用， 原因是培养基含有ATP。

合适地，本发明的组合物包含ATP。这具有提供ATP以有助于促进Nogo 受体磷酸化的优点。

合适地，对于包含CK2或PKA的组合物，所述组合物包含0.1-1mM ATP。

镁

合适地，所述组合物包含5mM Mg²⁺离子。

Mg²⁺离子可作为MgCl₂或MgAc(醋酸镁，例如(CH₃COO)Mg₂)提供。

钾

当本发明组合物包含CK2时，合适地，所述组合物还包含钾离子。钾离 子通常不是包含PKA的组合物所需要的，但可任选包含在所述组合物中，例 如当包含PKA的组合物还包含CKII时。

合适地，钾离子作为25-50mM K离子提供，例如KCl或醋酸钾 (CH₃COOK)。

钾离子(例如KCl)不是必需的，但有利地对于α-β同四聚体CK2的激 酶活性具有促进作用。

cAMP

环一磷酸腺苷(cAMP)可任选地包含在本发明的组合物中，特别是当 所述组合物包含PKA时。特别地，当仅使用PKA的α形式时，cAMP是任 选的。然而，当使用PKA的β形式时，cAMP包含在本发明的组合物中是理 想的，并且具有提高/实现PKA活性的优点。

cAMP合适地作为二丁基cAMP或作为常规cAMP提供，其中任一种化 合物均可商购获得，例如通过Sigma Inc.或Merck Inc.。二丁基cAMP具有可 透过质膜的优点。另外，常规cAMP不透过质膜。由于本发明的组合物合适 地在细胞外应用，合适地常规cAMP用作本发明的cAMP，原因是这提供了 最小化或消除对于细胞内信号传导的任何副作用的优点，并提供了将添加的 cAMP限制在细胞外环境的优点，由此有助于保持其与本发明组合物的酶一 起定位。

优点

本发明的一个优点是Nogo受体的磷酸化阻抑Nogo信号传导，这允许神 经突生长。

本发明的一个优点是Nogo受体的磷酸化阻断其激动剂的结合。

本发明在脊髓损伤中具有特定应用。

本发明的一个优点是Nogo受体被靶向。这优点在于提供以不依赖配体 的方式起作用的方法和组合物。

组合

将本发明与软骨素信号传导抑制相组合是有利的。实现该目的的一种方 式是可应用软骨素酶(例如软骨素酶ABC)，以促进允许神经突生长的情况。 本发明的一个优点是软骨素酶靶向不同于Nogo途径的途径。因此，将软骨 素酶与本发明的治疗或组合物相组合以提供促进神经突生长的双靶向方法是 有利的。

将本发明与靶向Nogo途径的其他方式相组合是有利的。例如，将本发 明与应用抗Nogo受体抗体相组合是有利的，或者将本发明与针对Nogo受体 的配体的抗体相组合是有利的。这些实施方式的一个优点是，将多重干扰用 于靶向信号传导途径中的相同位点。因此，有利地避免了不良副作用或交叉 信号传导至其他途径的可能性。

将本发明与抗LINGO抗体相组合也是有利的。示例性抗LINGO抗体可 如Biogen Inc.所提供。这样的组合具有靶向不同物理分子却仍位于相同的总 体信号传导复合物中的优点。因此，与靶向多种不同分子的优点相结合，这 样的组合提供了信号传导保真性(即，仅靶向单一途径)，并由此意图实现 更强有力的信号阻断的优点。

将本发明与机能恢复(rehabilitation)相组合也是有利的，这可有效促进神 经元的适当联系。这样的组合还可有利地减少异常的联系。

本发明的组合物可用于在手术(例如神经手术)期间、之后施用。在该 实施方式中，手术是对于成体神经组织损伤的一种实例。因此，可在手术期 间应用激酶、ATP以及任何必要的金属离子。

任选地，Cethrin也可包含在本发明的组合物中，通常以每次给药0.3、 1mg、3mg、6mg或9mg来使用。

本发明组合物中应用基质或包含基质具有有助于所添加的试剂保持或维 持在损伤处的优点。

炎症抑制剂可包含在本发明的组合物中，和/或可在损伤/手术之后尽快 地应用。

可进行干细胞移植，合适地可在经过炎症之后进行干细胞移植(否则移 植的细胞可能被宿主免疫系统杀伤)。通过举例的方式，对于小鼠，在损伤后 5天移植细胞，即在炎症之后移植细胞。

因此，炎症抑制剂、Rho抑制剂(例如C3毒素)和/或ES细胞可有用 地与本发明组合。关于ES细胞，对于Nogo信号传导的强力激活可抑制神经 元分化，但促进神经元干细胞的胶质分化。因此，如果Nogo在损伤区域有 活性，则可有利地通过抑制Nogo信号传导而促进移植细胞的分化。

神经突生长抑制的缓解

本领域中长久存在的问题是，在损伤的成体神经组织中神经元重新生长 或再生不良，或根本不发生重新生长或再生。在这种情况下，损伤的神经组 织可意味着通过损害而赋予的物理损伤，或可通过神经疾病(例如退行性疾 病)而赋予的损伤。明显地，在任何这种情况下，神经组织的再生或重新生 长都是合乎需要的。

在健康成体神经组织中神经突生长受到抑制是熟知的。本发明的一个目 的是去除或缓解该抑制。这样做的净结果是例如通过神经突生长而促进或增 强再生。这可被称为刺激神经突生长。事实上，对于大多数应用来说，在神 经突生长和缓解神经突生长抑制之间并无实质的差异。然而，基于本发明人 所获得有关该隐含系统(cryptic system)的认识和理解，统一地使用“缓解神经 突生长抑制”来描述本发明。这是因为，已经确定，某些Nogo家族配体是 神经突生长的抑制剂。因此，经Nogo受体的信号传导而产生的抑制缓解是 本发明的主题。如果将去除该抑制视为“刺激”神经突生长是有利的话，则可 将其间或地记录或引用。它并不偏离本发明去除或缓解神经突生长抑制的总 体目的，由此允许或促进(或事实上刺激)神经再生，例如经神经突生长而 再生。

另外，本发明可有利地与神经突生长的一种或多种刺激剂组合，由此同 时激发生长以及去除或缓解抑制，并导致更显著或更强的重新生长或再生。

其他应用

在一种广泛的方面，本发明涉及用作药剂的PKA。

在一种广泛的方面，本发明涉及用作药剂的CK2。

在一种广泛的方面，本发明涉及CK2的新的细胞外用途。

本发明公开了蛋白激酶A(PKA)以及CK2可抑制Nogo信号传导。最 合适地，本发明所用的激酶是PKA。

本发明涉及缓解脊髓损伤之后的神经突生长抑制，特别是通过抑制Nogo 信号传导缓解脊髓损伤之后的神经突生长抑制。

本发明的应用不仅限于缓解神经突生长抑制。Nogo信号传导涉及神经元 在发育过程中的分化(9，10)、突触形成(11)以及迁移(12)，还涉及阿耳 茨海默病(Alzheimer′s disease)，这是一种导致痴呆的神经退行性疾病 (13-15)。因此，本发明可有利地应用于这些领域，和特别合适的领域，例 如缓解神经突生长抑制。

特别地，本发明可广泛应用于神经退行性疾病，例如阿耳茨海默病和/ 或帕金森病(Parkinson′s disease)。这是本发明特别合适的应用，原因是NogoR 可结合淀粉状蛋白B并结合其前体APP。

本发明还适用于更急性的神经疾病，例如中风。

Nogo的抑制导致髓鞘形成增加。因此，本发明可用于具有髓鞘形成的任 何疾病，例如多发性硬化症。因此，本发明可适用于多发性硬化症。精神分 裂症是与髓鞘形成缺陷有关的神经疾病的另一个实例。因此，本发明可适用 于精神分裂症。另外，本发明涉及用于在系统中增加髓鞘形成的方法，所述 方法包括在所述系统中对于Nogo受体进行磷酸化，所述磷酸化合适地通过 将PKA和/或CKII添加至所述系统而进行。

本发明还涉及一种抑制神经突生长抑制剂(例如Nogo配体)与Nogo 受体结合的方法，所述方法包括诱导所述Nogo受体的磷酸化，例如在丝氨 酸281处的磷酸化。

附图说明

图1：BDNF促进RA处理的SH-SY5Y的神经突生长，并诱导NgR1磷 酸化。(A)将SH-SY5Y细胞与标明的试剂一起孵育。使用相差显微技术来获 取细胞图像。(B)在从(A)中所取的图像中计数延伸超过40μm的神经突样结 构的细胞数量和细胞总数。检测各样品中超过300个细胞。将延伸超过40μm 的神经突样结构的细胞的比例表示为细胞总数的百分数。显示了三个实验的 平均值。误差棒表示各实验之间的S.E.(标准误差)。使用t检验来分析数据。 (C)在与或未与BDNF一起孵育24小时后，从RA处理的SH-SY5Y细胞制 备细胞总提取物，并通过SDS-PAGE分析。使用标明的抗体来进行免疫印迹。 (D)将从使用RA和BDNF二者处理的细胞制备的细胞总提取物与标明的试 剂一起在37℃下孵育1小时。使用抗NgR1抗体进行免疫印迹。(E)在存在 或不存在下述物质之一的情况下，将RA处理的SH-SY5Y细胞与BDNF一 起孵育24小时：PKC抑制剂-500nM或PKA抑制剂-2μM KT5720或PKA抑制剂肽14-22；或500nM或1μM的酪蛋白激酶抑制剂。 通过SDS-PAGE分析从这些细胞制备的细胞总提取物。使用抗NgR1抗体进 行免疫印迹。

图2：在不存在BDNF的情况下，CK2促进RA处理的SH-SY5Y细胞 的神经突生长。(A)将RA处理的SH-SY5Y细胞与标明的试剂一起孵育24 小时。使用相差显微技术来获取细胞图像。(B)在从(A)中所取的图像中计数 延伸超过40μm的神经突样结构的细胞数量和细胞总数。检测各样品中超过 300个细胞。如图1B所示进行计算。单独RA与RA+CKII+ATP之间的t检 验结果为P＝0.0014。(C)Myc标记的野生型和突变体形式的NgR1在SH-SY5Y 细胞中过表达。使用RA、CK2以及ATP处理细胞。使用抗Myc抗体检测过 表达的NgR1-Myc。(D)将过表达281S/A突变体NgR1-Myc的SH-SY5Y细 胞与RA和NEP 1-40一起孵育。(E)如(C)所示处理过表达281S/D突变体 NgR1-Myc的SH-SY5Y细胞。

图3：CK2磷酸化NgR1并抑制髓鞘质相关蛋白与NgR1结合。(A)Myc 标记的野生型、281S/A或281S/D突变体NgR1在COS7细胞中过表达。将 该过表达的细胞与ATP和CK2的组合或NEP 1-40一起在37℃下孵育30分 钟。在使用PBS洗涤之后，将细胞与Hisx6标记的Nogo-GFP一起在4℃下 孵育3小时。固定细胞并使用抗Myc和抗GFP抗体进行免疫荧光。(B)如(A) 中所示处理过表达Myc标记的野生型NgR1的COS7细胞。提取蛋白并使用 抗Myc抗体对Myc标记的NgR1进行免疫沉淀。通过抗GFP抗体来检测共 沉淀的Hisx6标记的Nogo-GFP。(C)使用生物素来标记过表达NgR1的COS7 细胞中的细胞表面蛋白。对生物素化蛋白进行分级分离，并通过SDS-PAGE 来分析。使用抗Myc抗体来检测生物素化的NgR1-Myc。(D)在存在或不存 在CK2的情况下，将过表达野生型NgR1-Myc或281S/A突变体NgR1-Myc 的COS7细胞与α-³²P-ATP一起孵育。对Myc标记的蛋白进行免疫沉淀，并 使用SDS-PAGE进行分析。将蛋白印迹至PVDF膜上，并将膜曝光于X射线 胶片，以检测掺入的³²P。在放射自显影术之后，将膜用于使用抗Myc抗体 的免疫印迹。(E和F)如(A)所述处理过表达Myc标记的野生型、281S/A 或281S/D突变体NgR1的COS7细胞。在使用PBS洗涤之后，将细胞与His 标记的OMgp(E)或HA标记的MAG(F)一起在4℃下孵育3小时。固定细 胞，并使用抗Myc抗体和抗His抗体(E)或抗Myc抗体和抗HA抗体(F)进行 免疫荧光。

图4：含有人NgR1中的丝氨酸²⁸¹的CK2靶基序在脊椎动物NgR1和 NgR2中是保守的。(A)将人(GenBank登录号NM 023004)、小鼠(NM  022982)、大鼠(AF462390)、斑马鱼(NM 203478)以及鸡(XM415292) 的NgR1中的C末端侧翼区域的氨基酸序列进行比较。与人NgR1相同的氨 基酸使用红色标记。(B)对人NgR1(GenBank登录号NM 023004)、NgR2 (NM 178570)以及NgR3(NM 178568)和小鼠NgR1(NM 022982)、NgR2 (NM 199223)以及NgR3(NM 177708)中的C末端侧翼区域的氨基酸序 列进行比较。(C)在存在或不存在CK2的情况下与α-³²P-ATP一起孵育之后， 从过表达Myc标记的NgR2的COS7细胞制备细胞总提取物。从细胞总提取 物免疫沉淀Myc标记的NgR2并通过SDS-PAGE分析。将蛋白印迹至PVDF 膜上，并如图3c中所示处理膜。(D)将过表达Myc标记的人NgR2的COS7 细胞与或不与ATP和CK2的组合一起在37℃下孵育30分钟。在使用PBS 洗涤之后，将细胞与HA标记的MAG一起在4℃下孵育3小时。固定细胞， 并使用抗Myc抗体和抗HA抗体进行免疫荧光。(E)在与CK2和ATP一起 孵育之后，使用胰蛋白酶消化凝胶中的NgR2-Myc，并使用质谱分析胰蛋白 酶消化肽(tryptic peptides)。显示了检测为磷酸肽的肽序列。

图5：CK2拯救出生后大鼠神经元免于由髓鞘质相关抑制剂Nogo、MAG 以及OMgp导致的神经突生长抑制。(A)在标明的试剂的存在下，将出生后 第5天的大鼠的DRG神经元与或不与Nogo-66片段一起孵育。在添加标明 的试剂之后24小时，固定细胞并通过免疫荧光检测α-微管蛋白III。(B)在 从(A)中所取的图像中，计数延伸超过20μm的神经突的细胞数量和α-微管 蛋白III阳性细胞总数。将延伸超过20μm的神经突样结构的细胞群表示为 细胞总数的百分数。显示了三个实验的平均值。误差棒表示各实验之间的S.E. (标准误差)。使用t检验来分析数据。(C和D)将来自出生后第5天的大鼠 的DRG神经元接种于包被有聚-D-赖氨酸和MAG(C)或OMgp(D)的8孔腔 室载玻片上，与或不与CK2一起孵育24小时。固定细胞并使用抗α-微管蛋 白III抗体进行免疫荧光。(E)从(C和D)中所取的图像中，计数延伸超过20 μm的神经突的细胞数量和α-微管蛋白III阳性细胞总数。将延伸超过20μm 的神经突样结构的细胞群表示为细胞总数的百分数。如(B)所述进行计算。 (F)在存在或不存在CK2的情况下，将来自出生后第8天的大鼠的CG神经 元与或不与标明的髓鞘质相关抑制剂一起孵育24小时。固定细胞并通过免疫 荧光检测α-微管蛋白III。(G)在存在或不存在CK2的情况下，将过表达野 生型NgR1-Myc或281S/A突变体NgR1-Myc的CG神经元与或不与Nogo片 段一起孵育24小时。通过免疫荧光检测过表达的NgR1-Myc。(H)在(G)中 所取的图像中，计数延伸超过20μm的神经突的Myc阳性细胞的数量和Myc 阳性细胞总数。如(B)所述进行计算。

图6显示了脊椎动物NgR1的氨基酸序列。NgR1的NCBI登录号为大鼠， AF 462390；人，NM 023004；小鼠，NM 022982；斑马鱼，NM 203478；鸡， XM 415292。红色字符显示了与人NgR1具有同源性的氨基酸。绿色字符显 示了与人NgR1具有相似性的氨基酸。NF，N末端侧翼区域；LRR，富亮氨 酸重复子的基序；CF，C末端侧翼区域。

图7显示了：A，将RA处理的SH-SY5Y细胞与标明的试剂一起培养24 小时。固定后，使用抗β-微管蛋白III抗体检测β-微管蛋白III。B，野生型 或281S/A突变体NgR1-Myc在SH-SY5Y细胞中过表达。在使用RA处理5 天之后，将这些细胞与500U/ml PKA和500nM(74kBq/ml)ATP一起孵育。 然后，对NgR1-Myc进行免疫沉淀，并使用SDS-PAGE进行分析。C，将过 表达野生型或281S/A突变体NgR1-Myc的RA处理的SH-SY5Y细胞与500 U/ml PKA和500nM ATP一起孵育24小时，并进行固定。使用抗Myc抗体 检测NgR1-Myc。PKA和CK2诱导了RA处理的SH-SY5Y细胞的神经突生 长(图7A)。PKA磷酸化了野生型NgR1-Myc(图7B)。丝氨酸281处的诱 变显著抑制了使用PKA的磷酸化(图7B)和PKA处理之后的神经突生长(图 7C)。因此，PKA和CK2均可磷酸化NgRA1并可消除Nogo信号传导对神 经突生长的抑制作用。

图8显示了人NgR的氨基酸序列。NgR的NCBI登录号如图4B所述。 红色字符显示了与人NgR1具有同源性的氨基酸。实心三角显示了人NgR1 中丝氨酸281的位置。

图9显示了照片和序列比对。(A)全长PirB在COS7细胞中表达，C末 端带有链霉亲和素结合肽(SBP)标签。将COS7细胞与2000U/ml PKA、5 mM MgSO₄以及100μM 32P-ATP一起在OptiMEM(Invitrogen)中37℃下孵 育1小时。在孵育之后，洗涤细胞并使用0.5％Triton X-100，20mM Tris HCl (pH8.0)和150mM NaCl提取蛋白。使用链霉亲和素-磁珠(Invitrogen)从提 取物沉淀SBP标记的PirB。通过SDS-PAGE分析与磁珠结合的蛋白，并通 过放射自显影检测掺入的³²P。(B)除使用冷ATP之外，如(A)中所述来处理 过表达PirB的COS7细胞。使用考马斯亮蓝G-250对SDS-PAGE分析的蛋 白进行染色。切出与PirB对应的条带，并通过质谱分析。通过质谱检测到的 磷酸肽的氨基酸序列置入框内。实心三角表示磷酸化的氨基酸丝氨酸425。 对于人LILRB1、LILRB2、LILRB3以及LILRB5与大鼠和小鼠PirB的磷酸 化位点周围的氨基酸序列进行了比较。使用红色字符标明与小鼠PirB具有同 源性的氨基酸残基。

图10显示了照片和直方图。(A)从出生后第5和6天的129X1/SvJ JmsSlc (白化病)小鼠制备内嗅区-海马切片的器官型培养物。每2天更换培养基。 在体外第10天(DIV)，使用无菌解剖刀片横断内嗅区-海马投射。将损伤切 片与或不与1250U/ml PKA和100μM ATP一起孵育8天。在体外第17天， 将小试样的Dil糊剂(Invitrogen)涂覆于切面的内嗅区。在体外第18天，使 用共聚焦显微术来观察切片以检查内嗅区-海马投射的再生。在体外第10天 形成的损伤的位置标示为白色点线。(B)使用ImageJ(1.42q版，National  institute of health，USA)检测齿状回附近的Dil信号强度。所检测的区域(100 μm²)在(A)中标为空心白色方框。将强度标示为对照(未损伤)中Dil信号 的百分数。以一式三份重复实验5次。典型的图像标示在(A)中，5次独立实 验的平均值绘制于(B)中。使用t检验评价统计学显著性。

下面通过实施例来描述本发明。这些实施例意为描述性，并非意图限制 所附的权利要求。

实施例

方法和试剂

人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y购自ATCC。哈姆F12(Ham’s F12) 培养基、Neurobasal-A培养基、小鼠抗GFP单克隆抗体和B27添加剂购自 Invitrogen。维甲酸、肌酸以及肌酸磷酸激酶、小鼠抗Myc单克隆抗体以及聚 -D-赖氨酸购自Sigma。大鼠神经元和NSF-1添加剂购自LONZA。BDNF、 CK2抑制剂(4，5，6，7-四溴-2-氮杂苯并咪唑)、KT 5720、 豆蔻酰化PKA抑制剂肽14-22酰胺和NEP1-40肽购自Merck。抗LINGO-1 抗体购自Millipore。抗Nogo A抗体和抗NgR抗体购自Santa Cruz。ATP购 自Roche。CK2和λ蛋白磷酸酶购自New England Biolab。胶原IV、OMgp-His 以及Nogo-Fc购自R&D。家兔抗Myc多克隆抗体购自Cell Signaling。 α-³²P-ATP购自GE healthcare。

细胞培养

在具有10％胎牛血清的哈姆F12培养基中于37℃、5％CO₂和95％空气 中培养SH-SY5Y细胞。本文描述的实验中使用15和21之间的继代数量。 进一步的继代诱导自发分化，并且在不使用BDNF的情况下，细胞也倾向于 延伸神经突(数据未显示)。对于RA处理，将细胞接种(20,000个细胞/孔) 于胶原IV包被的4孔腔室载玻片上。在培养24小时之后，将培养基更换为 含有10μM RA和10％胎牛血清的哈姆F12培养基。在第3天将培养基更换 为新鲜培养基，并在培养5天之后将细胞用于实验。Encinas等(18)报道了， 只有当以低密度培养细胞时，RA处理的SH-SY5Y细胞才在撤去血清之后启 动细胞凋亡。本文使用的细胞密度高于Encinas等的论文(18)中的描述，并且 由于血清或BDNF耗竭而导致的细胞死亡并不显著。在本文中，使用RA处 理5天的SH-SY5Y细胞被称为RA处理的SH-SY5Y。对于BDNF处理，使 用无血清哈姆F12培养基洗涤RA处理的SH-SY5Y细胞，并在无血清哈姆 F12培养基中与25ng/ml BDNF一起孵育24小时。将作为对照(仅RA)， RA处理的SH-SY5Y细胞与单独的无血清哈姆F12一起孵育24小时。

将来自出生后第5天的大鼠的DRG神经元重悬于含有2mM谷氨酰胺 和2％NSF-1添加剂的Neurobasal-A培养基中，并接种(5,000个细胞/孔) 于包被有聚-D-赖氨酸的8孔腔室载玻片上。在接种后4小时将培养基更换为 新鲜培养基。

将来自出生后第8天的大鼠的CG神经元重悬于含有25mM KCl、2mM 谷氨酰胺和2％B27添加剂的Neurobasal-A培养基中，并接种(10,000个细 胞/孔)于包被有聚-D-赖氨酸的8孔腔室载玻片上。在接种后4小时，将培 养基更换为新鲜培养基。

细胞的CK2处理

对于RA处理的SH-SY5Y细胞的CK2处理，使用无血清哈姆F12洗涤 细胞，并在含有25mM KCl和5mM MgCl₂的无血清哈姆F12中与100nM  ATP或500U/ml CK2中任一者或二者一起孵育24小时。

对于来自出生后第5天的大鼠的DRG神经元的CK2处理，在接种后孵 育4小时之后，将培养基更换为含有2mM谷氨酰胺、10mM KCl、5mM  MgCl₂以及具有500U/ml CK2的2％NSF-1添加剂的neurobasal-A培养基。 作为对照(未处理)，将培养基更换为无CK2的培养基。对于来自出生后第 8天的大鼠的CG神经元，使用含有2mM谷氨酰胺、2％B27添加剂以及25 mM KCl的neurobasal-A培养基。

对于COS7细胞的CK2处理，使用无血清哈姆F12培养基洗涤细胞，并 与或不与500μM ATP和1200U/ml CK2一起在含有25mM KCl和5mM  MgCl₂的无血清哈姆F12培养基中在37℃下孵育30分钟。

使用α³²P-ATP通过CK2磷酸化

对于过表达Myc标记的NgR1或NgR2的COS7细胞的处理，从培养皿 刮除细胞。使用PBS洗涤细胞，并重悬于含有25mM KCl、5mM MgCl₂、 1200U/ml的CK2、200μM ATP(3.7kBq/ml)的PBS中。在30℃下孵育30分 钟之后，终止磷酸化，并使用0.1％Triton X 100、250mM NaCl以及25mM  EDTA提取蛋白。使用抗Myc抗体对Myc标记的蛋白进行免疫沉淀，并通过 SDS-PAGE进行分析。

髓鞘质相关蛋白的表达和纯化

从使用Superscript II逆转录酶(Invitrogen)和oligo dT自人胎脑纯化的 mRNA(TAKARA)合成第一链DNA。使用该第一链DNA作为模板通过PCR 扩增人Nogo-A的cDNA。扩增的Nogo-A(Genbank登录号NM 020532)片 段Nt 3444-3709被整合至pEGFP N2(TAKARA)。切除Nogo-A片段和EGFP 区域，并将其整合至pcDNA 3.1/His载体(Invitrogen)中。从载体中切出Hisx6、 Nogo-A以及EGFP区域，并将其整合至pBEn-SBP-SET载体(Stratagene) 中，然后转染至ArcticExpress(DE3)RIL大肠杆菌(Stratagene)中。在18℃ 下通过1mM IPTG过夜诱导Hisx6-Nogo-A片段-EGFP蛋白的表达。使用 TALON柱(TAKARA)纯化Hisx6Nogo-A片段-GFP。

对于人MAG(NM 002361)的表达，使用第一链DNA作为模板通过PCR 扩增MAG的cDNA(Nt 198-1655)，并通过PCR在MAG cDNA的3′末端添 加终止密码子。将MAG cDNA整合至pDisplay载体(Invitrogen)。将质粒转 染至COS7细胞中。使用含有10％血清和600μg/ml遗传霉素(geneticin， Invitrogen)的DMEM维持转染的细胞。对于MAG的纯化，使用具有2mM L-谷氨酰胺的VP-SFM培养基培养细胞3天。使用HA-标签蛋白纯化试剂盒 (Sigma)从条件培养基纯化HA标记的MAG。

NgR1-Myc和NgR2-Myc的表达

使用第一链DNA作为模板通过PCR扩增NgR2cDNA。将PCR产物连 接至pCR Blunt载体(Invitrogen)。验证插入pCR Blunt中的NgR2cDNA的 序列。编码全长NgR1的IMAGE克隆购自Gene Service Inc.。分别将NgR1 (NM 023004，Nt.184-1543)和NgR2(NM 17857，Nt.1-1200)的cDNA转移至具 有Sail和Kpnl位点的pDisplay载体中。从具有Kpnl和Notl的载体切除编码 NgR、Myc标签和跨膜结构域的区域。将Kpnl-Notl片段整合至pCEP4 (Invitrogen)中。将使用Nucleofector(amaxa)的电穿孔用于转染。将 NgR/pDisplay转染至COS7中并将NgR1-Myc-跨膜结构域/pCEP4转染至 SH-SY5Y细胞中。对于向大鼠神经元中的转染，使用NeuroMag试剂盒(OZ  Bioscience)。将神经元于包被有层粘连蛋白且带有或没有Nogo-66片段的8 孔腔室载玻片上培养24小时，并用于转染。转染之后，再培养神经元24小 时，并将CK2添加至培养基中至终浓度为500U/ml。使用CK2培养神经元 24小时，并进行固定。

神经突生长测定

对于使用髓鞘质相关抑制剂的神经突生长抑制，将1μg的Nogo-Fc、500 ng的HA标记的MAG或500ng的His标记的OMgp点在包被有聚-D-赖氨 酸的8孔腔室载玻片的不同孔上，并于净化台上不遮盖过夜。在使用PBS洗 涤两次之后，接种神经元，如“细胞培养”部分所描述进行处理。在37℃下培 养神经元24小时，并使用于PBS中的2％多聚甲醛和0.1％triton X100进行 固定。使用抗α微管蛋白III单克隆抗体进行免疫荧光。

髓鞘质相关蛋白的结合测定

在使用或不使用CK2处理之后，将过表达野生型或突变体NgR的COS7 细胞与Hisx6标记的Nogo-GFP(10μg/ml)、HA-MAG(50μg/ml)或Hisx6标 记的OMgp(10μg/ml)在PBS中在4℃下一起孵育3小时。洗涤细胞两次，并 使用于PBS中的2％多聚甲醛在4℃下固定20分钟，然后使用于PBS中的 2％多聚甲醛和0.1％triton X100进行固定。为了检查NgR1在细胞表面上的 表达水平，使用细胞表面蛋白分离试剂盒(Pierce)。使用生物素标记过表达 NgR1的COS 7细胞的表面蛋白，并进行提取。使用链霉亲和素珠对生物素 化蛋白进行沉淀，并通过SDS-PAGE进行分析。通过SDS-PAGE分析从5×10⁶个细胞分级的各样品。

免疫印迹

从培养皿刮除细胞，并使用PBS洗涤两次，然后，重悬于含有0.1％Triton X100和磷酸酶抑制剂混合物(cocktail，Roche)以及无EDTA的蛋白酶抑制 剂混合物(Roche)的PBS中。在于冰上孵育15分钟之后，在14,000×g于4℃ 离心样品20分钟。通过SDS-PAGE分析含有30μg蛋白的上清液，并将其印 迹至PVDF膜上。在封闭缓冲液(5％脱脂乳、于PBS中的0.4％Triton X-100) 中孵育该PVDF膜1小时，之后在稀释于封闭缓冲液的第一抗体中孵育以及 在使用标记有辣根过氧化物酶的合适的第二抗体中孵育。使用ECL或ECL Plus试剂盒(GE healthcare)显现结合的抗体。

免疫荧光测定

使用PBS洗涤固定的细胞，并与于PBS中的3％BSA和0.5％Triton  X-100一起在室温下孵育30分钟，之后与于PBS中的第一抗体、3％BSA以 及0.5％Triton X-100一起在37℃下孵育2小时。在使用PBS洗涤之后，将 细胞进一步与于PBS中的合适的第二抗体、3％BSA以及0.5％Triton X-100 一起在37℃下孵育30分钟。在使用PBS洗涤3次之后，使用具有DAPI (VECTOR)的VECTASHIELD封固介质封固细胞并使用共聚焦激光扫描显 微术来观察。

免疫沉淀

在CK2处理(图3C)或与Nogo-GFP(图3B)一起孵育之后，使用含 有磷酸酶抑制剂混合物和无EDTA蛋白酶抑制剂混合物的于PBS中的0.1％ Triton X100来提取蛋白。将提取物与25μg的抗Myc家兔多克隆抗体和蛋白 A磁珠(New England Biolab)一起在4℃下孵育2小时。在使用于PBS中的 0.1％Triton X100洗涤5次之后，将磁珠与1×SDS-PAGE上样缓冲液一起孵 育，并加热3分钟。

质谱

使用500U/ml CK2和500μM ATP培养过表达NgR2-Myc的COS7细胞 1小时。细胞提取和使用抗Myc抗体对NgR2-Myc免疫沉淀如上所述。通过 SDS-PAGE分析沉淀的蛋白，并使用胶体考马斯亮蓝染色来显现蛋白。从凝 胶切出对应于NgR2-Myc的条带。在凝胶中使用胰蛋白酶消化凝胶碎片中的 蛋白。通过Cambridge Centre for Proteomics(Cambridge，UK)来进行质谱 分析。

实施例1：Nogo信号传导抑制RA处理的SH-SY5Y细胞的神经突生长

在RA处理5天之后，SH-SY5Y细胞显示了有限的形态学变化，但在使 用RA 5天和使用BDNF 1天的顺序处理之后观察到有效的神经突生长(图 1A)，如Encinas等(18)先前所报道的。本发明人发现，NgR1与Nogo-66结 合的竞争性抑制剂NEPl-40(28)促进在没有BDNF的情况下导致通过RA 从SH-SY5Y细胞分化的神经细胞的神经突生长(图1A和B)。这表明，Nogo 信号传导抑制SH-SY5Y衍生的神经细胞的神经突生长，并且BDNF阻抑 Nogo信号传导的作用。

如图1C所示，参与Nogo信号传导的蛋白Nogo-A、NgR1以及LINGO-1 表达于RA处理的SH-SY5Y细胞。尽管在BDNF处理之后Nogo-A和 LINGO-1均未显示显著变化，但通过BDNF处理增加了NgR1的上侧条带(图 1C，箭头)。仅在无磷酸酶抑制剂的情况下，使用λ磷酸酶才减少了上侧条 带(图1D)。这些结果表明BDNF促进RA处理的SH-SY5Y细胞中外源性 NgR1的磷酸化，导致SDS-PAGE上较低的移动性。为了研究哪种激酶参与 了NgR1的磷酸化，在存在激酶抑制剂的情况下，将RA处理的SH-SY5Y细 胞与BDNF一起孵育。PKC抑制剂和与PKA抑制剂KT 5720 和PKA抑制剂肽均未显示对于NgR1的上侧条带的水平有作用。然而，CK2 抑制剂减少上侧条带(图1E)。与此一致，已知BDNF激活神经细胞中的CK2 (29)。这些结果表明CK2样活性参与NgR1的磷酸化。因此，BDNF通过CK2 样活性来诱导NgR1的磷酸化，这与通过BDNF促进神经突生长是一致的。

实施例2：在使用CK2而不使用BDNF进行细胞外处理之后，RA处理的SH-SY5Y细胞延伸神经突

NgR1是糖基磷脂酰肌醇锚定的膜蛋白，其不具有胞质结构域(30，31)。 因此，在BDNF处理之后NgR1中的磷酸化位点是细胞外的，且这些位点可 通过使用CK2的细胞外处理而被磷酸化。向培养基中单独添加ATP和单独 添加CK2均不诱导SH-SY5Y衍生的神经细胞的神经突生长。然而，在使用 CK2和ATP二者同时温育24小时之后，细胞显示显著的神经突生长(图2A 和2B)。因此，使用CK2而不使用BDNF进行细胞外处理阻抑了Nogo信 号传导对SH-SY5Y衍生的神经细胞的神经突生长的抑制性作用。

实施例3：人NgR1中的丝氨酸²⁸¹是用于CK2介导的Nogo信号传导阻抑的关键靶

人NgR1含有CK2磷酸化的5个候选位点，苏氨酸¹⁷³、丝氨酸¹⁹²、丝 氨酸²⁸¹、苏氨酸³²⁵以及丝氨酸³⁴⁵，这些候选位点被取代为丙氨酸。该实施 例中使用的激酶是CK2。当使用ATP和CK2处理过表达这些NgR1突变体 的RA处理的SH-SY5Y细胞24小时时，NgR1中带有丝氨酸²⁸¹-丙氨酸取代 (281S/A)的细胞未能显示显著的神经突生长(图2C)。然而，携带281S/A 突变体NgR1的细胞仍旧具有延伸神经突的潜力，原因是在使用NEP1-40处 理24小时之后，它们显示神经突生长(图2D)。这些结果表明281S/A突变 体NgR1并非具有组成性活性，并且Nogo的结合为RA处理的SH-SY5Y的 神经突生长抑制所需要的。

NgR1中的丝氨酸²⁸¹被取代为天门冬氨酸(281S/D)，突变体NgR1在 RA处理的SH-SY5Y细胞中过表达(图2E)。尽管天门冬氨酸带有负电荷(类 似磷酸化的丝氨酸残基)，过表达281S/D突变体NgR1的细胞在RA处理(不 使用CK2和ATP共同处理)之后不延伸神经突(图2E)。这表明281S/D突 变体NgR1并不是NgR1的组成性阴性突变体。

这些结果表明即使可通过使用CK2的细胞外处理将其他膜蛋白磷酸化， 但人NgR1中的丝氨酸²⁸¹是CK2阻抑Nogo信号传导的抑制性作用所必需的，

(32，33)。

实施例4：CK2抑制髓鞘质相关抑制剂结合野生型NgR1，但不抑制其结合带有丝氨酸²⁸¹取代的突变体NgR1

Nogo-66片段结合过表达野生型NgR1的COS7细胞(图3A)。然而， Nogo-66片段不能结合使用CK2和ATP处理之后的细胞。当281S/A突变体 NgR1(代替野生型NgR1)被过表达时，CK2处理不能阻断Nogo-66片段的 结合。NEP1-40抑制Nogo-66片段与野生型和281S/A突变体NgR1的结合。 当281S/D突变体NgR1被过表达时，甚至在未使用CK2处理的情况下也没 有观察到Nogo-66片段的结合(图3A右)。结合图2E的结果，281S/D突变 体NgR1既不能结合Nogo-66也不能通过外源性NgR1抑制信号传导。还在 免疫沉淀测定中观察到了Nogo-66片段和过表达的NgR1之间的相互作用(图 3B)。尽管单独使用ATP或CK2处理不能抑制该相互作用，但使用ATP和 CK2共处理抑制Nogo-66片段与过表达的NgR1结合。为了检查突变体和野 生型NgR1-Myc在细胞表面的表达水平，将细胞表面蛋白进行生物素化。通 过蛋白质印迹检测生物素化的NgR1-Myc、野生型、281S/A以及281S/D的 相对水平。

另外，在使用CK2进行细胞外处理之后对过表达的NgR1进行磷酸化。 在α-³²P-ATP的存在下将过表达野生型或281S/A突变体NgR1的COS7细胞 与CK2一起孵育，并对过表达的NgR1进行免疫沉淀。尽管野生型和281S/A 突变体NgR1均被CK2处理磷酸化，但281S/A突变体NgR1的磷酸化比野 生型NgR1的磷酸化弱得多(图3D)。这些结果表明NgR1的丝氨酸²⁸¹为 CK2对NgR1的有效磷酸化和抑制Nogo-66与NgR1之间相互作用的所必需 的。

图3E和F显示了CK2处理抑制OMgp和MAG与野生型NgR1结合， 但不抑制与281S/A突变体NgR1结合。OMgp和MAG均不结合过表达281S/D 突变体NgR1的COS7。这些结果表明CK2处理可抑制Nogo-66、MAG以及 OMgp与NgR1结合，NgR1中的丝氨酸²⁸¹为CK2的作用所必需。

实施例5：人NgR1中的丝氨酸²⁸¹在脊椎动物NgR1和NgR2中均是保守的

图4A显示了丝氨酸²⁸¹位于人NgR1中具有富亮氨酸重复子的C末端侧 翼区域中(30，31)，包含丝氨酸²⁸¹的CK2靶基序在人、小鼠、大鼠、斑马 鱼以及鸡中是保守的。小鼠、大鼠以及鸡的NgR1在C末端侧翼区域中的丝 氨酸³⁰⁴处具有另一个候选CK2靶基序。然而，后一个丝氨基酸在人和斑马 鱼NgR1中不是保守的。

除了CK2靶基序之外，丝氨酸²⁸¹还与PKA靶基序有关，并且PKA靶 基序在其他物种中也是保守的(图4A)。这表明PKA和CK2可磷酸化NgR1， 由此消除了Nogo信号传导对于神经突生长的抑制性作用。然而，本发明人 未能检测到PKA在BDNF处理之后对RA处理的SH-SY5Y细胞中NgR1的 磷酸化作用(图1E)。

另外，含有人NgR1的丝氨酸²⁸¹的CK2靶基序在人和小鼠NgR2中是 保守的(图4B)。人NgR1中的丝氨酸²⁸¹与人NgR2中的丝氨酸²⁸²对应。尽 管NgR3在C末端侧翼区域具有CK2磷酸化的候选靶位点(这与NgR1和 NgR2相似)，但该位点在NgR1的丝氨酸²⁸¹的上游11个氨基酸。相反地， NgR1中含有丝氨酸²⁸¹的PKA靶基序在三个NgR中是保守的。

与NgR2中的保守性CK2靶基序一致，CK2磷酸化NgR2(图4C)，CK2 处理抑制MAG与过表达NgR2的COS7细胞结合(图4D)。尽管人NgR2 含有两个CK2靶位点丝氨酸²⁸²和苏氨酸³⁶⁶，但仅含有丝氨酸²⁸²的CK2靶 位点在人NgR1中是保守的。质谱检测出CK2处理之后含有人NgR2的丝氨 酸²⁸²的肽的磷酸化，而非含有苏氨酸³⁶⁶的肽的磷酸化。

实施例6：CK2拯救大鼠神经元免于Nogo、MAG或OMgp对于神经突生长的抑制

本发明人测试了NgR的磷酸化是否可拯救大鼠神经元免于髓鞘质相关 抑制剂对于神经突生长的抑制。当使用CK2处理出生后大鼠的DRG神经元 24小时时，神经元克服了Nogo-66片段对于神经突生长的抑制(图5A和B)。 单独ATP并不阻抑Nogo-66片段的抑制性作用(数据未显示)。尽管BDNF 可诱导RA处理的SH-SY5Y细胞的神经突生长(图1A和1B)，但BDNF并 不能阻断Nogo-66片段对于DRG神经元的作用(图5A和5B)。这表明神经 母细胞瘤细胞和正常神经元在BDNF信号传导方面具有差异，并且该差异与 BDNF在体内对于神经突生长的作用有限是一致的(21-24，26)。

CK2处理可拯救神经元免受Nogo-66片段，及MAG或OMgp对于神经 突生长的抑制(图5C-E)。图5F显示了，当使用CK2处理神经元24小时时， 在Nogo-66、MAG或OMgp的存在下，不仅来自出生后第5天的大鼠的DRG 神经元而且来自出生后第8天的大鼠的小脑颗粒(CG)神经元均能延伸神经 突。

实施例7：CK2不能拯救表达281S/A突变体NgR1的神经元免于Nogo-66对于神经突生长的抑制

为了评价对于NgR1中丝氨酸²⁸¹的需要，在来自出生后第8天大鼠的 CG神经元中过表达野生型和281S/A突变体NgR1。过表达野生型和281S/A 突变体NgR1的两种CG神经元均延伸神经突，所述神经突延伸受到Nogo-66 片段的阻断。在CK2处理24小时之后，在Nogo-66片段的存在下，过表达 野生型NgR1的神经元延伸神经突。相比之下，过表达281S/A突变体的神经 元不能延伸神经突，即使在使用CK2处理24小时之后也是如此(图5G和 5H)。这些结果表明CK2可抑制通过野生型NgR1而非通过281S/A突变体 NgR1的Nogo信号传导，这与图2和图3是一致的。因此，如先前所报道的 (3，4)，通过NgR1的Nogo信号传导可阻断出生后大鼠神经元的神经突生 长，并且NgR1的丝氨酸²⁸¹是CK2阻抑Nogo信号传导对于神经突生长的抑 制性作用所必需的。

实施例8：用于缓解受试者中神经突生长抑制的方法

该实施例显示了用于缓解神经元的神经突生长抑制的方法。在该实施例 中，所述受试者是小鼠。小鼠神经元包含Nogo受体。

使用了脊髓损伤模型。在诱导实验性损伤之后，使所述神经元与能够导 致Nogo受体磷酸化的组合物接触。在该步骤中，应用下面两种组合物中的 一种，通常通过注射或经在实验性损伤时引入的导管来应用：

A)(PKA)：

10-100μM ATP，5-0.05μg PKA和1-10mM MgCl2或醋酸镁；或

B)(CKII)：

10-100μM ATP，5-0.5μg CK2，1-10mM MgCl₂或醋酸镁以及10-50mM  KCl或醋酸钾。

对于人的应用，使用了较高水平的激酶，通常0.05-5mg激酶(PKA或 CK2)。人使用的离子和ATP浓度通常如上所述。

实施例9：PirB/LILRB

Nogo-A、MAG以及OMgp是可结合NgR的髓鞘质相关蛋白(Gonzenbach， R.R.，以及Schwab，M.E.(2008).Disinhibition of neurite growth to repair the  injured adult CNS：focusing on Nogo.Cell Mol Life Sci 65，161-176.)。最近，报 道了小鼠PirB(配对Ig样受体B，NMOl 1095)及其人同源物LILRB(白细 胞免疫球蛋白样受体B)是髓鞘质相关蛋白的第二组受体(Atwal，J.K.， Pinkston-Gosse，J.，Syken，J.，Stawicki，S.，Wu，Y.，Shatz，C，and Tessier-Lavigne， M.(2008))。

PirB是轴突再生的髓鞘质抑制剂的功能性受体(Science 322，967-970.)。 尽管PirB/LILRB的表达表现为局限于脑的某些特定区域，但它可与NgR共 同来抑制神经突生长(Atwal等，同上文)。

在图9中，PirB在COS7细胞中过表达，并且将该细胞与蛋白激酶A (PKA)的催化亚基和ATP一起孵育。细胞表面上的PirB可以是PKA的底 物(图9A)。

质谱显示磷酸化位点是PirB的细胞外结构域中的丝氨酸⁴²⁵。

PKA靶位点在人、大鼠以及小鼠中是保守的(图9B)。这些结果表明除 了NgR的信号传导之外，使用PKA的细胞外处理对于来自PirB/LILRB的信 号传导也具有有利作用。

因此，在一种实施方式中，本发明涉及一种用于缓解神经元的神经突生 长抑制的方法，其中，所述神经元包含PirB/LILRB受体，所述方法包括使所 述神经元与能够导致PirB/LILRB磷酸化的组合物接触，其中所述组合物包含 蛋白激酶A或酪蛋白激酶II。合适地，所述组合物包含蛋白激酶A和酪蛋白 激酶II。合适地，所述磷酸化是与所述PirB/LILRB的丝氨酸425对应的氨基 酸残基的磷酸化。

靶向Nogo和PirB/LILRB二者是有利的，在该实施方式中，本发明提供 了一种用于缓解神经元的神经突生长抑制的方法，其中，所述神经元包含 Nogo受体和PirB/LILRB受体，所述方法包括使所述神经元与能够导致Nogo 受体和PirB/LILRB受体磷酸化的组合物接触，其中，所述组合物包含蛋白激 酶A或酪蛋白激酶II。合适地，所述组合物包含蛋白激酶A和酪蛋白激酶II。 合适地，所述磷酸化是与所述Nogo受体的丝氨酸²⁸¹对应的氨基酸残基的磷 酸化，和与所述PirB/LILRB的丝氨酸⁴²⁵对应的氨基酸残基的磷酸化。

实施例10：根据本发明哺乳动物中枢神经系统的再生

在该实施例中，本发明人证实了本发明对于哺乳动物中枢神经系统的作 用。

内嗅皮质中的神经元在出生后时期形成了至海马齿状回的强投射。内嗅 皮质-海马系统是在阿耳茨海默病中最先受到影响的区域之一，认为该系统中 的问题导致方位感觉受损和记忆障碍。

脑的器官型切片培养物保留了体内系统的许多特征，其广泛用作完整脑 模型。

完整脑中的内嗅区-海马投射能在体外的器官型切片培养物中保留。从出 生后第5-7天的小鼠制备的内嗅区-海马切片在体外培养6天之后显示了损伤 后的再生不良(Kluge，A.，Hailer，N.P.，Horvath，T.L.，Bechmann，I.，and Nitsch， R.(1998).Tracing of the entorhinal-hippocampal pathway in vitro.Hippocampus  8，57-68.Prang，P.，Del Turco，D.，and Kapfhammer，J.P.(2001).Regeneration of  entorhinal fibers in mouse slice cultures is age dependent and can be stimulated  by NT-4，GDNF，and modulators of G-proteins and protein kinase C.Exp Neurol  169，135-147.)。

已知硫酸软骨素蛋白聚糖和髓鞘质相关蛋白是再生的主要抑制剂 (Mingorance，A.，Sole，M.，Muneton，V.，Martinez，A.，Nieto-Sampedro，M.， Soriano，E.，and del Rio，J.A.(2006).Regeneration of lesioned  entorhino-hippocampal axons in vitro by combined degradation of inhibitory  proteoglycans and blockade of Nogo-66/NgR signaling.FASEB J 20，491-493.)。

可观察到小胶质细胞(中枢神经系统(CNS)中的驻留型巨噬细胞)的 迁移，并且在损伤后器官型培养物中胶质细胞可形成胶质疤痕样结构 (Mingorance等，同上文)。内嗅区-海马切片培养物对于损伤的所有这些反 应都与体内正常脑对于损伤的反应相似。因此，总体确定了，在此模型系统 中证实本发明的有效性能够说明本发明在哺乳动物中的适用性。

图10中，来自出生后第5天或6天的小鼠的内嗅区-海马切片在体外 (DIV)第10天被横断，并将它们与或不与PKA和ATP一起孵育8天。

Dil(1，1′-双十八烷基-3，3，3′3-四甲基吲哚菁高氯酸盐)是一种亲脂膜染料， 该染料横向着染整个细胞，但不能通过细胞-细胞相互作用而移动。因此，神 经元的投射可使用Dil来示踪。

在未处理的切片中或使用PKA或ATP处理的切片中，Dil的定位限于横 断面的内嗅区一侧(图10)，表明脑切片的神经网络再生与体内脑中的神经 网络再生一样差。仅在使用ATP和PKA二者一起孵育切片时，才能在横断 面上的海马区一侧观察到Dil(图10)。

这些结果表明使用PKA和ATP的组合处理可克服中枢神经系统再生的 内源性抑制剂，根据本发明促进了神经元网络的再生。

然而，甚至在使用PKA和ATP处理之后，也没有在海马的齿状回以外 检测到Dil。这表明，处理没有改变正常海马中的内层结构(图10)。这是 促进中枢神经系统再生的重要特征，避免了可导致病症的不期望的再生。

因此，根据本发明的PKA的外源性添加表明是促进在正常情况下是受到 严格抑制的中枢神经系统再生的有用方法。

实施例部分的总结

本发明人揭示了，Nogo信号传导可受Nogo受体磷酸化的阻抑。Nogo 受体的磷酸化位点是细胞外的(图3和4)。BDNF诱导由RA导致的SH-SY5Y 细胞分化的神经细胞中的NgR1的胞外结构域磷酸化(图1)。NgR的胞外结 构域磷酸化抑制神经突生长的髓鞘质相关抑制剂Nogo-66、MAG以及OMgp 的结合(图3和4)。

已报道，许多种细胞中存在胞外结构域磷酸化，包括神经元、免疫细胞、 上皮细胞以及内皮细胞(34)。外结构域磷酸化可在底物蛋白被分选至质膜之 后由胞外蛋白激酶催化，和在分选之前由细胞内激酶催化(33，35)。尽管细 胞内激酶将细胞内ATP用作磷酸基团的来源，但胞外蛋白激酶使用细胞外 ATP。估计生理条件下的细胞外ATP浓度在微摩尔水平(36)。当组织受到 损伤时，ATP可通过损伤的质膜从垂死或损伤的细胞释放。可由组织损伤诱 导的炎症也可诱导ATP从多种细胞类型(包括神经元)释放(37)。因此， 细胞外ATP的浓度可因组织损伤而增加。尽管已报道了胞外结构域磷酸化的 体外功能，但其体内功能仍旧不清楚。

最近，揭示胶原XVII的胞外结构域磷酸化可抑制金属蛋白酶导致的胶 原XVII的胞外结构域脱落(shedding)(38)。胶原XVII的胞外结构域磷酸 化由CK2催化，且其磷酸化位点位于金属蛋白酶的靶位点(38)。尽管已知 NGR也通过金属蛋白酶而脱落(39，40)，并且它们可被CK2磷酸化(图1-4)， 但其磷酸化位点不包括在脱落位点中。NGR1中的脱落位点是氨基酸358 (39)，磷酸化位点是281(图3和4)。当通过蛋白质印迹分析RA处理的 SH-SY5Y细胞时，本发明人未能检测出消化的NgR1片段(图1)。NgR1的 胞外结构域磷酸化显现出不能调节其脱落。相反，本发明人指出NgR的胞外 结构域磷酸化阻断了神经突生长的髓鞘质相关抑制剂Nogo、MAG以及 OMgp的结合(图3和4)。

尽管BDNF可诱导NgR1的磷酸化，并克服RA处理的SH-SY5Y细胞 中的Nogo信号传导(图1)，但它不能缓解Nogo信号传导对于大鼠原代神 经元的神经突生长的作用(图5)。另外，尽管已报道内源性胞外CK2活性 与神经细胞相关(34)，但单独使用ATP孵育神经细胞不能抑制Nogo信号传 导(图2)。因此，内源性胞外CK2活性显现不足以抑制Nogo信号传导。这 些结果表明NgR磷酸化不能在中枢神经系统中天然发生，这与Nogo信号传 导可抑制中枢神经系统中的神经突生长的事实是一致的(3，4)。

本发明人指出，使用外源性CK2代替BDNF进行的细胞外处理拯救了 神经元免于由Nogo信号传导导致的神经突生长抑制(图5)。使用外源性CK2 的细胞外处理使NgR1中的丝氨酸²⁸¹磷酸化，这可抑制Nogo、MAG以及 OMgp与NgR1结合(图3)。NgR1中的CK2磷酸化位点丝氨酸²⁸¹在NgR2 中是保守的，且NgR2的磷酸化抑制了MAG的结合(图4)。尽管认为通过 NgR的信号传导是Nogo信号传导的主要途径，但最近的一篇论文指出来自 NgR1^-/-小鼠的神经元仍旧对由Nogo信号传导导致的神经突生长抑制敏感 (8)。这表明Nogo信号传导不仅可通过NgR而且通过未知的Nogo受体来 抑制神经元的神经突生长。尽管NgR1的耗竭不能拯救神经元免于Nogo-66 片段的抑制性作用(8)，但使用CK2的细胞外处理可以拯救神经元免于 Nogo-66片段的抑制性作用(图5)。因此，显示出CK2处理必然阻断了由髓 鞘质相关抑制剂Nogo-66、MAG以及OMgp导致的神经突生长抑制的NgR 依赖性途径和任何未知的非依赖性途径。由于CK2的靶位点丝氨酸²⁸¹也是 PKA的靶位点(图4)，使用PKA和CK2的细胞外处理可用于阻断Nogo信 号传导。

总之，本发明人发现，BDNF通过CK2样活性诱导RA处理的SH-SY5Y 细胞中NgR1的磷酸化，这通过Nogo信号传导克服了神经突生长的抑制。 然而，在大鼠神经元中不发生BDNF对于Nogo信号传导的这种抑制。代替 BDNF，使用外源性CK2的细胞外处理拯救神经元免于由Nogo信号传导而 导致的神经突生长抑制。CK2磷酸化NgR1和NgR2的胞外结构域，这阻断 了MAG与NgR2结合，和Nogo、MAG以及OMgp与NgR1结合。这些结 果表明Nogo受体的磷酸化可阻抑Nogo信号传导。因此，证明了Nogo受体 的磷酸化是用于操控Nogo信号传导的新靶。

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上述说明书中提到的所有出版物在此通过引用并入本文。在不偏离本发 明范围的情况下，本发明所述方面和实施方式的多种改变和变化对于本领域 技术人员来说是显而易见的。尽管已经结合特定优选实施方式描述了本发明， 但应理解，所要求保护的本发明不应不适当地限于这些特定实施方式。事实 上，对于本领域技术人员来说显而易见的用于实施本发明的所述方式的多种 改变意于落在下文权利要求书的范围之内。