一种有机溶剂沉淀分离初步提纯谷胱甘肽发酵液的方法

摘要

本发明公开了一种有机溶剂沉淀分离初步提纯谷胱甘肽发酵液的方法。该方法以经离心、热水抽提和纳滤膜浓缩的发酵抽提液为原料，调节其pH值至2～4；然后在所得发酵抽提液中加入有机溶剂，操作温度为5-10℃，搅拌下，促使溶液中杂质沉淀；有机溶剂选用甲醇或乙醇。有机溶液与发酵抽提液的体积比为3∶1-6∶1；将得到的混合物常压过滤，去除沉淀，得到初步纯化的谷胱甘肽澄清液。本发明利用有机溶剂可以使蛋白质核酸等大分子物质变性沉淀从而可以将其除去的方法初步纯化谷胱甘肽抽提液，可以使谷胱甘肽的纯度从15％左右提高到40％以上，有利于谷胱甘肽的后续分离和纯化。

说明书

技术领域

本发明涉及谷胱甘肽发酵液分离纯化，特别是涉及一种有机溶剂沉淀分离初步提纯谷胱甘肽发酵液的方法，属于分离纯化技术领域。

背景技术

谷胱甘肽(Glutathione，GSH)，即γ-L-谷氨酸-L-半胱氨酰甘氨酸，是生物体内一种具有重要生理功能的活性三肽。它主要以还原态(GSH)和氧化态(GSSH)两种形态存在，其中在机体中大量存在并起主要作用的是还原型谷胱甘肽。谷胱甘肽普遍存在于动植物细胞和微生物中，是一种重要的抗氧化剂，对维持红细胞膜的完整有着重要作用，参与体内DNA与蛋白质等大分子的生物合成过程，具有促进细胞的正常生长，增强细胞免疫等多种生理功能，临床主要用于中毒性和感染性肝炎的治疗、有机物及重金属的解毒、癌症辐射和化疗的保护等。除此之外，它在保健产业、食品、饲料等领域也有着极其广泛的应用。随着人们对保健养生的逐渐重视，GSH的需求量逐年上升。

谷胱甘肽的生产方法主要有溶剂萃取法、化学合成法、酶法和发酵法。其中发酵法是最具潜力的方法，已经成为国内外生产GSH最普遍的方法。而谷胱甘肽的分离纯化是发酵法生产工艺中最重要的部分之一。目前报道GSH的分离纯化方法主要有铜盐法、亲和层析法、双水相萃取法、离子交换法等。铜盐法是纯化GSH的传统方法，该法选择性高，易于操作，具有实用价值，但由于在生产过程中需大量使用H₂S，对环境污染严重。亲和层析法分离多肽类物质效果较好，但此法可能存在汞的泄露，而且含汞树脂对酸碱比较敏感，稳定性比较差，所以在工业尤其是食品工业上此法的应用受到很大的限制。双水相萃取法是两种水溶性不同的聚合物或者一种聚合物和无机盐的混合溶液，在一定的浓度下，体系就会自然分成互不相容的两相。该法具有操作条件温和、处理量大、易于连续操作等优点，已被广泛的应用于多种生物活性物质的分离提取中。应用该法进行分离GSH，效率较高，但由于双水相组成系统一般比较昂贵，影响了其大规模工业的应用。利用离子交换树脂进行吸附分离的方法是生化分离的一个重要手段。用阴阳离子树脂吸附解析的方法可以使氨基酸和多肽化合物等两性物质与其他物质快速有效的分离。GSH是典型的两性物质，利用该法提纯GSH具有经济效益好，操作便利等优点。国际上日本等国家已经对此进行了研究，并取得了较好的研究成果。国内关于离子交换树脂分离谷胱甘肽的研究也已经逐步展开。

到目前为止，国内用发酵法生产谷胱甘肽的瓶颈主要在于发酵水平低下，后续提纯工艺收率低，产品纯度低、质量差、成本高，远远不能满足需求。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术存在的缺点，提供一种使谷胱甘肽抽提液中GSH纯度从15％左右提高到40％以上的初步提纯谷胱甘肽发酵液的有机溶剂分离方法。

本发明用有机溶剂沉淀法处理谷胱甘肽发酵液，可破坏谷胱甘肽发酵液中的蛋白质、核酸等大分子物质的空间结构，使一些原来包在内部的疏水基团暴露于表面并与有机溶剂的疏水基团结合形成疏水层，从而使这些大分子物质沉淀下来，达到初步纯化谷胱甘肽发酵液的目的。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种有机溶剂沉淀分离初步提纯谷胱甘肽发酵液的方法，包括如下步骤：

(1)调节发酵液pH值：以经离心、热水抽提和纳滤膜浓缩的发酵抽提液为原料，调节其pH值至2～4；

(2)有机溶剂沉淀除杂：在步骤(1)所得发酵抽提液中加入有机溶剂，操作温度为5-10℃，搅拌下，促使溶液中杂质沉淀；有机溶剂选用甲醇或乙醇。有机溶液与发酵抽提液的体积比为2∶1-6∶1；

(3)过滤：将经步骤(2)得到的混合物常压过滤，去除沉淀，得到初步纯化的谷胱甘肽澄清液，以质量百分比计，纯度在40％以上。

进一步地，所述经离心、热水抽提和纳滤膜浓缩的发酵抽提液的谷胱甘肽浓度优选为5g/L～10g/L。

以质量百分比计，所述所述经离心、热水抽提和纳滤膜浓缩的发酵抽提液的谷胱甘肽纯度为20％以下。

所述的有机溶剂优先选用甲醇。

所述有机溶液与发酵抽提液的体积比优选为4∶1～5∶1。

步骤(3)所选用的过滤膜孔径优选为1～10μm。

相对于现有技术，本发明初步纯化谷胱甘肽的方法具有以下有益效果：

(1)本发明中使体系处于2～4的酸性环境，不仅有利于GSH的稳定，而且可以使部分大分子蛋白质变性，能除去部分杂质。

(2)本发明利用有机溶剂可以使蛋白质核酸等大分子物质变性沉淀从而可以将其除去的方法初步纯化谷胱甘肽抽提液，可以使谷胱甘肽的纯度从15％左右提高到45％左右，有利于谷胱甘肽的后续分离和纯化。

具体实施方式

为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步介绍，但需要说明的是，本发明所要求的保护的范围并不局限于实施例所表述的范围。

实施例1

取1L经离心、热水抽提和纳滤膜浓缩的GSH发酵抽提液，其中GSH浓度为5.3g/L，以质量百分比计，GSH发酵抽提液中谷胱甘肽纯度为18％。用盐酸调节发酵抽提液的pH值至2，然后在该抽提液中加入6L乙醇，5℃条件下搅拌，转速300rpm，使杂质沉淀析出，得混合液。选用孔径为5μm的定性分析滤膜做过滤介质，对上述混合液进行常压过滤，称重，计算得到去除杂质10.4g，收集GSH上清液。采用高效液相色谱法对谷胱甘肽原液及上述上清液进行分析，有机溶剂沉淀后得到的GSH上清液中谷胱甘肽纯度为45.6％。

实施例2

取1L经离心、热水抽提和纳滤膜浓缩的GSH发酵抽提液，其中GSH浓度为5.0g/L，以质量百分比计，GSH发酵抽提液中谷胱甘肽纯度为16.5％。用盐酸调节发酵抽提液的pH值至4，然后在该抽提液中加入2L甲醇，10℃条件下搅拌，转速300rpm，使杂质沉淀析出，得混合液。选用孔径为10μm的定性分析滤膜做过滤介质，对上述混合液进行常压过滤，称重，计算得到去除杂质6.8g，收集GSH上清液。采用高效液相色谱法对谷胱甘肽原液及上述上清液进行分析，有机溶剂沉淀后得到的GSH上清液中谷胱甘肽纯度为41.2％。

实施例3

取1L经离心、热水抽提和纳滤膜浓缩的GSH发酵抽提液，其中GSH浓度为10.0g/L，以质量百分比计，GSH发酵抽提液中谷胱甘肽纯度为16％。用盐酸调节发酵抽提液的pH值至3.4，然后在该抽提液中加入4L甲醇，8℃条件下搅拌，转速300rpm，使杂质沉淀析出，得混合液。选用孔径为1μm的定性分析滤膜做过滤介质，对上述混合液进行常压过滤，称重，计算得到去除杂质23.7g，收集GSH上清液。采用高效液相色谱法对谷胱甘肽原液及上述上清液进行分析，有机溶剂沉淀后得到的GSH上清液中谷胱甘肽纯度为46.5％。