包括接骨木萃取液和副干酪乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌或嗜热链球菌的菌株的结合物的组合物

摘要

本发明涉及用于刺激免疫力和/或促进抗感染和/或抗炎反应的包括接骨木萃取液和副干酪乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌或嗜热链球菌的菌株的结合物的组合物。

说明书

本发明涉及优选用于刺激免疫力和/或促进抗感染和/或抗炎反应的包括接骨木萃取液(elder extract)和至少一种副干酪乳杆菌(L.paracasei)、干酪乳杆菌(L.casei)、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)或嗜热链球菌(S.thermophilus)的菌株的结合物的组合物。

接骨木或者西洋接骨木(Sambucus nigra L.)是五福花科系的成员。

接骨木属Sambucus包括分布于世界各地温带的25个物种。黑接骨木，接骨木黑亚种(S.nigra ssp.nigra)，广泛生长在欧洲(丹麦、意大利和奥地利)、北非和西亚。加拿大接骨木，接骨木加拿大亚种(S.nigra ssp.canadensis)，虽然其选取(selection)在加拿大进行，但源自北美的东北，生长在俄勒冈州、宾斯法尼亚州和堪萨斯州。

以下各种接骨木部分(organ)：木栓层、根、茎、花、叶和果实通常用于各领域，包括医药、食品工业和工具与玩具制造业。目前涉及接骨木浆果萃取液生产的主要工业产品涉及营养食品市场和染色剂工业。

一些出版物报道了接骨木浆果萃取液在细胞因子生成中的作用(The effect of Sambucol，a black elderberry-based，natural product，on the product10n of animal cytokines：I.Inflammatory cytokinesEur.Cytokine Netw.2001四月-六月；12(2)：290-296)。尤其是接骨木浆果萃取液在减轻与由流感病毒(A和/或B和/或C)引起的流感感染的症状中的作用已有所公开，同样公开的还有其对1型单纯性疱疹病毒、呼吸道合胞体病毒和副流感病毒的抗病毒作用。(Randomized Study of the Efficacy and Safety of Oral Elderberry Extract in the treatment of Influenz

很多科学研究表明了某些包含于发酵食品，特别是乳产品的某些微生物对健康的有益作用。一般把这些微生物称为益生菌(probiotics)。按照目前广泛接受的定义，益生菌是：《适量食用时对宿主健康具有有益作用的活的微生物》(见FAO/WHO针对Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria；Cordoba，Argentina；2001年10月1-4日的报告)。

在专利申请WO96/20607，EP0794707，EP1283714和FR2912657中显示了对包括益生菌细菌的食品产品的食用可以产生令人满意的健康作用，特别是通过平衡肠菌，改善对感染的抵抗力，和调节免疫反应。

用于人类食物的益生菌微生物通常是乳酸菌，主要属于乳杆菌和双歧杆菌的菌株，尤其是副干酪乳杆菌种。

专利申请US 2006/0233895公开了包括能够任选与如干酪乳杆菌的益生菌结合的接骨木萃取液的组合物。但是，这种组合物必须包括绒毛钩藤(Uncaria Tomentosa)、齿叶蚁木(Pau d′Arco)、黄芩(scrutellaria baicalensis)和蒿素(artemisin)的混合物。另外，此组合物并非意为刺激免疫力而用于治疗由细菌感染引起的莱姆病，与流感类病毒感染非常不同。

本发明的发明人调查了包括接骨木萃取液和至少一种副干酪乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌或嗜热链球菌的菌株的结合物通过周边血液单核细胞(PBMC)对非特异性免疫调节者(细胞因子)的生成的体外作用。这类体外模型的结果与能够从体内获得的作用高度相关(World J.Gastroenterol.2007；13(2)：236-243)。

PBMC细胞模型用于调查人类免疫系统细胞的反应能力。此反应通过IL-10，IFN加马和IL-6细胞因子的生成得以显示。

在炎症应力上，IL-10通过巨噬细胞生成以调节如TNF-α的前炎症细胞因子的生成。这促进抗原表现(display)的减少，降低T细胞增殖，但在IL-2、-4和-7的存在能够作为细胞毒性T细胞的分化因子。IL-10增加抗体生成B细胞的存活。

IFN-γ或II型IFN具有一些抗病毒活性并且抑制细胞增殖。但是，IFN-γ本质上是免疫调节的，相反于主要具有抗病毒活性的I型IFN(α和β-IFN)。IFN-γ激活巨噬细胞和NK细胞：因此它影响细胞毒性机制。其调节了T细胞的增殖和分化且已知促进1型免疫反应和，相反地抑制2型。

IL-6是影响抗原特异性免疫反应和抗炎反应的多效性细胞因子。它是急性期反应的主要生理介质(mediators)之一。IL-6是B细胞分化因子和T细胞活化因子。在IL-2的存在下，IL-6诱导成熟和未成熟的T细胞分化成为细胞毒性T细胞。IL-6和IL-3体外协同以促进多能造血祖细胞的增殖。IL-6也是诱导体外巨核细胞的成熟和增加体内血小板计数的促血小板生成素。

两种成分(接骨木萃取液和副干酪乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌或嗜热链球菌的菌株)都是作用于人类免疫系统细胞以加强免疫反应，以使机体为任何感染侵略或任何病态炎症过程做出更好的准备。所获得的结果十分令人惊讶且未预料地显示了，这些成分，当在相同组合物中时，协同作用于非特异性免疫反应。

因此，本发明涉及包括接骨木萃取液和至少一种副干酪乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌或嗜热链球菌的菌株的结合物的组合物。优选地，所述组合物不包含绒毛钩藤和/或齿叶蚁木和/或黄芩和/或蒿素，尤其如US 2006/0233895中描述的那些。特别是，它不包括绒毛钩藤、齿叶蚁木、黄芩和蒿素的混合物。

在一个特定的具体实施方式中，本发明的组合物涉及包括接骨木萃取液和至少一种副干酪乳杆菌的菌株的结合物的组合物。

在一个特定的具体实施方式中，本发明的组合物可以通过包括如下步骤的方法制备：

a)制备接骨木萃取液和至少一种副干酪乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌或嗜热链球菌的菌株的结合物；

b)将该结合物加入本发明的组合物。

因此，此情况下，结合物在其加入该组合物之前制备。但是，通过向该组合物中分别加入该结合物的每一个成分来制备本发明的组合物，即不提前制备结合物，也是可能的。

在一个特定的具体实施方式中，本发明的组合物涉及包括接骨木萃取液和至少一种副干酪乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌和/或嗜热链球菌的菌株的结合物的组合物。

优选地，本发明的组合物适于口服。

优选地，本发明的组合物是食品、膳食补充剂、药品或OTC(非处方药)产品。

本发明的接骨木萃取液优选获自接骨木浆果和/或花，优选获自接骨木浆果。有利地，本发明的接骨木萃取液是水溶性萃取液。

用于本发明的接骨木萃取液可以一方面通过花色素，另一方面通过如蛋白质(尤其是凝集素)的大分子的内容物进行表征。

优选地，接骨木萃取液包括花色素，更优选属于花葵素和花青素系，含量为约0.5重量％至约25重量％，更优选在约3％至约25％之间的，最优选在约8％至约16％之间的，以萃取液的固含量计。优选地，花色素内容物为约12重量％，以萃取液的固含量计。这些内容物按照在J.Agric.Food Chem.2004，52，7846-7856中描述的HPLC法，表达为花青素-3-葡萄糖苷。

优选地，接骨木萃取液包含蛋白质，含量在重量的2和10％之间的，优选在重量的5％和10％之间的，更优选在重量的5％和7％之间的，以固含量计(N x 6.25按照Kjeldahl方法：Proteines vegetales，Ed.B.Godon，Collection Sciences et Techniques Agro-alimentaires，Technique et Documentation Lavoisier，Paris，1985)。

在本发明中，接骨木是市售的或可以通过包括如下步骤的过程获得：

挤压新鲜或冷冻的接骨木浆果以在过滤后获得果汁。进行酶法水解步骤(果胶酶或果胶甲酯酶和聚半乳糖醛酸酶的混合物)以在过滤前使其澄清(Girard B.和Fukumoto L.R.Membrane processing of fruit juices and beverages：a review.Critical Reviews in Food Science and Nutrition，2000，40(2)：91-157)。干燥且磨碎的浆果可以进行水萃取，接着通过过滤进行固/液分离。

所得萃取液可如此使用或浓缩、或干燥成粉末。

在这个阶段，花色素内容物为在0.5重量％和3重量％之间，以萃取液的固含量记，且优选等于约1％(HPLC分析，表达为花青素-3-葡萄糖苷)。

可以特别用花色素和/或大分子量分子(蛋白质、多元酚、多糖)补充接骨木萃取液。

为此目的，对本领域技术人员来说有几种方法是合理并已知的：

-超滤：对预先稀释的果汁进行透滤步骤，随后以1至20kDa，优选3至10kDa的临界值在有机或无机膜上超浓缩(Girard B.和Fukumoto L.R.Membrane processing of fruit juices and beverages：a review.Critical Reviews in Food Science and Nutrition，2000，40(2)：91-157)。

-通上Amberlite型吸收剂高分子树脂XAD柱。

-水醇萃取(任意比例的水和C1到C4醇的混合物)或酸性pH水溶液。(Bronnum-Hansen K.和Flink J.M.Anthocyanin colorants from elderberry(Sambucus nigra L.)IV.Further studies on production of liquid extracts，concentrates and freeze dried powders.Int.J.Food Sci Tech 1986，21(2)：605-614；Lee J.和Wrolstad R.E.Extract10n of Anthocyanins and polyphenolics from blueberry processing waste.J.Food Sci.2004，69(7)：564-573)。优选在干燥且磨碎的浆果上或在来自新鲜浆果的果泥上直接进行萃取。

热浓缩所得萃取液(在温度不高于50℃和真空下)以提高Brix程度和就微生物污染而言将其稳定。也能够将其单独干燥或在载体上干燥(例如麦芽糖糊精、乳糖…)。

所得的补充果汁优选为40至60°Brix，3至25重量％的花色素和5至10重量％的蛋白质(Kjeldahl方法，N x 6.25)，以固含量计。

优选地，本发明的组合物中每单位剂量的接骨木固体的量为约100mg至约1g。更优选地，该组合物包含每单位剂量约150mg至约500mg的接骨木固体，更优选，每单位剂量约150mg至约300mg的接骨木固体，最优选，每单位剂量约200mg至约250mg的接骨木固体。

在本发明中，术语《单位剂量》指的是在一个单独剂量中本发明组合物所使用的量。优选地，本发明的单位剂量优选可以对应于，例如，100或125ml酸乳酪，1g胶囊或2g片剂。因此，无论组合物的重量是多少，每单位剂量的接骨木固体和/或副干酪乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌或嗜热链球菌的菌株的量保持不变。优选地，给药方案(dosing regimen)为每天两单位剂量。

本发明的一种最合适的副干酪乳杆菌是1994年12月30日储存于CNCM(Collection Nationale de Cultures of Microorganisms，28 rue du Docteur Roux，Paris)的副干酪乳杆菌，参考号I-1518。以参考号DN-114001或L.casei defensis(商标)为公知的此菌株是专利EP 0 794 707的主题。此菌株在加强系统免疫反应，特别是呼吸道的病原微生物(包括流感病毒)的作用已描述于EP 1 283 714专利中，且在接种疫苗后加强抗流感的作用已描述于FR 2 912 657。

干酪乳杆菌和副干酪乳杆菌的命名法目前已是需修正的主题且仍然在争论中。文献中涉及的干酪乳杆菌和副干酪乳杆菌副干酪亚种的大多数菌株目前是可命名为副干酪乳杆菌副干酪亚种的同物种的成员以满足目前的命名法。

这些细菌菌株可用于与其他乳酸菌结合，或者与酸乳发酵，即保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌结合。

因此，当副干酪乳酸杆菌用于与酸乳发酵结合时，所述组合物还可以包括每ml至少10⁷和优选5x10⁷至2x10⁸的嗜热链球菌细胞，和每ml至少5x10⁴，优选10⁵至5x10⁵的保加利亚乳杆菌细胞。

本发明的一种最适合的保加利亚乳杆菌菌株是储藏于CNCM，参考号I-2787的保加利亚乳杆菌菌株。

本发明的一种最适合的嗜热链球菌菌株是储藏于CNCM，参考号I-2130的嗜热链球菌菌株。

源自这些菌株的细菌可以整个，存活或没存活的细菌的形式使用，还可以以细菌溶菌产物的剂型，或细菌级分(bacterial fractions)的剂型使用。

这些细菌也可用如专利申请WO 2005/070221中描述的植物脂肪包覆，以改善其存活。

优选地，组合物包含每单位剂量1x10⁷至1x10¹¹CFU的副干酪乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌或嗜热链球菌。

有利地，副干酪乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌或嗜热链球菌的菌株的日剂量是10⁸至10¹⁰CFU。

优选地，日常给药方案为每天两单位剂量。

在本发明的一个特定的具体实施方式中，组合物包含，每单位剂量，

-100mg至1g，优选150mg至500mg，有利地150mg至300mg，且更优选200mg至250mg的接骨木固体；和

-1x10⁷至1x10¹¹的副干酪乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌或嗜热链球菌。

在本发明的一个特定的具体实施方式中，组合物包含，每单位计量，

-3mg至200mg，优选10至100mg，更优选20mg至50mg的接骨木花色素，

-2mg至100mg，优选10mg至20mg的接骨木蛋白质；和

-1x10⁷至1x10¹¹的副干酪乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌或嗜热链球菌。

因此有利地显示出协同作用。

本发明的接骨木萃取液和副干酪乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌或嗜热链球菌的菌株的结合物显示出良好的诱导/刺激非特异性免疫反应的能力，因此显示出其在食品和/或药品领域的优点。

本发明的组合物可以优选以通常用于食品和/或药品领域以口服或舌下使用的任何草本制剂的剂型获得。

在食品情况中，特别地，这可以是鲜乳产品、发酵乳产品、酸乳、发酵乳、婴儿乳、散剂、锭剂、蔬菜汁、饮料及其混合物，优选选自鲜乳产品、水果和/或蔬菜汁，或水果果泥。

有利地，水果选自苹果、橙子、红莓、草莓、桃、杏、李子、覆盆子、黑莓、红浆果、柠檬、葡萄柚、香蕉、菠萝、猕猴桃、梨、樱桃、椰子、百香果、芒果、无花果、大黄、瓜、异国水果、荔枝、葡萄、蓝莓或其混合物。

优选地，本发明的食品是新鲜的乳产品。有利地，它是发酵乳产品。最有利地，它是以新鲜水果为基础的乳产品。

优选地，就以新鲜水果为基础的乳产品而论，借助水果配制将接骨木萃取液加入最终产品中。副干酪乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌或嗜热链球菌的菌株作为发酵剂轮流混入乳基。

“发酵乳产品”应更特别地理解为备于人类食用的发酵乳产品，也就是发酵乳类食品。在本发明中，更特别提供发酵乳和酸乳。所述发酵乳类食品或称为“软干酪”(fromage-blanc)或“鲜奶酪”(petit-suisse)。

在此使用，术语“发酵乳类食品”和“酸乳”具有他们在乳品工业的通常含义，即为人类食用的且得自乳品底物的酸化乳发酵产品。这些产品包含次要成分，例如水果、植物、糖等。例如参考法国订购号88-1203，1988年12月30日，涉及发酵乳和酸乳或酸乳酪，公开于Journal Officiel de la Republique Francaise on December 31，1988。还参考“食品法典委员会(Codex Alimentarius)”(在FAO和WHO的赞助下，通过Commission of the Codex Alimentarius准备的，且通过Information Divisionn of the FAO公开，网上获自http://www.codexalimentarius.net；更特别地Codex Alimentarius的卷12“Codex Standards for milk and dairy products”和标准“CODEX STAN A-1 1(a)-1975”)。

因此，本发明中的术语“发酵乳品”是仅用于指定进行至少等同于巴氏法灭菌的过程且通过属于每一产品的物种特征的微生物接种的用乳品底物制备的乳产品。“发酵乳品”无需经历任何减少所用乳品底物的构成元素的过程，特别是无需经历凝结物的排水过程。“发酵乳品”的凝结不应通过除了那些由所用微生物的活性产生以外的其他方法获得。实际上，术语“发酵乳品”通常用于标明除了酸乳的发酵乳品，且可以涉及，按照国家，如“Kefir”、“Kumiss”、“Lassi”、“Dahi”、“Leben”、“Filmj·lk”、“Villi”、“Acidophilus milk”。

对于术语“酸乳”，其用于指定传统并一贯地通过针对所述副干酪乳杆菌和嗜热链球菌的嗜热乳酸菌的发展获得的发酵乳品，该细菌应在最终产品中存活，含量在至少1千万细菌每克，以乳品份计。在一些国家，相关规定认可在酸乳的生产中其他乳酸菌的加入，且特别地双歧杆菌和/或嗜酸乳杆菌菌株的额外加入。这些额外的乳酸杆菌的目的在于给予最终产品各种性质，如促进肠菌平衡的性质或控制免疫系统。

包含在发酵乳品底物的游离乳酸的量当卖与消费者时不应低于0.6g每100g，且提供给乳品份的蛋白质物质内容物不应低于合乎规范的乳品。

本申请中的名称“软干酪(fromage blanc)”或“鲜奶酪”(petit-suisse)用于唯一标明仅用乳酸菌发酵(无乳酸发酵以外的发酵)的不成熟的、不含盐的奶酪。当完全干燥时，按照不论其脂肪含量是25％，每100g软干酪高于20g或最多等于20g，在软干酪中的固含量可以降到每100g软干酪15g或10g。软干酪的固含量为13至20％。对于鲜奶酪的固含量，每100g鲜奶酪不低于23g。通常为25至30％。软干酪和鲜奶酪通常普遍指传统用于本发明技术领域的《白软干酪(cottage cheese)》。

优选地，鲜乳产品选自酸乳包括搅拌型酸乳(stirred yoghurt)、饮用型酸乳、白软干酪和发酵乳品。

在本发明中，《膳食补充品》指意为补足普通营养且是营养物或其他单独或结合具有营养或生理作用的物质的集中来源的食品产品。

优选地，膳食补充品包括维生素和/或矿物质和/或微量元素。

这些维生素特别包括维生素A、E、C和B族维生素，特别是维生素B6。有利地，这些是维生素C、E和B6。

维生素A(视黄醛或类胡萝卜素)、维生素E和微生物C是3种主要的抗氧化维生素。实际上，这些抗氧化维生素具有控制由氧新陈代谢造成的游离基的产生的能力，其过度产生会致使多种状况，尤其是心血管、免疫力、癌症、皮肤、加速老化、神经变性的疾病等。

特别地，维生素C是公知的水溶性抗氧化剂。人类依靠外源维生素C以满足其对维生素C的需求。因此，抗坏血酸、抗坏血酸钠或其混合物是维生素C的来源。

维生素E也是公知的抗氧化剂。维生素E可以与维生素C协同作用以保护抵抗正常氧化剂的重要细胞功能。α-醋酸生育酚、三甲基-醋酸生育酚和/或维生素E琥珀酸酯是维生素E的来源。

维生素B形成一族水溶性维生素，包括维生素B1或硫胺，维生素B2或核黄素，维生素B3(PP)或烟酰胺，维生素B5或泛酸，维生素B6或吡哆醇，维生素B8(H)或生物素，维生素B9或叶酸，维生素B12或氰钴胺素。

优选地，矿物质选自铁、锌、硒、铬、铜及其混合物。

锌具有如那些直接参与抵抗氧化剂的防御反应的酶的辅因子的抗氧化作用。氧化锌，葡萄糖酸锌、柠檬酸锌、醋酸锌、氯化锌、乳酸锌或硫酸锌可以在本发明的组合物中单独使用或以混合物使用。优选葡萄糖酸锌。

硒也具有如那些直接参与抵抗氧化剂的防御反应的酶的辅因子(如谷胱甘肽过氧化物酶)的抗氧化作用。

在膳食补充品或药品的情况中，可以使用如下的草本剂型：可吞咽片剂、可咀嚼片剂、泡腾片、胶囊、锭剂、丸剂、散剂、颗粒、口服液或悬液和舌下给药剂型或颊剂型。优选草本剂型是片剂或胶囊。

当以片剂剂型制备固态组合物时，主要的活性成分可与如明胶、淀粉、乳糖、硬脂酸镁、滑石、阿拉伯树胶等药物载体混合。片剂可以用蔗糖或其他适合的材料包覆，或可以对其加工以具有延缓或延迟的作用和连续释放预定量活性组分。

通过用稀释剂混合活性成分和通过将所得混合物填充至软或硬胶囊进行胶囊的制备。

糖浆或酏剂形式的制备包括与甜味剂、防腐剂、调味剂和适合的色素一起的活性成分。

水分散性粉末或颗粒包含作为与分散剂或润湿剂，或悬浮剂，和味觉矫正剂或甜味剂一起的混合物的活性成分。

本发明的另一个目标是本发明的组合物，用作药品。

本发明的另一个目标是本发明的组合物，用以刺激免疫力和/或增强免疫防御，和/或促进抗感染和/或抗炎反应。

本发明的另一个目标是组合物，用于治疗和/或预防呼吸道和/或肠感染。

本发明的另一个目标是组合物，用于治疗和/或预防尤其是由1型单一疱疹病毒、呼吸道合胞病毒和流感(A和/或B和/或C)和副流感病毒引起的症状，优选特别是由流感(A和/或B和/或C)病毒导致的流感状况的症状。

本发明的组合物特别适合于治疗和/或预防由流感病毒(正粘病毒，流感A、B或C)感染引起的流感状况的症状。这些症状包括发冷、鼻炎、咳嗽、鼻粘膜炎症(鼻液溢、鼻阻塞、打喷嚏)、咽喉痛(各种表现：刺痛、吞咽困难)、发烧、头疼、肌肉酸痛、疲劳。

这些《冬天的烦恼》与我们免疫防御的减弱相关。

本发明的另一个目标是组合物在制备食品、膳食补充品或药品中的用途。

本发明的另一个目标是组合物在制备用于治疗和/或预防呼吸道和/或肠感染的药品中的用途。

本发明的另一个目标是组合物在制备用于治疗和/或预防由1型单一疱疹病毒、呼吸道合胞病毒和流感(A和/或B和/或C)和副流感病毒引起的症状，优选特别由流感(A和/或B和/或C)病毒导致的流感状况的症状的药品中的用途。

本发明的另一个目标是组合物在制备用于刺激免疫力和/或促进抗传染和/或抗炎反应的药品中的用途。

还有，本发明的另一个目标是提供增强免疫防御的方法，其包括口服使用基于接骨木萃取液和至少一种副干酪乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌或嗜热链球菌的菌株的结合物的组合物。

附图描述如下：

图1显示了通过单独的或与以4.5∶1的比例的副干酪乳杆菌∶PBMC结合的接骨木萃取液诱导的IL-10的产生。

图1的说明

图2显示了通过单独的副干酪乳杆菌或与10μg/ml接骨木萃取液结合的副干酪乳杆菌诱导的IFN-γ的产生。

图2的说明

图3显示了通过单独的副干酪乳杆菌或与10μg/ml接骨木萃取液结合的副干酪乳杆菌诱导的IL-6的产生。

图3的说明

图4显示了通过单独的干酪乳杆菌或与10μg/ml接骨木萃取液结合的副干酪乳杆菌诱导的IL-6的产生。

图4的说明

图5显示了通过单独的保加利亚乳杆菌或与10μg/ml接骨木萃取液结合的保加利亚乳杆菌诱导的IL-6的产生。

图5的说明

图6显示了通过单独的嗜热链球菌或与10μg/ml接骨木萃取液结合的嗜热链球菌诱导的IL-6的产生。

图6的说明

图7显示了通过单独的短乳杆菌或与10μg/ml接骨木萃取液结合的短乳杆菌诱导的IL-6的产生。

图7的说明

图8表现了给予载体(绿色)、完整制剂(1500mg/kg；红色)、副干酪乳杆菌DN-114001+乳制品混合物(393mg/kg；蓝色)、接骨木浆果萃取液(296mg/kg；紫色)或维生素+矿物质(282mg/kg；灰色)的小鼠的NK细胞毒性活性。P值：完整制剂相对于载体。

图8的说明

通过参考以下为本发明的组合物的特定实施方式的非限定实施例更好理解本发明。

实施例1：用于本发明的接骨木萃取液的制备

接骨木萃取液从富集花色素的接骨木浆果果汁中获得并在麦芽糖糊精上干燥。通过采用按照如下方法的膜过滤方法进行富集：用284升水稀释26升澄清的接骨木果汁(每1体积果汁11体积水)。所得310升进行搅拌并加热到45℃后，然后在第一个5kDa的膜通过加入每体积果汁7体积水(例如181L)进行二重过滤(diafiltrated)。渗析透过液随后通过在一个5kDa的膜(具有单元表面积5.8m²的5/10kDa试验膜(pilot membrane))上超滤浓缩。在真空且温度不高于50℃下，热浓缩超滤截留物，后在麦芽糖糊精载体上粉化，以使得麦芽糖糊精的量低于或等于30％(w/w)。

所得萃取液的特征在于：

-花色素含量：10-14重量％，以萃取液的固含量计(按照在JAgric Food Chem 2004，52，7846-7856描述的HPLC方法表达为花青素-3-葡萄糖苷)。

-蛋白质含量：5-7重量％，以萃取液的固含量计(按照Kjeldahl 方法N x 6.25)

实施例2：副干酪乳杆菌菌株CNCM I-1518与接骨木萃取液在周边血液单核细胞(PBMC)中的结合免疫调节剂作用的体外研究。

原料和方法

从健康者中分离周边血液单核细胞(PBMC)并以0.5x10⁶细胞/孔进入且分布在24孔培养板中。这些PBMC以接骨木萃取液的不同浓度(3-10-30-100μg/每毫升PBMC细胞培养上清液)在副干酪乳杆菌量(每1PBMC 4.5副干酪乳杆菌)存在或不存在下在37℃孵化过夜，或以不同的副干酪乳杆菌∶FBMC比例(0.5∶1-1∶1-2∶1-4.5∶1)在10μg/每毫升PBMC细胞培养液上清液的接骨木萃取液存在或不存在下在37℃孵化过夜。

所用接骨木萃取液按照实施例1制备。

回收培养液上清液以通过通量细胞仪确定细胞因子(IL-10和IFN-γ)。

在本发明中，结合的接骨木和副干酪乳杆菌不具有同样的度量单位，即分别地μg/ml的浓度和细菌数∶PBMC的比例。

为了确定接骨木萃取液+副干酪乳杆菌是否产生协同作用，本发明的发明人采用在Etievant C，Kruczynski A，Barret JM等的出版物中描述的方法，F 11782，a dual inhibitor of topoisomerases I and II with an original mechanism of act10n in vitro，and markedly superior in vivo antitumour activity，relative to three other dual topoisomerase inhibitors，intoplicin，aclarubicin and TAS-103 Cancer Chemother.Pharmacol.2000；46：101-113。

此出版物教导了试验结果与理论曲线绘图相比的对比和解释。

后者基于一个化合物的可变实验数据(例如增加的接骨木萃取液浓度)和第二个化合物的固定实验数据(例如细菌数量∶PBMC的固定比例)。

显示由一系列接骨木萃取液剂量结合副干酪乳杆菌∶PBMC的固定比例4.5∶1诱导的IL-10的产生的图1理论曲线是通过对单独的接骨木的曲线(●)的每个实验点加入4.5∶1比例的副干酪乳杆菌∶PBMC的份额(contribution)进行绘制的。这个份额，如实验确定的，是2.4pg/ml的IL-10。

图1的数据表。

显示由一系列副干酪乳杆菌剂量结合固定浓度10μg/ml的接骨木萃取液诱导的IFN-γ的产生的图2理论曲线是通过对单独的接骨木的曲线(●)的每个实验点加入10μg/ml接骨木萃取液的份额进行绘制的。这个份额，如实验确定的，是5pg/ml的IFN-γ。

图2的数据表。

结果：

图1和2给出所得结果：

-图1显示了由单独的接骨木萃取液或结合4.5∶1的比例的副干酪乳杆菌∶PBMC诱导的IL-10的产生

-图2表现了由单独的副干酪乳杆菌或结合10μg/m浓度的接骨木萃取液诱导的IFN-γ的产生。

研究单独的接骨木萃取液或结合特别的副干酪乳杆菌∶PBMC比例(4.5∶1)诱导的非特异性免疫反应的作用。

用4.5∶1的副干酪乳杆菌∶PBMC比例获得的细胞因子浓度是2.4pg/ml。

实验获得的结果与理论曲线值的对比显示了副干酪乳杆菌加强了单独接骨木萃取液的作用：结合物提供了远高于二者作用(一方面接骨木萃取液和另一方面副干酪乳杆菌)的总和的IL-10的产生。

本发明人还测定不同副干酪乳杆菌∶PBMC比例，单独或结合固定浓度(10μg/ml)的接骨木萃取液对γ-干扰素产生的作用。

用10μg/ml浓度的接骨木萃取液获得的细胞因子浓度是5pg/ml。

所获得的各种曲线的对比显示了接骨木萃取液加强了副干酪乳杆菌的作用：结合物提供了远高于二者作用(一方面副干酪乳杆菌和另一方面接骨木萃取液)的总和的IFN-γ的产生。

结论：

接骨木萃取液和副干酪乳杆菌CNCM I-1518(DN-114 001)协同作用于非特异性免疫反应，因此使人类免疫系统细胞对传染性侵略或者病态炎症过程的抵抗更具反应性。

实施例3：菌株特异性的体外研究

原料和方法

从健康者中分离周边血液单核细胞(PBMC)并以0.5x106细胞/孔进入且分布在24孔培养板中。这些PBMC用不同的菌株∶PBMC比例(0.5∶1-1∶1-2∶1-4.5∶1)在接骨木萃取液10μg/每毫升PBMC细胞培养液上清液的存在或不存在下在37℃孵化过夜。

所用的接骨木萃取液按照实施例1制备。

为了这个体外研究试验了五个菌株∶副干酪乳杆菌(CNCM I-1518)菌株，干酪乳杆菌菌株、保加利亚乳杆菌(CNCM I-2787)菌株，嗜热链球菌(CNCM I-2130)菌株和短乳杆菌的菌株。

回收培养液的上清液以通过ELISA确定细胞因子IL-6。

为了决定接骨木萃取液/菌株结合物是否产生协同作用，采用在Etievant C.等的出版物(见上)描述的方法。此出版物教导了试验结果与绘制理论曲线相比的对比和解释。

后者基于提高的细菌数量∶PBMC比例的变化实验数据和接骨木萃取液浓度的固定实验数据。

显示由一系列菌株剂量结合固定浓度10μg/ml的接骨木萃取液诱导的IL-6的产生的图3至7理论曲线是通过向单独的菌株的曲线(●)的每个实验点加入接骨木萃取液10μg/ml的份额进行绘制的。对每个实验通过实验性确定份额。

结果：

图3和7给出所得结果：

-图3表现了由单独的副干酪乳杆菌或结合10μg/ml的接骨木萃取液诱导的IL-6的产生(用10μg/ml接骨木萃取液获得的细胞因子浓度是7.7ng/ml)；

-图4表现了由单独的干酪乳杆菌或结合10μg/ml的接骨木萃取液诱导的IL-6的产生(用10μg/ml接骨木萃取液获得的细胞因子浓度是2.2ng/ml)；

-图5表现了由单独的保加利亚乳杆菌或结合10μg/ml的接骨木萃取液(用10μg/ml接骨木萃取液获得的细胞因子浓度是2.0ng/ml)诱导的IL-6的产生；

-图6表现了由单独的嗜热链球菌或者结合10μg/ml的接骨木萃取液诱导的IL-6的产生(用10μg/ml接骨木萃取液获得的细胞因子浓度是2.4ng/ml)；

-图7表现了由单独的短乳杆菌或结合10μg/ml的接骨木萃取液诱导的IL-6的产生(用10μg/ml接骨木萃取液获得的细胞因子浓度是6.0ng/ml)。

对5个不同菌株研究各菌株∶PBMC的比例，单独或结合固定接骨木萃取液浓度(10μg/ml)对IL-6产生的作用。

用副干酪乳杆菌(图3)进行的实验确定了接骨木萃取液加强了副干酪乳杆菌的作用：结合物提供了远高于二者作用(一方面副干酪乳杆菌和另一方面接骨木萃取液)的总和的IL-6的产生。

用干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌或嗜热链球菌时也观察到这类协同，但用短乳杆菌时未观察到，说明协同作用是菌株特异性的。

结论：

确定接骨木萃取液和副干酪乳杆菌协同作用于非特异性免疫反应，因此使人类免疫系统细胞在抵抗感染侵略或病态炎症的过程更具反应性。

并且，观察到协同作用是菌株特异性的。接骨木萃取液和干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌或嗜热链球菌协同作用于非特异性免疫反应。

相反地，接骨木萃取液和短乳杆菌的联合物中未观察到协同作用。因此，这个菌株可以作为其他研究的反面对照。

实施例4：源自给予完整制剂的小鼠的脾细胞的细胞毒性活性的体内研究

介绍

如实施例2和3所示，接骨木浆果萃取液和如副干酪乳杆菌DN-114001的益生菌在体外协同作用以产生增加的细胞因子的产生。这个研究的目的在于评价体内完整制剂对免疫功能的作用和比较每组成分的其的活性：

-副干酪乳杆菌+乳品混合物

-接骨木浆果萃取液

-维生素和矿物盐的混合物＝维生素+矿物质

所用接骨木萃取液按照实施例1制备。

完整制剂是如下成分的结合物：副干酪乳杆菌+乳品混合物、接骨木浆果萃取液、维生素和矿物盐的混合物和赋形剂。3组成分的每一组分使用量等于每一组分在完整制剂中的量。

为了这个目的，本发明人选择监控自然杀伤(NK)细胞的功能。实际上，先天免疫反应，包括NK细胞，是抵抗呼吸道病毒的宿主防御的关键。NK细胞显示了独特的淋巴细胞亚群，其在通过展示细胞毒性功能在抵抗病毒、寄生虫和微生物病原体(3)的早期免疫反应中起重要作用。而且，越来越多的证据表明NK细胞在影响适应性免疫反应(1；2)的性质上具有重要的功能。

原料和方法

动物和治疗

BALB/c雌鼠，7周大，随意指定五组中的一组：

1组→载体(无菌水)

2组→完整制剂(1500mg/kg)

3组→副干酪乳杆菌DN-114001+乳品混合物(393mg/kg)

4组→接骨木浆果萃取液(296mg/kg)

5组→维生素+矿物质(282mg/kg)

用10ml/kg试验产品在D0、D1和D2对它们口服治疗。在D9，小鼠安死且移除脾脏。

细胞毒性分析

抵抗标的的细胞毒性活性采用CytoTox 96非放射性毒性分析确定。收集小鼠的脾细胞并与YAC-I细胞(老鼠T淋巴瘤细胞系)作为标的细胞在适宜的效应物比标的细胞计数比例下在96 V-底培养板中共同培养。在37℃孵化4小时后，测量在上清液中释放的乳酸脱氢酶(LDH)的量。释放的LDH的量用LDH底物测量并在490nm下评估。对每一只小鼠，在三个效应物/标的比例(100∶1-50∶1-和25∶1)下的NK细胞毒性平均百分比(％)采用如下通式确定：

[A₄₉₀实验释放-(A₄₉₀效应物细胞自发释放+A₄₉₀标的细胞自发释放)x100]/(A₄₉₀标的细胞最大释放-A₄₉₀标的细胞自发释放)

统计分析

采用Windows的SigmaStat3.5程序包进行统计分子。采用单因素方差分析(One Way Analysis of Variance)随后使用Holm-Sidak方法的多重对比组来评估结果。统计上认为P＜0.05在所有情况中是明显的。

结果：

研究给予完整制剂或每一成分的小鼠的脾细胞的细胞毒性活性。用完整制剂免疫的小鼠的脾细胞对抵抗YAC-1标的细胞的细胞毒性活性，与那些给予载体(水)的小鼠的细胞对比显著提高(图8)。相反地，用单独成分免疫的小鼠未能增加抵抗YAC-1标的细胞的细胞毒性活性。

结论：

这些数据清楚地显示了单独成分的结合对激活NK细胞的无效率，当以适宜的量结合时充分激活。

参考文献：

1.Di Santo，J.P.Natural killer cell developmental pathways：a question of balance.Annu.Rev.Immunol.24，257-286(2006)

2.Vivier，E.，Tomasello，E.，Baratin，M.，Walzer，T.& Ugolini，S.Functions of natural killer cells.Nat.Immunol.9，503-510(2008)

3.Lodoen，M.B.& Lanier，L.L.Natural killer cells as an initial defense against pathogens.Curr.Opin.Immunol.18，391-398(2006).

实施例5：膳食补充品

可以考虑任意种类的膳食补充品。例如，单位剂量是1g胶囊或2g片剂。

常规组合物如下：

因此，片剂或胶囊的副干酪乳杆菌DN-114 001种群在制备过程的最终阶段是2x10¹⁰CFU。

膳食补充品通过那些本领域技术人员公知的方法制得。特别地，副干酪乳杆菌菌株和接骨木萃取液一个一个单独加入组合物中以获得例如片剂和胶囊。

实施例6：发酵乳产品

单位剂量对应100ml发酵乳产品。但应注意的是，例如，100g的Actimel对应94-97ml的产品，取决于需考虑的灯光或标准处方。

发酵乳产品包含(以重量％计)：

-95％通过副干酪乳杆菌DN-114 001菌株(CNCM I-1518)(Actimel类产品)和通过保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的商业菌株发酵的乳产品。

-5％包含5％浓缩接骨木萃取液果汁，如实施例1所述的传统红果制品。

发酵乳产品的固含量在干燥前约为17％。

发酵乳产品的组合物(标准成分以重量的％计)：

-77％标准脱脂乳(3.64％乳蛋白)

-9.6％巴氏法灭菌乳酪

-5.7％浓缩的脱脂乳

-0.6％脱脂乳蛋白

-6.6％蔗糖

-0.5％右旋糖(Cargill)

-DN-114 001(CNCM I-1518)酵素：10⁸-10⁹CFU/ml

-酵素由10⁷CFU/ml至10⁸CFU/ml的物种总量(populaions globally)的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的几种商业菌株组成。

用接骨木浓缩果汁补充的传统水果制品在加热处理后加入到发酵乳产品中。

最终产品的特征：

每100g这个产物250mg接骨木固体，即每单元剂量，也就是，1.47重量％的接骨木固体，以单元剂量的固体重量计。

花色素含量：25mg/100g，即每单位剂量，也就是，0.147重量％的花色素，以单位计量的固体重量计。

副干酪乳杆菌物种：对100ml发酵产品是10⁸cfu/ml。