一种高纯度、高增殖力、高细胞毒活性的CIK细胞的制备方法

摘要

本发明属于体外细胞培养技术领域，具体是一种高纯度、高增殖力、高细胞毒活性的CIK细胞的制备方法。该制备方法是：采集并分离患者外周血单个核细胞，先经Mini MACS免疫磁珠去除CD4

说明书

技术领域

本发明属于体外细胞培养技术领域，具体是一种高纯度、高增殖力、高细胞毒活性的CIK细胞的制备方法。该方法对患者单个核细胞体外培养前采用MiniMACS间接免疫磁珠正向分选的方法去除Treg细胞，培养过程中加入Treg细胞抑制剂IL-21，以抑制Treg细胞的产生。除常规加入IFN-γ、CD3单抗、IL-2外，同时还加入有丝分裂原(PHA)促淋巴细胞增殖，加入亚硒酸钠以提高CIK细胞的细胞毒性。获得的CIK细胞包括CD3⁺CD56⁺双阳性、CD4⁺、CD8⁺的扩增倍数达到400倍，总比率达到83％-95％；同时去除了CD4⁺CD25⁺Treg细胞。具有更强的抗肿瘤、抗病毒作用。

发明背景

过继性细胞免疫治疗是指通过输注自身或同种特异性、非特异性抗肿瘤免疫效应细胞，直接杀伤肿瘤细胞或病毒的治疗方法。过继性细胞免疫治疗已进入临床应用，并成为继手术、放疗、化疗后的第四大肿瘤治疗方法，特别是过继免疫治疗中的CIK细胞治疗，因具有细胞增殖速度快、杀伤活性高、临床应用副作用小等优点已广泛应用于临床。

CIK细胞(Cytokine Induced Killer)最初是指在正常人体外周血中只占1-5％的CD3⁺CD56⁺T淋巴细胞。临床应用的CIK细胞是经体外扩增的，以CD3⁺CD56⁺、CD3⁺CD8⁺、CD4⁺为主的异质性细胞群，是一种高效的具有广谱杀瘤活力的免疫效应细胞，也是目前国际上公认的最有效的肿瘤生物治疗细胞之一。

临床上单独应用体外培养的各类效应性T细胞治疗实体瘤的总体有效率均未超过30％。其中肿瘤患者存在免疫抑制因素是重要原因。近年来肿瘤免疫抑制网络的重要节点-CD4⁺CD25⁺FOxp3⁺调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)的作用日益受到重视。在荷瘤机体内，Treg细胞数量明显升高。越来越多的证据表明，荷瘤机体内Treg细胞的增加成为导致肿瘤免疫逃逸和限制肿瘤免疫治疗疗效的重要原因之一。所以对Treg调控成为肿瘤免疫治疗的重要环节。

天然Treg是一个具有免疫调节作用的T淋巴细亚群，约占CD4⁺T细胞的5％-10％，起着维持机体自身免疫耐受的作用。而当机体内Treg数量增多或功能增强时，机体就会处于一种高度免疫耐受的状态。现已证实，各种肿瘤患者均能检测到Treg数量有增多趋势。

Treg发挥免疫抑制功能可能通过以下途径：①Treg通过直接的细胞接触来发挥作用，或通过分泌IL-10、TGF-β等抑制性细胞因子来抑制效应细胞；②抑制效应性CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞的活化、增殖；③或经由穿孔素和颗粒酶B途径直接杀伤CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞；④抑制树突状细胞(DC)的功能，通过下调转录因子NF-κB，抑制共刺激分子CD80、CD86、CD40以及TNF-α、IL-12的产生；⑤减少CIK或NK细胞中表达的NKG2D受体的数量，产生的TGF-β抑制NK细胞的细胞毒性；⑥抑制T细胞依赖的B细胞产生免疫球蛋白；⑦抑制免疫效应细胞向肿瘤局部微环境聚集。Treg细胞的抑制作用，既发生在效应细胞活化的最初启动阶段，又发生在效应性细胞发挥杀伤肿瘤细胞作用的最终效应阶段，Treg细胞对效应性细胞增殖、杀瘤能力均有很强的抑制性。

Treg在正常人体的外周血单核细胞(PBMC)中以小于5％的比率存在，但在肿瘤患者中这一比例提高。此外，体外培养CIK细胞时所用的IL-2能诱导Treg细胞增殖，并分泌大量IL-10，由此抑制CIK细胞增殖、降低其细胞杀伤能力。因此迫切需要除去培养前的Treg细胞、培养过程中转化的Treg细胞，以改善CIK细胞的杀伤能力。

免疫磁珠(Immunomagnetic bead，IMB)技术是由John Ugelstar等于1979年提出的一种免疫学技术。IMB为包被有单克隆抗体的球型磁性微粒，可特异性地与靶物质结合使之具有磁响应性。该技术被广泛地应用于医学卫生领域的许多方面，并由此引发了生物分离技术上的一次革命。IMB技术区别于流式细胞技术的一个最明显的优势在于，它可以保证被分离靶细胞的形态和功能完整。免疫磁珠技术同时还具有灵敏度高、特异性高、检测速度快、重复性好、操作简单和不需要昂贵的仪器设备等优点。用IMB技术进行细胞分离有两种方式，一种是直接从细胞混合液中分离出靶细胞的方法称为阳性分离；用IMB去除无关细胞使靶细胞得以纯化的方法称为阴性分离。因此可以利用免疫磁珠将PBMC中的Treg细胞去除。

2003年Rudensky等研究证明Foxp3在T细胞上特异性表达，且Foxp3为Treg细胞发育所必需，在调控T细胞的发育上起着非常重要的作用。Foxp3是Treg细胞发育的一个重要开关。没有Foxp3就没有Treg细胞，因此我们可以利用抑制Foxp3的活性，控制CIK细胞培养中Treg细胞的产生。

IL-21是IL-2家族成员，主要由CD4⁺T细胞分泌，在T细胞、NK细胞、B细胞上均发现其受体。IL-21能促进T细胞、NK细胞的增殖和功能，以及能促进CD8⁺细胞抗肿瘤作用。IL-21可抑制CD4⁺CD25⁺Treg的主要调节者转录因子Foxp3的表达，减少CD4⁺T细胞分化形成Treg细胞，从而相应地抑制Treg细胞的产生。因此我们利用免疫磁珠分选技术在CIK细胞培养前去除Treg细胞，培养过程中加入IL-21，减少CD4⁺T细胞的分化形成Treg细胞，以提高CIK细胞的免疫治疗效果。

众所周知IFN-γ、CD3单抗、IL-2是刺激CIK的主要细胞因子，但前已述及IL-2能诱导Treg细胞增殖，并分泌大量IL-10，由此抑制CIK细胞增殖、降低其细胞杀伤能力。我们在CIK细胞制备过程中也发现，加入IFN-γ刺激，PBMC会发生凋亡，影响了细胞的扩增，因此IL-2、IFN-γ不宜加入过多。而PHA对PBMC的诱导效果和IFN-γ相同，并且具有高效的促增殖作用，可作为T细胞的强激活剂，促进免疫活性细胞前体向免疫活性细胞转化。因此我们推荐用PHA替代部分IFN-γ。CIK细胞的毒性需要提高，亚硒酸钠价格低廉，能提高CIK细胞的毒性，因此我们推荐在CIK细胞培养时加入亚硒酸钠。

发明内容

本发明提供一种高纯度、高增殖力、高细胞毒活性的CIK细胞的制备方法。解决现有方法制备的CIK细胞存在纯度低、增殖力低、细胞毒活性低的缺点。本发明的技术方案是：采集并分离患者外周血单个核细胞，先经Mini MACS分选去除CD4⁺CD25⁺Treg细胞，得到CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺的T细胞。将得到的细胞置于含有PHA、IFN-γ的培养液中，使悬浮液中的PHA浓度为100ng/ml，37℃、5％CO₂的培养箱中孵育24h后，移至经CD3单抗(1μg/ml)包被的细胞培养瓶中，加入IFN-γ(1000U/ml)，48h后加入IL-2(500U/ml)、IL-21(100ng/ml)，4天后补充含有亚硒酸钠(0.005mg/L)培养基继续培养7-14天，即可得到高纯度、高增殖力、高细胞毒活性的CIK细胞。具体是：

(1)Ficoll密度梯度法分离患者抗凝血得到单个核细胞；

(2)经Mini MACS高强度磁珠分离柱(德国MACS公司)分离，除去CD4⁺CD25⁺Treg细胞，获得CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺的T细胞；

(3)含10％自身血浆的培养基重悬上述获得的细胞，经PHA(100ng/ml)活化，孵育24h后，移至经CD3单抗(1μg/ml)包被的细胞培养瓶中，加入IFN-γ(1000U/ml)；

(4)48h后加IL-2(500U/ml)、IL-21(100ng/ml)；

(5)4天后补充含有亚硒酸钠(0.005mg/L)的培养基继续培养7-14天，即可得到高纯度、高增殖力、高细胞毒活性的CIK细胞。

本发明所述的培养基为GT-551人淋巴细胞培养基或RPMI1640培养基，添加10％自身血浆。患者外周血单个核细胞是采用Ficoll密度梯度离心法分离收集。所述的CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺的细胞是采用Mini MACS间接免疫磁珠负向分选方法去除Treg细胞后获得的CIK前期细胞。所述的IFN-γ浓度为1000U/ml，CD3单抗为1μg/ml、IL-2为500U/ml、IL-21为100ng/ml，亚硒酸钠为0.005mg/L，依据单个核细胞的浓度不同，细胞继续培养时间约7-14天收集细胞。

本发明的制备方法培养前使用磁珠分选去除Treg细胞，培养中加入IL-21抑制Treg细胞转化。同时加入PHA以促进CIK细胞增殖，加入亚硒酸钠提高了CIK细胞毒作用，获得的CIK细胞具有更佳的肿瘤治疗效果。

上述方法所得的CIK细胞，包括CD3⁺CD56⁺双阳性、CD4⁺、CD8⁺的细胞总比率占83％-95％；同时去除了CD4⁺CD25⁺Treg细胞。

上述方法所制得的CIK细胞，其能用于治疗各种肿瘤、治疗感染及其他免疫相关疾病的药物中。

本发明的有益效果是：提高了体外扩增的CIK细胞的数量、活性和纯度，使CIK抗肿瘤作用增强。

具体实施方式

下面通过实施例具体描述本发明，但本发明并不受实施例的限制。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，为遵照常规方法和厂家提供的操作说明执行。

实施例1：CIK细胞的制备

1、外周血单个核细胞(PBMC)的制备

用血细胞分离机无菌条件下采集患者抗凝血，1500rpm/min离心10分钟吸取上层血浆，56℃灭活30分钟后离心备用，用生理盐水对倍稀释血细胞沉淀，比重为1.077的人淋巴细胞分离液与稀释血按1∶1.5的比例加入离心管中，2000rpm/min离心15分钟，小心抽取白细胞层，用生理盐水清洗两次，低速离心后得到PBMC。

2、Mini MACS去除CD4⁺CD25⁺Treg细胞

取PBMC细胞悬液调整到适宜的细胞浓度，加入PE-labeled AntiHuman CD25，4℃孵育30min后取出，以MACS专用PBS离心洗涤3次，再加入Anti-PE磁珠，同样置4℃孵育30min，过MACS柱，MACS柱内为阳性分选所得到的CD4⁺CD25⁺Treg细胞，洗脱下来的为去除Treg细胞所得到的CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺的CIK前期细胞。将得到的CIK前期细胞，置于含有PHA、IFN-γ的培养液中，使悬浮液中的PHA浓度为100ng/ml，37℃、5％CO₂的培养箱中孵育24h后，移至经CD3单抗(1μg/ml)包被的细胞培养瓶中，加入IFN-γ浓度为1000U/ml，48h后加入IL-2(500U/ml)，同时加入IL-21(100ng/ml)，抑制培养过程中Treg细胞的产生。4天后补充含有亚硒酸钠(0.005mg/L)培养基继续培养7-14天，即可得到高纯度、高增殖力、高细胞毒活性的CIK细胞。

实施例2：CIK细胞的性质

1.CIK细胞的形态学、细胞活力及免疫表型检测

加入PHA、INF-γ后，大部分细胞仍呈悬浮状态；3天后细胞体积增大，细胞逐渐聚集成团，细胞透亮，胞质丰富；第7天开始，细胞开始大量增殖，细胞形态多样，细胞团增多；取培养10天的细胞100μl，加入100μl 0.4％胎盘蓝染色液，活细胞不被染色，死细胞被染成蓝色。本发明制备的细胞活力大于90％。第14天可见少量死亡细胞。细胞流式检测分析表明，CIK细胞属于异质细胞群，随着培养时间的延长，CD4⁺、CD8⁺、CD3⁺CD56⁺T细胞比率明显升高。

2.CIK细胞纯度、增殖力及免疫表型检测

分别取培养0、4、7、10天100μl浓度约10⁶/ml的细胞，分别加入检测用鼠抗人CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-PE、CD25-PE、CD56-APC抗体10μl，室温避光孵育30分钟，用PBS洗涤两次，流式细胞仪检测发现，本发明制备的细胞中CIK细胞扩增近400倍，CD3⁺CD56⁺阳性、CD8⁺、CD4⁺的T细胞总比率为(91.2±2.95)％，CD3⁺56⁺细胞从(2.1±0.4)％急速扩增到(40.8±3.4)％，CD3⁺56⁺细胞在培养第10天达到峰值。患者CD4⁺CD25⁺Treg细胞占外周血CD4⁺T比例为(12.5±1.5)％，本发明制备的细胞中CD4⁺CD25⁺细胞占CD4⁺T细胞的比例降至(1.01±0.86)％。

3.CIK细胞对B16黑色素细胞的杀伤作用检测

CIK细胞按效靶比例1∶10、1∶20、1∶40加入B16黑色素瘤细胞接种24小时的96孔板内，共同培养24小时后加入新鲜配制的5mg/ml的MTT10μl，共同培养4小时，离心吸弃上清液，每孔加DMSO100μl振荡溶解10分钟，用酶标检测仪在570nm处测定吸光度A值。同时设空白对照、靶细胞对照、效应细胞对照。每孔数值减去空白对照孔，求出3个复孔的平均A值，以杀伤率计算效应细胞的细胞毒活性，杀伤率(％)＝[靶细胞对照A值-(实验孔A值-效应细胞对照A值)]/靶细胞对照A值×100％。结果显示本发明制备的CIK细胞对B16黑色素瘤细胞的杀伤活性是常规方法制备的细胞的5倍，证实IL-21和联用PHA、亚硒酸钠对增强CIK细胞的抗肿瘤效应有协同作用。