永生化人椎间盘髓核细胞体系的制备方法

摘要

本发明公开了一种永生化人椎间盘髓核细胞体系的制备方法。本发明采用外源性人端粒酶反转录酶转染人髓核细胞激活端粒酶诱导构建的永生化人髓核细胞系，为正常细胞而非转化细胞，具有正常生长率、核型，呈现接触抑制和锚着依赖等安全性，不具有致癌性和软琼脂克隆形成能力；同生殖干细胞一样，是真正意义上的永生化，为进一步研究退行性椎间盘病的病变机理提供了标准细胞株，为提高对退变性椎间盘病的整体防治水平提供了新的思路。

说明书

技术领域

本发明涉及细胞生物技术领域，尤其涉及一种永生化人椎间盘髓核细胞体系的制备方法。

背景技术

椎间盘退变是一个极为复杂的生理和病理过程。通过研究探讨椎间盘髓核细胞种群变化的机理，可以为临床采用组织工程再生的方法修复退变的椎间盘组织、恢复功能提供基础。然而，髓核细胞本身增殖能力弱，具有容易老化和生长停滞的特性，因此，有必要通过基因工程技术构建一种永生化的髓核细胞株，以建立标准化的体外髓核细胞研究平台，为提高退变性椎间盘病的治疗以及整体防治水平提供技术研究基础。

细胞自发性永生化的概率很低，啮齿类动物细胞为1E-5～1E-6，而人类细胞则小于1E-12，因此通常采用基因转染方法达到永生化的目的。目前，对于人髓核细胞，Daisuke等报道了通过腺病毒转染SV40基因的方法构建了永生化的人髓核细胞株，细胞培养超过5个月，传20代形态学和功能特性仍保持不变，且无致瘤性，可作为组织工程椎间盘的种子细胞。然而，这种通过病毒或癌基因、原癌基因的转染方法，主要是通过抑制M1期(第一死亡期)机制进行的，细胞在绕过M1期继续生长、经过20～30群体倍增次数后，进入M2期(第二死亡期)，细胞会出现退化凋亡。因此，这种方法构建的细胞株，不同于生殖干细胞，为转化细胞，并非真正意义的永生化，仍然难以满足椎间盘退变病变机理的研究需求。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种采用外源性人端粒酶反转录酶(hTERT)转染人髓核细胞激活端粒酶而诱导制备永生化人椎间盘髓核细胞体系的方法，以构建真正意义上的永生化人髓核细胞系，为进一步研究退行性椎间盘病的病变机理提供标准细胞株，为提高对退变性椎间盘病的整体防治水平提供新的思路。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

本发明提供的一种永生化人椎间盘髓核细胞体系的制备方法，将外源性人端粒酶反转录酶转染人髓核细胞激活端粒酶而诱导获得永生化人椎间盘髓核细胞体系。

所述外源性人端粒酶反转录酶的核苷酸序列如序列表中序列1所示。

所述外源性人端粒酶反转录酶的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

本发明所述外源性人端粒酶反转录酶可以按照以下方法获得：

从肝癌组织中提取总RNA，Oligo-dT为引物，以总RNA为模板，在禽源性反转录酶作用下逆转录获得cDNA；然后进行PCR反应扩增目的基因，经回收纯化获得目的基因PCR产物，并与载体T-Easy进行连接获得重组体T-hTERT。

其中，所述PCR反应采用的引物为：

RT-1：5’-tggaaggagttcgatgccgcgcgctccccgctg-3’    加入Xmn1酶切位点

RT-2：5’-caccctcgaggtgagacgctcgg-3’              带Xho1酶切位点

RT-3：5’-acctcgagggtgaaggcactgttca-3’            带Xho1酶切位点

RT-4：5’-cgctcgagctagtccaggatggtcttgaagtct-3’    带Xho1酶切位点；

并以RT-1和RT-2、RT-3和RT-4引物，分别进行PCR反应。

本发明所述重组体T-hTERT通过构建成pGFP-hTERT真核表达质粒转染人髓核细胞，所述pGFP-hTERT真核表达质粒的构建方法如下：

a)所述重组体T-hTERT和载体pAAV-MCS质粒DNA进行连接，并转化DH5α感受态大肠肝菌，从含卡那霉素的LB平板上，初选阳性克隆，并酶切鉴定获得的pAAV-hTERT质粒；

b)消化连接pAAV-hTERT质粒和pGFP质粒DNA，并转化DH5α感受态大肠肝菌，从含卡那霉素的LB平板上，初选阳性克隆，并酶切鉴定，构建成pGFP-hTERT真核表达质粒。

本发明具有以下有益效果：

(1)采用hTERT转染人髓核细胞激活端粒酶的方法构建永生化髓核细胞体系，已通过了M1期和M2期，所获得的永生化细胞同生殖干细胞一样，是真正意义上的永生化，为进一步研究退行性椎间盘病的病变机理提供了标准细胞株，为提高对退变性椎间盘病的整体防治水平提供了新的思路。

(2)hTERT介导的永生化细胞是正常细胞，并非转化细胞，具有正常生长率、核型，呈现接触抑制和锚着依赖等安全性，不具有致癌性和软琼脂克隆形成能力。

(3)转染hTERT髓核细胞生长速度较正常髓核细胞快，转染hTERT的髓核细胞可以成功传20代以上，与正常髓核细胞第1代相比，细胞内以及细胞外液II型胶原、糖胺多糖基因表达量均无明显差异，裸小鼠致瘤实验表明髓核细胞无致瘤性。

附图说明

下面将结合实施例和附图对本发明作进一步的详细描述：

图1是本发明实施例技术流程框图；

图2是RT-PCR扩增目的基因hTERT基因片段结果；

图3是pGFP-hTERT真核表达质粒酶切鉴定结果；

图4是转染pEGFP-hTERT至正常髓核细胞24小时后荧光显微镜分析结果；

图5是永生化髓核细胞第20代荧光照片；

图6是转染pEGFP-hTERT后RT-PCR扩增髓核细胞hTERT基因片段结果；

图7是转染pEGFP-hTERT后髓核细胞Western blot检测结果；

图8是正常髓核细胞第1代与永生化髓核细胞第20代细胞生长曲线比较；

图9是正常髓核细胞第1代与永生化髓核细胞第20代细胞内相关生长因子基因检测结果；

图10是正常髓核细胞第1代与永生化髓核细胞第20代细胞外液II型胶原表达量比较；

图11是正常髓核细胞第1代与永生化髓核细胞第20代细胞外液糖胺多糖表达量比较；

图12是永生化髓核细胞第2代II型胶原免疫荧光表达；

图13是永生化髓核细胞第20代II型胶原免疫荧光表达；

图14是正常髓核细胞第1代II型胶原免疫荧光表达；

图15是正常髓核细胞第4代I型胶原免疫荧光表达；

图16是种植永生化髓核细胞所致裸小鼠肿物组织学切片显微镜观察情况之一；

图17是种植永生化髓核细胞所致裸小鼠肿物组织学切片显微镜观察情况之二；

图18是种植正常髓核细胞所致裸小鼠肿物组织学切片显微镜观察情况。

具体实施方式

图1～图18所示为本发明永生化人椎间盘髓核细胞体系制备方法的实施例，其技术流程如图1所示，通过目的基因克隆、真核表达质粒中目的基因序列测定、目的基因真核表达质粒的构建、转染hTERT至人髓核细胞并进行表达检测等步骤实现。本实施例通过构建外源性人端粒酶反转录酶(hTERT)重组绿色荧光表达载体，成功转染正常髓核细胞激活端粒酶并在细胞中稳定表达，从而获得永生化人椎间盘髓核细胞体系，并对其生物学特性和安全性进行测定。具体方法如下：

一、正常髓核细胞的分离、培养及传代

正常髓核组织：来自3例脊柱侧弯行矫形的患者，其中2例13岁、1例15岁，可见到外周白色的纤维环和中心胶冻样的髓核组织。用含双抗(青-链霉素)的生理盐水浸泡椎间盘10分钟，用刮匙轻轻将髓核组织从椎间盘中分离，双抗生理盐水浸泡冲洗大约3～4次，直至无明显血迹为止。用眼科剪将髓核组织剪成1×1×1mm大小，将正常椎间盘髓核组织放入盛有10ml 2％II型胶原酶的100ml烧杯中，磁力搅拌器搅拌约60分钟。待组织完全溶解后，1000r/min离心10分钟，吸出上清液，用含10％胎牛血清的DMEM培养基1ml轻轻吹散细胞，吸至50ml培养瓶中，加入10％胎牛血清的DMEM培养基6～8ml，静置于37℃、饱和湿度、5％CO₂孵箱中培养3天。3天后倒置显微镜观察细胞贴壁生长情况，隔天换液。当细胞生长至90％融合状态时，用胰酶消化、传代。

二、构建pGFP-hTERT真核表达质粒

1、材料

RNA试剂盒购于TaKaRa，小提质粒试剂盒、胶回收试剂盒、限制性内切酶、T4DNA连接酶、Taq聚合酶均购自MBI公司，western blot试剂盒购于GEHealthcare公司，一抗hTERT购自abcam公司，二抗mouse-HRP购自博士德公司。

2、引物设计

RT-1：5’-tggaaggagttcgatgccgcgcgctccccgctg-3’    加入Xmn1酶切位点

RT-2：5’-caccctcgaggtgagacgctcgg-3’              带Xho1酶切位点

RT-3：5’-acctcgagggtgaaggcactgttca-3’            带Xho1酶切位点

RT-4：5’-cgctcgagctagtccaggatggtcttgaagtct-3’    带Xho1酶切位点

3、目的基因克隆

用RNA提取试剂盒从肝癌组织中按试剂盒说明提取总RNA，Oligo-dT为引物，以总RNA为模板，在禽源性反转录酶(M-MULV)作用下逆转录1h，获得cDNA；然后，以RT-1和RT-2、RT-3和RT-4引物，分别进行PCR反应，扩增目的基因。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定，证实扩增产物为1.9kb和1.4kb(见图2)，与预期结果一致。按快速凝胶回收试剂盒说明书方法回收纯化PCR产物，获得目的基因PCR产物，并与载体T-Easy进行连接获得重组体T-hTERT。

4、真核表达质粒中目的基因序列测定

从重组体T-hTERT中提取质粒，挑选经初步鉴定的重组体，采用双向测定法测序，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，氨基酸序列如序列表中序列2所示。用DNASIS软件对所测的基因序列和氨基酸序列与GenBank公布的序列进行同源性比较。

5、目的基因真核表达质粒的构建

a)应用Xmn1和Xho1分别完全消化T-hTERT和载体pAAV-MCS质粒DNA，1％琼脂糖凝胶电泳分离，并回收纯化目的DNA片段，然后进行连接，并转化DH5α感受态大肠肝菌，从含卡那霉素的LB平板上，初选阳性克隆，并酶切鉴定pAAV-hTERT质粒。

b)应用Not I完全消化pAAV-hTERT质粒和pGFP质粒DNA，将目的基因pAAV-hTERT表达盒和pEGFP真核表达质粒从胶中切取，纯化回收，然后进行连接并转化DH5α感受态大肠肝菌，从含卡那霉素的LB平板上，初选阳性克隆，并BamH1酶切鉴定，构建成pGFP-hTERT真核表达质粒。酶切鉴定结果如图3所示，证实目的基因在3kb，与预期结果一致。

三、转染pEGFP-hTERT至正常髓核细胞及其表达检测

用BIOMIGA质粒提取试剂盒提取pEGFP-hTERT，细胞转染按试剂Lipofect-amine 2000操作说明书进行。转染pEGFP-hTERT至正常髓核细胞24h后，基因绿色荧光蛋白转染效率见图4。换液后，加G418(250μg/mL)的培养液进行筛选，每2天换液1次。待细胞接近90％融合状态时按前述方法进行细胞传代，获得的永生化髓核细胞第20代荧光照片如图5所示。

转染时，设置转染空载体pEGFP组作空质粒转染对照组检测表达情况。

①以Oligo-dT为逆转录引物，以提取的总RNA为模板，在AMV催化下特异反转录出cDNA。以hTERT的RT-3和RT-4引物扩增目的基因，设定反应条件，进行PCR反应。产物在1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭5μg/μL)中电泳，凝胶成像系统下观察照相。如图6所示，质粒pEGFP-hTERT转染细胞后经过RT-PCR证实目的产物在1.5kb，引用RT-3和RT-4一对引物完成，内参在370bp，与预期的一致。

②western blot，10％SDS-PAGE胶上样，电压90V，恒压电泳120min，电泳转移到0.45um的PVDF膜上；加一抗hTERT(1∶500)，二抗mouse-HRP(1∶3000)，洗膜，用ECL试剂反应显影分析，结果如图7所示。

四、正常髓核细胞与永生化髓核细胞的生物学特性检测对比

1、XTT测定髓核细胞生长曲线

待细胞接近90％融合状态时按前述细胞传代方法制备细胞悬液，计数后以2×10⁴/ml接种96孔培养板，每孔总液量为200μl，以接种时间记为0d，每24h加5mg/L XTT溶液20μl。继续培养4h后，轻轻吸去培养液，加入150μl的DMSO液，振荡摇匀10min，酶标仪上波长490nm检测OD值，设置6个复孔，取平均值。以培养时间为横轴，OD值为纵轴作曲线图。取正常髓核细胞第1代、永生化髓核细胞第20代做7天细胞生长曲线测定，结果如图8所示，永生化髓核细胞从第4天开始，增殖速率明显高于正常髓核细胞。

2、细胞内相关生长因子基因检测

荧光定量PCR(SYBR Green)技术检测正常髓核细胞第1代与永生化髓核细胞第20代细胞内II型胶原、I型胶原、糖胺多糖、BMP-2、IGF-1、TGF-β、BMP-4、PDGF、bFGF的mRNA表达水平。检测结果见图9，其中：

1表示Type I collagen

2表示Type II collagen

3表示Aggrecan

4表示PDGF

5表示IGF-1

6表示TGF-β

7表示bFGF

8表示BMP-2

9表示BMP-4

*代表p＜0.05，H-β-actin＝1

结果显示，细胞内II型胶原、糖胺多糖基因在永生化髓核细胞中表达与正常髓核细胞第1代类似；IGF-1、TGF-B基因在永生化髓核细胞中表达较正常髓核细胞上调了2～3倍。

3、细胞外液II型胶原、糖胺多糖检测(正常髓核细胞第1代与永生化髓核细胞第20代)

(1)细胞外液II型胶原ELISA检测

加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100ul，余孔分别加标准品或待测样品100ul；37℃盖膜孵育反应120分钟；弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液100ul；37℃盖膜孵育反应60分钟；洗板3次，每次浸泡1～2分钟；每孔加检测溶液100ul；37℃盖膜孵育反应60分钟；洗板5次，每次浸泡1～2分钟；每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色(30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3～4孔有明显的梯度兰色，后3～4孔梯度不明显，即可终止)；依序每孔加终止溶液50ul，终止反应，用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)，检测。结果见表1和图10。

(2)细胞外液糖胺多糖含量检测

a)显色液(PH3.0)：将DMMB16mg，甘氨酸3.04g、NaCl 2.37g和0.1M HCl 5.0ml置于同一容器内，加双蒸水定容至1000ml。以上贮备液均经过滤灭菌，所用容器经50％硝酸浸泡处理。

b)Chondroitin Sulfate A标准曲线

按以下方法配制各浓度Chondroitin Sulfate A：

1000ug/ml：100mgChondroitin Sulfate A加双蒸水定容至100ml，然后依次配制500ug/ml、250ug/ml、125ug/ml、62.5ug/ml、31.25ug/ml、15.6ug/ml、7.8ug/ml.、3.9ug/ml的Chondroitin Sulfate A溶液。

A525下测定光密度(OD)，绘制标准曲线。

c)糖胺多糖含量测定

取100ul细胞上清，加显色剂2.5ml，混匀后于15s时放入分光光度计内，A525下测定光密度值(OD)。根据Chondroitin Sulfate A标准曲线将所测OD值换算为样本糖胺多糖含量，结果见表1和图11。

表1髓核细胞外基质中II型胶原和糖胺多糖表达量(μg/L)

从表1和图10、图11可以看出，正常髓核细胞第1代与永生化髓核细胞第20代，两者的II型胶原合成并没有明显差异，正常髓核细胞为29.89±3.18，永生化髓核细胞为33.49±3.94。糖胺多糖合成也没有明显差异，正常髓核细胞为41.55±2.80μg/L，永生化髓核细胞为47.96±6.74μg/L。

上述细胞内相关生长因子基因以及细胞外液II型胶原、糖胺多糖的检测结果表明，转染hTERT后NP细胞增殖加速，传了20代细胞仍未见老化，细胞内II型胶原、糖胺多糖基因表达与正常髓核细胞第1代类似；细胞外液II型胶原、糖胺多糖与正常髓核细胞第1代类似。而未转染hTERT的NP细胞传4～5代增值基本停滞了。传代超过20代的细胞被称为永生化细胞，转染hTERT后的永生化髓核细胞在传30代到50代时表现为接触抑制，细胞增殖基本停止。

4、NP细胞Collagen-I、Collagen-II免疫荧光细胞化学染色

用物：Anti-Collagen-I：Calbiochem(USA)，Anti-Collagen-II：Calbiochem(USA)，CY3：博士德生物工程有限公司(武汉)

方法：Collagen-I、Collagen-II免疫荧光细胞化学染色进行定性分析。取第20代永生化髓核细胞以1×10⁴/ml接种于表面涂有多聚赖氨酸的消毒盖玻片上，每片接种2ml，于37℃、5％CO₂、95％空气、饱和湿度条件下培养24小时后，收集细胞爬片，用0.02mmol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，每次5min，4％多聚甲醛固定液固定30min，用蒸馏水洗4次，每次5min中止。分别用30％H₂O₂1份+纯甲醇10份浸泡10min阻断内源性过氧化物酶活性，0.3％Triton X-100浸泡15min破细胞膜，非免疫山羊血清封闭，按实验分组分别加入单克隆鼠抗人Collagen-I、Collagen-II 1∶200(1％牛血清白蛋白稀释)100ul，置4℃冰箱湿盒过夜；35±1℃温箱复温30min，0.02mmol/L PBS充分漂洗后按抗体来源分别加入1∶50的CY3标记的羊抗鼠IgG或羊抗兔IgG100ul，35±1℃温箱湿盒避光作用30min，0.02mmol/L PBS避光漂洗中止，DAPI封片，荧光显微镜系统、数码彩色CCD摄像机及显微图像分析系统采图。

如图12所示，刚转染hTERT不久，髓核细胞外基质染色以II型胶原为主；传20代之后，仍未见I型胶原表达(见图13)。而正常髓核细胞传4代以后I型胶原取代了II型胶原(见图14、图15)。永生化髓核细胞第20代I型胶原免疫荧光染色阴性。

6、动物实验

将10只裸小鼠随机分为2组，每组5只，分为实验组和正常对照组。实验组将1×10⁷个/ml永生化髓核细胞种植于裸鼠右肩胛背皮下，每点0.2ml。对照组将正常髓核细胞种植于裸小鼠右肩胛背皮下。种植后1、2、3、4周观察，裸小鼠成瘤情况如下：

实验组：1周时，在裸小鼠右肩胛注射永生化髓核细胞处出现1×1cm²大小肿物，质硬、活动度可。2周后，肿物较1周时略减小，约1×0.5cm²大小。3周后肿物明显减小，约0.3×0.3cm²大小，质硬。4周后，裸小鼠右肩胛背皮下肿物基本吸收，大约0.1×0.1cm²大小。

对照组：肉眼未见有肿物生成。

取材进行病理组织学检查。

7、病理组织学检查

取材后，将标本用体积分数为4％的中性甲醛液固定后，100g/L甲酸脱钙，逐级乙醇脱水→石蜡包埋→切片→常规苏木精-伊红染色→显微镜下观察情况并拍片，观察其特征。

第1、2、3、4周病理组织学研究表明：实验组裸小鼠右肩胛背皮下形成了细胞团块(见图16)；如图17所示，中央有红色的坏死组织，周围有中性粒细胞侵润，炎症细胞形成细胞包囊结构，可见较多纤维样母细胞，可见巨噬细胞，未见细胞异型性，无肿瘤生成。对照组肉眼未见肿物形成，但取材切片后，仍见到细胞团块形成(见图18)、炎症细胞侵润等，均未见细胞异型性。

综上所述，本实施例构建出hTERT重组绿色荧光表达载体，成功转染正常髓核细胞并在细胞中稳定表达。转染hTERT髓核细胞生长速度较正常髓核细胞快，转染hTERT的细胞可以成功传20代以上，与正常髓核细胞第1代相比，细胞内II型胶原、糖胺多糖基因表达量无明显差异，细胞外液II型胶原、糖胺多糖也无明显差异；裸小鼠致瘤实验表明永生化髓核细胞无致瘤性。表明运用hTERT转染髓核细胞成功构建永生化髓核细胞体系。