一种用于胃活检组织标本幽门螺杆菌培养用运送液及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种用于胃活检组织标本幽门螺杆菌培养用运送液及其制备方法和应用。本发明通过提高粘度、适当提高酸碱度、增加抗杂菌药物，有利于活检组织标本中幽门螺杆菌的存活，延长标本保存时间。本发明具有很好的实用价值，取材后24小时内送检不影响细菌检出率，24小时内室温保存幽门螺杆菌存活率达到50％以上，适用于各级医院和检验机构的检测应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物培养用运送液及其制备方法和应用，具体涉及胃活检组织标本幽门螺杆菌培养用运送液及其制备方法和应用。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是一种能长期定植于胃黏膜的致病菌，革兰染色阴性，弯曲状或轻微螺旋状，长2.5～5mm、粗0.5mm的细菌。该菌通常在胃小凹内及腺腔内，呈不均匀的集团状分布。可分泌多种外毒素，使胃黏膜上皮损伤，分泌的过氧化氢酶、脂肪酶、磷酸酶、蛋白水解酶以及毒素等，均可损伤胃上皮细胞，引起胃黏膜炎症改变。

研究表明，幽门螺杆菌感染与慢性胃炎、消化性溃疡等胃部疾病密切相关，并被WHO确认为胃癌的第一致病因素。慢性胃炎是困扰我国各个人群的常见疾病，继2000年第一次慢性胃炎共识后，2006年的《中国慢性胃炎共识意见》中重申了长期幽门螺杆菌的感染不仅可使部分患者的消化不良症状得到长期改善，还有利于胃癌的预防。

诊断是否存在Hp感染，最准确的方法是病原学检查，即细菌的培养，该法的特异性可达100％，常作为幽门螺杆菌检测的“金标准”。另外，只要Hp培养成菌落，除了可用各种方法鉴定外，还可以对不同来源的细菌进行体外药敏实验，对治疗幽门螺杆菌具有较好的针对性，从而提高Hp根除率。

幽门螺杆菌是寄居于环境复杂的胃部，原代培养时，对气体的要求比较严格，一般为2％～5％的氧气(微需氧)，最高不超过3％～7％。培养基的pH值在中性或稍偏碱性时最好。目前，临床上多直接用无菌试管或用无菌肉汤管作为细菌培养用标本的运送液来运送标本。但这两个方法均无法用于幽门螺杆菌培养标本的运送：由于用无菌试管或用无菌肉汤作为运送液在室温保存条件下保存超过5小时，标本中的幽门螺杆菌即已死亡，从而出现假阴性的培养结果。临床上无法开展幽门螺杆菌的常规培养，主要可能是因为没有合适的用于胃活检组织标本幽门螺杆菌培养用运送液之故。

目前为止，在幽门螺杆菌的研究中有运用生理盐水、stuart运送液、markus输送液等用于标本的运送，起运的温度在-20℃或4℃。生理盐水成分单一，且因未加抗菌物质，容易受杂菌污染，另外在室温条件下超过4h幽门螺杆菌即死亡，即使在4℃保存也不应超过5h，因此生理盐水可作为快速或短距离的标本的运送液。stuart运送液营养成分较好，但未加抗生素，易造成杂菌污染，因加入盐酸半胱氨酸和硫代醋酸钠，使得液体呈酸性，不利于组织及其中的细菌的存活。Markus输送液以布氏肉汤为基础，加入小牛血清增加营养和蛋白含量，溶液也呈酸性。stuart运送液和Markus输送液均加入0.1～1％的琼脂增加粘性以隔离空气，由于琼脂在室温下为凝固状态，在把标本放入的过程中易形成断层，从而使组织标本未能与空气完全隔绝，影向细菌的存活能力，不是一个很好的增加黏性的物质。(参考文献：1.胡伏莲，周殿元：幽门螺杆菌感染的基础与临床(第三版)，北京：中国科学技术出版社，2010，1；2.Markus Heep，Karlington Scheibl，Andrea Degrell，et al.Transport and storage of fresh and frozen gastric biopsy specimens for optimal recovery of helicobacter pylori.Journal of ClinicalMicrobiology，Nov，1999：3764-3766)

发明内容

本发明针对幽门螺杆菌微需氧，寄居于胃黏膜的特性，提供具有一定粘度，蛋白含量较高，具有抑制其他杂菌或污染菌，及有利于保存幽门螺杆菌的偏碱性环境，并能在室温条件下保存应用的运送液，便于临床开展幽门螺杆菌的常规培养工作。

本发明为含有蔗糖50-100g，麦芽糊精20-50g，胰蛋白胨10-15g，大豆蛋白胨5-10g，L-精氨酸1-5g，小牛血清50-100ml，甘油50-100ml，碳酸氢钠50-100g，氯化钠50-90g的组合液。

按比例称取称取50-100g蔗糖、10-15g胰蛋白胨、5-10g大豆蛋白胨、50-90g氯化钠，500ml蒸馏水溶解，加入50-100ml甘油后，115℃灭菌20min，之后按比例加入过滤除菌的麦芽糊精和L-精氨酸，小牛血清，碳酸氢钠，最后加入加入10mg、制霉菌素2500IU和多粘菌素5mg抗生素混合液，用无菌小瓶分装，4℃保存备用。

本发明所提供的用于胃活检组织标本幽门螺杆菌培养用运送液可以用于使用一次性活检钳和消毒后重复使用活检钳采集的胃黏膜标本，适合温度为25℃及以下，放置时间24h。其使用方法：运送液3ml～5ml分装于无菌小瓶中，室温保存备用。将取得的胃黏膜标本置于其中，24h内送实验室即可。

本发明具有如下的优点和效果：

1.24小时内Hp室温保存存活率达到50％以上。

2.本发明模拟胃液成分，有利于维持离体组织的细胞功能，使其中的Hp保存效果更好。

3.本发明提高了蛋白含量及增加L-精氨酸，可提高幽门螺杆菌24h存活率20％以上。与Stuart转送液相比，L-精氨酸不仅参与尿素代谢过程，还较盐酸半胱氨酸水溶性好，对溶液的pH影响小。盐酸半胱氨酸使溶液的pH值过于偏酸性，不利离体组织细胞维持及细胞中幽门螺杆菌的保存。

4.本发明可室温放置，取材后24h内送检不影响细菌检出率。

5.本发明的配制简便，适用于各级医院和检验机构。

具体实施方式

实施例1

一种用于胃活检组织标本幽门螺杆菌培养用运送液的组合物要由糖类化合物，蛋白类化合物，甘油，碳酸氢钠，氯化钠，抗生素混合液组成。按如下重量或体积取各组分：

麦芽糊精    20g

蔗糖        80g

L-精氨酸    1g

胰蛋白胨      10g

大豆蛋白胨    5g

氯化钠        50g

碳酸氢钠      75g

甘油          50ml

小牛血清      50ml

加蒸馏水至总体积为1000ml

该组合物的制备过程为：称取蔗糖、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、氯化钠，用蒸馏水溶解，加入甘油后115℃灭菌20min。冷却后，先加入过滤除菌的麦芽糊精，L-精氨酸，然后加入无菌小牛血清，随后加入无菌碳酸氢钠，加入10mg、制霉菌素2500IU和多粘菌素5mg抗生素混合液混合液。用无菌小瓶分装，每瓶3～5ml。分装的运送液4℃保存。

该组合物的使用方法为：将活检钳钳取的胃黏膜标本，直接放入分装有运送液的小瓶中，室温放置，24h内送实验室。

实施例2

一种用于胃活检组织标本幽门螺杆菌培养用运送液的组合物要由糖类化合物，蛋白类化合物，甘油，碳酸氢钠，氯化钠，抗生素混合液组成。按如下重量或体积取各组分：

麦芽糊精        20g

蔗糖            100g

L-精氨酸        5g

胰蛋白胨        15g

大豆蛋白胨      5g

氯化钠          80g

碳酸氢钠        100g

甘油            75ml

小牛血清        70ml

加蒸馏水至总体积为1000ml

该组合物的制备过程为：称取蔗糖、蛋白胨、胰化大豆蛋白、氯化钠，用蒸馏水溶解，加入甘油，115℃灭菌20min。冷却后，先加入过滤除菌的麦芽糊精，L精氨酸，然后加入无菌小牛血清，随后加入无菌碳酸氢钠，加入10mg、制霉菌素2500IU和多粘菌素5mg抗生素混合液。用无菌小瓶分装，每瓶3～5ml。分装的运送液4℃保存。

该组合物的使用方法为：将活检钳钳取的胃黏膜标本，直接放入分装有运送液的小瓶中，室温放置，24h内送实验室。

实施例3

一种用于胃活检组织标本幽门螺杆菌培养用运送液的组合物要由糖类化合物，蛋白类化合物，甘油，碳酸氢钠，氯化钠，抗生素混合液组成。按如下重量或体积取各组分：

麦芽糊精    30g

蔗糖        50g

L-精氨酸    2g

胰蛋白胨    10g

大豆蛋白胨  10g

氯化钠      90g

碳酸氢钠    100g

甘油        100ml

小牛血清    100ml

加蒸馏水至总体积为1000ml

该组合物的制备过程为：称取蔗糖、蛋白胨、胰化大豆蛋白、氯化钠，用蒸馏水溶解，加入甘油，115℃灭菌20min。冷却后，先加入过滤除菌的麦芽糊精，L-精氨酸，然后加入无菌小牛血清，随后加入无菌碳酸氢钠，加入10mg、制霉菌素2500IU和多粘菌素5mg抗生素混合液。用无菌小瓶分装，每瓶3～5ml。分装的运送液4℃保存。

该组合物的使用方法为：将活检钳钳取的胃黏膜标本，直接放入分装有运送液的小瓶中，室温放置，24h内送实验室。

实施例4

不同温度条件下运送液中标准菌株的存活情况

一、实验材料

1、运送液：按照实施例1配制；

2、标准菌株：幽门螺杆菌SS1株；

二、标准菌株在运送液中的存活时间

将定量的10⁴cfu/ml标准菌株幽门螺杆菌SS1株1.0ml加入运送液中，室温(25℃)保存。于不同时间(0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40h)取0.5ml接种于哥伦比亚血琼脂平板，每一时间段取2次作为平行。厌氧罐培养5天，观察结果。结果：0～24h细菌生长良好，28h、32h、36h虽有生长，但菌落数量显著减少，40h之后无生长。

三、标准菌株在不同温度运送液中的存活率

将定量的10⁶cfu/ml标准菌株幽门螺杆菌SS1株1.0ml加入运送液中，不同温度下保存，于不同时间取0.5ml接种于哥伦比亚血琼脂平板，每一时间段取2次作为平行。厌氧罐培养5天，观察结果。计算不同时间段的存活率。结果如下：

表1 SS1株在运送液中不同温度条件下不同时间的存活率

实施例5

运送液对标准菌株的应用

一、实验材料

1、运送液：按照实施例1、2、3配制；

2、标准菌株：HpSS1；

3、培养基：哥伦比亚血琼脂平极

二、将定量的10⁵cfu/ml标准菌株幽门螺杆菌SS1株1.0ml加入不同配方的运送液及stuart运送液中，室温保存，于不同时间取0.5ml接种于哥伦比亚血琼脂平板，每一时间段取2次作为平行。厌氧罐培养5天，观察结果。计算不同时间段的存活率。下表为上述实施例中组合物在室温下保存，标准菌株不同时间的存活率：

综上表明，本发明的运送液不仅可在室温保存活检胃黏膜标本，还能提高幽门螺杆菌的阳性检出率。本发明可使临床胃活检组织标本幽门螺杆菌培养成为常规检查的可能。