人类骨髓、脐带血、外周血细胞处理试剂盒及细胞处理方法

摘要

本发明涉及一种人类骨髓、脐带血、外周血细胞处理试剂盒及细胞处理方法，从根本上解决了现有细胞分离技术中存在的造价高、细胞活性低、标记物在人体内反应不明，需要打动员剂造成患者痛苦，获取时间长，繁琐不适用临床等问题。其技术要点是：试剂盒中包含以下三种试剂：1号液为稀释剂：0.9％氯化钠注射液或PBS液，2号液为沉淀剂：6％羟乙基淀粉或0.2％－1％甲基纤维素，3号液为分层液：由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1.075±0.001的分层液。本试剂盒易于存储运输、可产业化生产、使用方便快捷。

说明书

技术领域

本发明涉及一种体外分离人类骨髓、脐带血等中干细胞的方法，特别是一种人类骨髓、脐带血、外周血细胞处理试剂盒及细胞处理方法，属于生物医学技术应用领域。

背景技术

随着现代科学技术的不断发展，用于人类血液细胞的分离技术也得到了长足的发展，目前主要有以下几种处理方法：

1、免疫磁珠法：即将已知的抗体包被在磁珠微粒上，使磁珠微粒与人类血液混合。呈抗原抗体阳性的细胞粘附在磁珠上，通过一条磁性管道，磁珠被吸附在管壁上；其他没有结合磁珠的细胞都流走后，去除管道磁性，搜集所有含有磁珠的细胞。这种方法存在的问题是：造价高，中低收入患者不适用。同时对细胞本身活性有损伤，影响细胞治疗疗效。

2、流式细胞仪法：分选原理是流式细胞计的分选功能是由细胞分选器完成的。其总的分离过程是：由喷嘴射出的液柱被分割成一连串的小水滴，根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选，而后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器中；其它液体被当作废液抽吸掉，某些类型的仪器也有采用捕获管来进行分选的。

3、血细胞分离机法：这种方法主要用于分离外周血，先给患者注射动员剂，然后使患者外周血经过血细胞分离机循环过滤，得到一定范围直径的细胞，用于细胞治疗。这种方法存在的问题是：打动员剂会增加治疗负担，分离后细胞液体积过大，患者承担一定的生命危险。

4、培养扩增法：采集人类血液后，加入试剂置于培养箱扩增，1周后清洗使用。存在的问题是：污染率高，干细胞向未知方向分化为未知干细胞，时间长。

随着细胞分离技术对人们生活的日益重要，出现了越来越多的这方面的相关专利。申请号为200510130326.7的“一种分离细胞的方法及专用细胞分层液”主要是针对鸡，牛，人血液需要做各种调整，准确度堪忧，由于添加了表面活性剂分离出的细胞未知，所以只能用于简单的细胞试验使用；申请号为200610035900.5的“一种干细胞分层液及其用于干细胞分离的方法”需要配制工作液，需要调节比重，只能搜集密度在1.083范围内的细胞，即搜集到的细胞较杂，而治疗所需要的目标细胞数量少，并且对于脐带血来说，该专利方法去除不净红细胞，最终临床应用的时候会导致患者产生排异反映；申请号为200610114475.9的“用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒”，缺点是由于使用该专利直接分离血液中的干细胞，数量不足以临床治疗使用，所以该专利进行了细胞培养，培养的细胞污染率高，体外模拟体内环境使细胞扩增，导致培养出的细胞有形态没功能，不能用于临床治疗；申请号为200610106875.5的“一种有核细胞体外分离试剂盒及其应用方法”所采用的HISTOPAGUE1077为密度1.077的淋巴细胞分层液，经此分离后的细胞绝大多数为淋巴细胞，这样直接导致细胞中能够用于治疗的干细胞占少数，影响临床疗效；申请号为200710137781.9的“骨髓脐带血干细胞体外分离试剂盒及其应用方法”的缺点是该专利试剂中添加了lin抗体，导致成本大大提高，投入到临床使用中后，给中低收入患者造成负担，导致患者看不起病，接受不起细胞治疗，并且使用了lin抗体对细胞清洗造成了较大负担，此种物质进入人体后会发生何种变化还是未知数，还有待进一步研究。

综上，现有细胞分离技术主要存在以下几方面问题：1、治疗成本高。完成细胞分离工作的仪器设备(如：血细胞分离机及流式细胞仪)价格昂贵，导致治疗成本升高，增加了患者的治疗费用，不利于项目的推广和普及；2、细胞活性低。免疫磁珠法和流式细胞仪法筛选出来的均是被标记了的细胞，这些分选方法均存在筛选细胞范围小、细胞负重后活性降低以及标记物留在人体内会变成什么还是未知等问题；3、细胞液体积大。使用血细胞分离机分离的一般为外周血，且需要采集前打2-7天动员剂，将骨髓中干细胞动员到外周血里，经血细胞分离机处理后筛选出的细胞液体积较大，一般都超过50ml，且红细胞去除不干净。最后得到的细胞悬液体积大、质量不佳，只能用于自体皮下注射；4、获取细胞时间过长。培养扩增一周后才能用于临床治疗，时间过长会延误治疗的最佳时机，影响治疗效果，培养期间造成污染率提高；5、传统的分离方法仅限于实验室及科研使用。许多分离方法操作过程繁琐，对人员的专业要求较高，既费时又费力。从实验方法到临床应用还需要技术改进；6、不能产业化。实验成本高、操作环节中污染机率大、细胞液的保存运输条件不备，导致提取的细胞液数量有限，满足不了临床治疗的大量需求；另外，上述相关专利还存在原料来源复杂、配制繁琐、对于分离哪种血液针对性不强(因为人类血和动物血细胞存在一定差异)，原料用到质量难以控制的生物制品等缺点。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种可操作性强、临床安全性高、便于临床推广的人类骨髓、脐带血、外周血细胞处理试剂盒及细胞处理方法，它从根本上解决了现有细胞分离技术中存在的造价高、细胞活性低、标记物在人体内反应不明，需要打动员剂造成患者痛苦，获取时间长，繁琐不适用临床等问题。同时本试剂盒易于存储运输、可产业化生产、使用方便快捷。

本发明的技术方案是：该人类骨髓、脐带血、外周血细胞处理试剂盒，其技术要点是：所述试剂盒中包含以下三种试剂：

1号液为稀释剂：0.9％氯化钠注射液或PBS液，

2号液为沉淀剂：6％羟乙基淀粉或0.2％-1％甲基纤维素，

3号液为分层液：由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1.075±0.001的分层液。

一种应用如权利要求1所述的人类骨髓、脐带血、外周血细胞处理试剂盒的细胞处理方法，其技术要点是：将含有枸橼酸钠抗凝液的骨髓或脐带血或外周血加入到含有20-350毫升1号液的大容量培养液瓶中，再加入4-200毫升2号液摇匀1-8分钟，后静置3分钟-3小时，待分层后吸取上层细胞液以500-4000转离心1-20分钟，离心浓缩后用生理盐水稀释到10-150毫升铺到1-100毫升3号液上层，然后以500-4000转离心1-60分钟使分出干细胞层，收集干细胞层后用生理盐水清洗细胞1-5次，待用。

本发明的优点和积极的技术效果：本发明能够分离人类骨髓或脐带血或外周血中的干细胞，即将试剂盒中1号2号3号液试剂组合应用，利用人类各种血细胞密度不同，通过2号试剂结合血液中红细胞等不能起到临床治疗效果的细胞，使其重量增加，沉淀到细胞培养液瓶的底部，再利用各种细胞密度差异将它们分散于自上而下的试剂层次中去除人类骨髓或人类脐带血或外周血中的红细胞，血浆，血小板，血红蛋白，粒细胞等，经过本发明分离的干细胞回收率能够达到85％以上，由于干细胞等细胞没有标记物等负重，使细胞存活率检测大于98％。1-3号试剂原料便宜，配置过程简单质量可控，具有造价低，无任何标记物，保留原有细胞活性，细胞液体积小，干细胞种类齐全，分离操作时间短1小时左右即可完成，细胞数量能够满足临床治疗的需要等优点。另外国内现有的一些专利，只能分离人类骨髓和脐带血，不能分离外周血，分离的细胞种类以淋巴细胞居多，起不到良好的治疗效果，没有自我更新和分化潜能，而本发明不仅分离血液针对性强，而且能够分离人类骨髓或脐带血或外周血。本发明试剂盒中原料简单易得，成本低廉，不使用质量难以控制的生物制品。能够实现在最低的价格，最简便的分离方法下分离出治疗所需要的细胞的目的。同时本明配有大容量培养液瓶，免除了临床现有少量多次处理细胞的繁琐过程，大大降低了污染机率，对环境及细胞本身不会造成任何污染，是临床上迫切需要的一种分离细胞的试剂盒及方法。

附图说明

结合附图对本发明作进一步说明：下列各图为使用本发明分离干细胞的方法原理示意图。

图1：人类骨髓、脐带血、外周血细胞处理第一步示意图，去除红细胞等细胞。

图2：第二步去除血浆，血小板，血红蛋白，粒细胞等细胞。

图3：第三步清洗分离出来的干细胞。

图中序号说明：1人类骨髓/脐带血/外周血中的细胞液；2人类骨髓/脐带血/外周血中被去除细胞；3是血浆层；4有核细胞，干细胞层；5红细胞层；6经过本发明处理后的细胞。

具体实施方式

根据图1-3对本发明作详细描述。本发明研制了一种人类骨髓、脐带血、外周血细胞处理试剂盒，其中：试剂盒包含以下三种试剂：

1号液为稀释剂：0.9％氯化钠注射液或PBS液，

2号液为沉淀剂：6％羟乙基淀粉或0.2％-1％甲基纤维素，

3号液为分层液：由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1.075±0.001的分层液。

另外，本发明也公开了一种应用上述试剂盒的细胞处理方法，其具体步骤是：将含有枸橼酸钠抗凝液的骨髓或脐带血或外周血加入到含有20-350毫升1号液的大容量培养液瓶中，再加入4-200毫升2号液摇匀1-8分钟，后静置3分钟-3小时，待分层后吸取上层细胞液以500-4000转离心1-20分钟，离心浓缩后用生理盐水稀释到10-150毫升铺到1-100毫升3号液上层，然后以500-4000转离心1-60分钟使分出干细胞层，收集干细胞层后用生理盐水清洗细胞1-5次，待用。为了更好理解和说明本发明，下面利用实施例来详细阐述。

实施例1：分离骨髓

试剂盒组成如下：

1号液：稀释剂：选用PBS液，其配制过程是先用少量水溶解下述试剂：氯化钠4g，氯化钾0.1g，12水磷酸氢二钠1.445g，磷酸二氢钾0.1g，然后加水至500ml，即得。使用前利用5.6％的碳酸钠调节pH至7.2。

2号液：沉淀剂：6％羟乙基淀粉(市售)。

3号液：分层液：将聚蔗糖与泛影葡胺配制成比重为1.075的分层液。

将上述1号液经过10磅、10分钟灭菌，检测其内毒素含量≤0.5EU/ml，装瓶，4℃保存。3号液经过10磅、10分钟灭菌，检测其内毒素含量≤5EU/ml，装瓶。

利用上述试剂盒对细胞处理方法：将含有枸橼酸钠抗凝液的人类骨髓200ml加入到含有200ml的试剂1号液中，再加入150ml试剂2号液中，摇匀3分钟，放置30分钟，待分层后吸取上层细胞液，分装至50ml离心管中，以1500转离心5分钟，搜集下层细胞液，用生理盐水稀释后铺在试剂3液上，以2000转离心20分钟，收集中间干细胞层后，用生理盐水清洗3次，再用生理盐水稀释至临床使用体积即得。

表1：实施例1中分离出的干细胞回收率

  编号  分离前CD₃₄  分离后CD₃₄  回收率  1  6.6×10⁷  5.6×10⁷  85％

  2  3.5×10⁷  3.0×10⁷  86％  3  6.4×10⁷  5.8×10⁷  91％

实施例2：分离脐带血

试剂盒组成如下：

1号液：稀释剂：0.9％氯化钠注射液(即生理盐水)市售。

2号液：沉淀剂：6％羟乙基淀粉(市售)。

3号液：分层液：将聚蔗糖与泛影葡胺配制成比重为1.076的分层液。

将上述3号液经过10磅、10分钟灭菌，检测其内毒素含量≤5EU/ml，装瓶。

利用上述试剂盒对细胞处理方法：将含有枸橼酸钠抗凝液的人类脐带血100ml加入到含有100ml的试剂1号液中，再加入100ml试剂2号液中，摇匀3分钟，放置30分钟，待分层后吸取上层细胞液，分装至50ml离心管中，以1500转离心5分钟，搜集下层细胞液，用生理盐水稀释后铺在试剂3液上，以2000转离心20分钟，收集中间干细胞层后，用生理盐水清洗3次，再用生理盐水稀释至临床使用体积即得。

表2：实施例2中分离出的干细胞回收率

  编号  分离前CD₃₄  分离后CD₃₄  回收率  1  6.5×10⁶  5.5×10⁶  85％  2  4.3×10⁶  3.7×10⁶  86％  3  5.2×10⁶  4.5×10⁶  87％

实施例3：分离外周血

试剂盒组成如下：

1号液：稀释剂：0.9％氯化钠注射液(即生理盐水)市售。

2号液：沉淀剂：甲基纤维素(进口)2.5克，加入到500毫升4℃生理盐水中，摇匀。即得0.5％甲基纤维素。

3号液：分层液：将聚蔗糖与泛影葡胺配制成比重为1.074的分层液。

将上述2号液经过10磅、10分钟灭菌，检测其内毒素含量≤0.5EU/ml，装瓶，4℃保存。3号液经过10磅、10分钟灭菌，检测其内毒素含量≤5EU/ml，装瓶。

利用上述试剂盒对细胞处理方法：将含有枸橼酸钠抗凝液的人类外周血200ml加入到含有200ml的试剂1号液中，再加入150ml试剂2号液中，摇匀3分钟，放置30分钟，待分层后吸取上层细胞液，分装至50ml离心管中，以1500转离心5分钟，搜集下层细胞液，用生理盐水稀释后铺在试剂3液上，以2000转离心20分钟，收集中间干细胞层后，用生理盐水清洗3次，再用生理盐水稀释至临床使用体积即得。

表3：实施例3中分离出的干细胞回收率

  编号  分离前CD₃₄  分离后CD₃₄  回收率  1  3.9×10⁷  3.4×10⁷  87％  2  7.0×10⁷  6.2×10⁷  89％  3  4.1×10⁷  3.5×10⁷  85％

实施例4：分离人类骨髓

试剂盒组成如下：

1号液：稀释剂：0.9％氯化钠注射液(即生理盐水)市售。

2号液：沉淀剂：甲基纤维素(进口)5克，加入到500毫升4℃生理盐水中，摇匀。即得1％甲基纤维素。

3号液：分层液：将聚蔗糖与泛影葡胺配制成比重为1.075的分层液。

将上述2号液经过10磅、10分钟灭菌，检测其内毒素含量≤0.5EU/ml，装瓶，4℃保存。3号液经过10磅、10分钟灭菌，检测其内毒素含量≤5EU/ml，装瓶。

利用上述试剂盒对细胞处理方法：将含有枸橼酸钠抗凝液的人类骨髓200ml加入到含有200ml的试剂1号液中，再加入150ml试剂2号液中，摇匀3分钟，放置30分钟，待分层后吸取上层细胞液，分装至50ml离心管中，以1500转离心5分钟，搜集下层细胞液，用生理盐水稀释后铺在试剂3液上，以2000转离心20分钟，收集中间干细胞层后，用生理盐水清洗3次，再用生理盐水稀释至临床使用体积即得。

表4：实施例4中分离出的干细胞回收率

  编号  分离前CD₃₄  分离后CD₃₄  回收率  1  5.8×10⁷  4.9×10⁷  84.4％  2  6.4×10⁷  5.3×10⁷  83％  3  7.5×10⁷  6.6×10⁷  88％

实施例5：分离脐带血

试剂盒组成如下：

1号液：稀释剂：0.9％氯化钠注射液(即生理盐水)市售。

2号液：沉淀剂：甲基纤维素(进口)1克，加入到500毫升4℃生理盐水中，摇匀。即得0.2％甲基纤维素。

3号液：分层液：将聚蔗糖与泛影葡胺配制成比重为1.074的分层液。

将上述2号液经过10磅、10分钟灭菌，检测其内毒素含量≤0.5EU/ml，装瓶，4℃保存。3号液经过10磅、10分钟灭菌，检测其内毒素含量≤5EU/ml，装瓶。

利用上述试剂盒对细胞处理方法：将含有枸橼酸钠抗凝液的人类脐带血100ml加入到含有100ml的试剂1号液中，再加入100ml试剂2号液中，摇匀3分钟，放置30分钟，待分层后吸取上层细胞液，分装至50ml离心管中，以1500转离心5分钟，搜集下层细胞液，用生理盐水稀释后铺在试剂3液上，以2000转离心20分钟，收集中间干细胞层后，用生理盐水清洗3次，再用生理盐水稀释至临床使用体积即得。

表5：实施例5中分离出的干细胞回收率

  编号  分离前CD₃₄  分离后CD₃₄  回收率  1  4.4×10⁷  3.7×10⁷  84％  2  5.1×10⁷  4.3×10⁷  84％  3  6.7×10⁷  5.8×10⁷  87％