猪支原体肺炎与猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清1型基因工程株疫苗及应用

摘要

本发明属于家畜传染病技术领域，与细菌基因工程技术领域有关。具体涉及一种重组猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型与猪支原体肺炎双价基因工程株的构建、疫苗制备及应用。本发明的特征是，构建了一株重组猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)血清1型弱毒株SLW05，该重组株保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M209068，它是在猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型弱毒株SLW03的染色体中插入猪支原体肺炎抗原性P36基因片段，所述的P36基因片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。本发明还公开利用重组株制备的二价基因工程疫苗及其应用。

说明书

技术领域

本发明属于家畜传染病技术领域，与细菌基因工程技术领域有关。具体涉及一种重组猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型与猪支原体肺炎双价基因工程株的构建、疫苗制备及应用。

背景技术

胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，简称App)旧称胸膜肺炎嗜血杆菌(Haemophiluspleuropneumoniae，HP)，能引起各年龄阶段的猪发生急慢性感染。胸膜肺炎放线杆菌，属于巴氏杆菌科(Pasteurellaceae)、放线杆菌属(Actinobacillus)，是一种革兰氏阴性小球杆菌，有荚膜和菌毛，不形成芽孢，能产生毒素，最近研究发现该菌还有鞭毛。根据APP生长对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide Adenine Dinucleotide，NAD，又称V因子)的依赖性，把APP分为生物I型和生物II型两个生物型。生物I型菌株的生长依赖NAD，而生物I型菌株的生长不依赖NAD，但需要其它特定嘌呤或嘌呤前产物以辅助生长(Nielsen R，Andresen L O，Plambeck T，Nielsen J P，Krarup L T，JorsalS E.Serological characterization of Actinobacillus pleuropneumoniae biotype 2 strains isolatedfrom pigs in two Danish herds.Vet Microbiol，1997，54(1)：35-46)。

胸膜肺炎放线杆菌主要抗原是荚膜多糖、脂多糖、外膜蛋白、溶血素、粘附素等抗原(王春来等，2001)。同时，APP的是一种多毒力因子病原，其毒力因子很多。现已发现与APP的致病性有关的毒力因子包括荚膜多糖(CP)、脂多糖(LPS)、外膜蛋白(OMP)、转铁结合蛋白(TBP)、溶血外毒素(Apx)、蛋白酶、渗透因子、黏附因子、菌毛、尿素酶以及细菌对转铁蛋白携带铁的利用能力等。

猪支原体肺炎(Macoplasmal pneumoniae of swine，MPS)是由猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)引起的一种长期危害养猪业的慢性、接触性传染病，并广泛分布于世界各国(J.Vicca等，Evaluation of Virulence of Mycoplasma hyopneumoniae Field Isolation[J].VeterinaryMicrobilogy，97(2003)：177-190.A.D.Leman，Diseases of Swine，Eighth ed.Iowa State UniversityPress，Ames，Iowa，U.S.A.1999.)。同一猪群的发病率高达100％，特别是在高密度饲养的规模化猪场，一旦爆发该病就难以控制，造成严重的经济损失(Ross.R.F.Mycoplasmal disease，In.Straw，B.E.，Proceedingsof the Eighth Diseases of Swine[J].Iowa State University Press，Ames，IA，1999，p：495-510.TungdaHsu等，Molecular analysis of the P97 cilium adhesin operon of Mycoplasmahyopneumoniae[J].Gene，1998，214：13-23.)。无论是由Mhp和APP单独感染或混合感染均是引起目前呼吸道综合症的主要原因之一，给养猪业造成严重的危害(Kobisch，M.，1993.Pathologie pulmonaire duporcine modele experimental associant Mycoplasma hyopneumoniae and Actinobacilluspleuropneumoniae；Gottschalk，M.，Taylor，T.，2006.Actinobacillus pleuropneumoniae.In Straw，B.E.，Zimmerman，J.J.，D’Allaire，S.，Taylor，D.J.(Eds.)，Diseases of Swine)。

Lannet和Bornfors(1957)发现，患过MPS的猪康复后具有坚强的免疫力，这就意味这可以通过免疫接种来预防该病。因此，通过免疫接种防制MPS无疑是一种较为合理有效的途径。目前预防猪支原体肺炎多采用灭活苗、亚单位疫苗和弱毒疫苗，在控制该病中发挥了积极的作用；预防猪传染性胸膜肺炎的商品化疫苗主要是传统细菌灭活疫苗和亚单位疫苗，灭活疫苗可以诱导产生免疫反应，但不能保护动物免受APP的再次攻击和阻止慢性胸膜肺炎的发生；亚单位疫苗虽然具有较好的免疫效果，但由于与本病的免疫保护相关的蛋白较多，而亚单位疫苗仅含单一或几种免疫原，因而免疫保护力也十分有限。猪传染性胸膜肺炎弱毒疫苗是一种新型疫苗，它可以激发良好的体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫，具有良好的抗体反应和不同血清型菌感染的交叉保护，而且使用方便、成本低，是当前国内外研究的热点(Prideaux C T等，Vaccination and protection of pigs against pleuropneumonia with a vaccine strain ofActinobacillus pleuropneumoniae produced by site-specific mutagenesis of the ApxII operon.Infect Immun，1999，67(4)：1962-1966.Tonpitak W等，Construction of an Actinobacilluspleuropneumoniae serotype 2 prototype live negative-marker vaccine.Infect Immun，2002，70(12)：7120-7125.Liwen L等，Construction and immunogencity of a ΔapxIC/ΔapxIIC double mutant ofActinobacillus pleuropneumoniae serovarl.Micobiological Societies.2007，274(1)：55-62.JinlinL等，Potentialuse an Actinobacillus pleuropneumoniaedouble mutant Strain apxIIC apxIVA as livevaccine that allows serological differentiation between vaccinated and infected animals.Vaccine.2007，25(44)：7696-7705.)。

针对临床中这两种病原同时感染或继发感染的现状，而分别接种单独的疫苗会造成猪只的应激和养殖成本增加，以致弱的胸膜肺炎放线杆菌表达MHP主要抗原蛋白的突变株，并研制有效的基因工程疫苗，是预防这两种呼吸道传染病的策略。目前除了药物应用和改善饲养管理条件外，疫苗的免疫接种是全球养猪业预防这两种疾病主要采取的措施。单一针对PCP和MPS的疫苗，防治效果较好，但需要多次免疫接种，研究可以一针防多病的二价甚至多价基因工程疫苗势在必行。

发明内容

本发明目的是克服现有技术的缺陷，制备一种重组猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型与猪支原体肺炎双价基因工程株、利用构建的双价基因工程株制备猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型与猪支原体肺炎双价基因疫苗及应用

本发明通过以下技术方案实施：

申请人构建了一种猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)血清1型弱毒株的试验编号为SLW05(APPapxIC^-/apxIIC^-/UreBC^-/P36⁺)，该重组弱毒株于2009年4月10日送交中国湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，该被保藏的弱毒株的分类命名及编号为(Actinobacillus pleuropneumoniae)SLW05，其保藏编号为CCTCC NO：M209068，该弱毒株是在胸膜肺炎放线杆菌血清1型弱毒株SLW03染色体中插入猪支原体肺炎抗原性基因片段，其基因片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

本发明的一种猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型弱毒菌株SLW05，其基因工程菌株衍生于本申请人申请日前已经公开报道的胸膜肺炎放线杆菌血清1型双基因缺失株SLW03(Liwen L，Weicheng B，Yonggang S，etal.Construction and immunogencity of a ΔapxIC/ΔapxIIC double mutant of Actinobacilluspleuropneumoniae serovarl.Micobiological Societies.2007，274(1)：55-62.)。所述的重组猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型弱毒株SLW05是在缺失胸膜肺炎放线杆菌血清1型两个主要毒力基因激活因子apxIC、apxIIC基础上，插入猪肺炎支原体P36免疫原性蛋白于脲酶染色体中，并缺失1889bp脲酶结构基因。该弱毒株SLW05不再具有细胞毒性和溶血活性，因而具有很高的安全性。同时突变菌株除了能表达无毒性的ApxIA和ApxIIA蛋白外，还能表达猪肺炎支原体的免疫原性蛋白，而且具有很好的免疫保护猪传染性胸膜肺炎和猪支原体肺炎两种传染病的能力。

本发明的步骤如下：

1、以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌弱毒菌株SLW03脲酶结构基因(参照GenBank登录号为U89957的基因序列)为靶基因来构建同源臂，分别扩增518bp的片段来构建同源上臂，扩增770bp的片段来构建同源下臂。分别把同源臂与自杀性质粒pEMOC2(美国Princeton University Dr.Greg Smith教授惠赠)连接构建中间转移质粒pEIU(附见图1所示)。在构建的过程中首先选取Sal I和Not I双酶切位点把同源下臂插入，然后再用Sma I和Sal I双酶切把同源上臂插入，最终构建中间转移质粒pEIU。

2、中间转移质粒pUCN36的构建：扩增强启动子序列Ner(参照GenBank登录号为AJ391256的基因序列)，连接到克隆载体pUC18(购自大连宝生物工程有限公司)的EcoRI和Kpn I多克隆位点的，经限制性酶切位点EcoRI和Kpn I酶切鉴定无误后，将支原体的免疫原性基因乳酸脱氢酶P36连接到含有Ner强启动序列的克隆载体pUC18的Kpn I和Sal I多克隆位点，经酶切鉴定无误后最终命名中间转移质粒为pUCN36(附见图2所示)。

3、中间转移质粒pEUN36的构建：把中间转移质粒pEIU用Sal I单酶切并去磷酸化后回收，中间转移质粒pUCN36用Xho I和Sal I双酶切后回收小的片段。再用T4链接酶对回收的片段进行连接，经酶切鉴定无误后命名中间转移质粒为pEUN36(附见图3所示)。

4、重组大肠杆菌X7213/pEUN36的构建：将步骤3所述的中间转移质粒pEUN36转化至大肠杆菌X7213(由美国华盛顿大学Dr.Roy Curtiss III教授惠赠；Edwards，R.A.，L.H.Keller，and D.M.Schifferli.1998.Improved allelic exchange vectors and their use to analyze 987P fimbria gene expression.Gene 207：149-157)感受态细胞，经氯霉素抗性筛选和PCR方法检测得到阳性克隆菌株。

5、用结合转移的方法获得单交换的重组菌：将步骤4获得的阳性大肠杆菌和胸膜肺炎放线杆菌1型弱毒菌(SLW03)分别培养过夜，收集菌体用无菌磷酸缓冲液(PBS，购自Invitrogen公司)洗两遍，调整菌体浓度至OD₆₀₀为0.8。各取100μl菌悬液混合，将无菌硝酸纤维滤膜贴于含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide Adenine Dinucleotide，NAD，又称V因子，购自中国上海化学试剂公司)和DAP(2，6-二氨基庚二酸，购自Sigma公司)的TSA(即胰蛋白大豆琼脂培养基，购自美国GIBCO公司，以该培养基为基本成分，附加按体积比为1％的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和10％的小牛血清)固体平板上，将混合菌液滴于滤膜上，37℃培养过夜，同时做供体和受体对照。洗下滤膜上菌液，无菌PBS洗两遍，涂布含TSA、氯霉素的TSA平皿，弱毒菌SLW03和大肠杆菌X7213不能生长，重组菌SLW05(APPapxIC^-/apxIIC^-/UreBC^-/P36⁺)能生长。

6、用SacB负向筛选和氯霉素抗性筛选进一步获得无抗性标记的重组菌：对步骤(5)所获得的重组菌进一步进行SacB负向筛选和氯霉素(氯霉素即Cm，购自Invitrogen公司)抗性敏感筛选(参照：Tonpitak W等，Construction of an Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 2 prototype live negative-markervaccine.Infect Immun，2002，70(12)：7120-7125.)，经PCR验证含有猪支原体肺炎的免疫原性基因和脲酶基因的缺失后，获得无抗性标记的突变株SLW05(APPapxIC^-/apxIIC^-/UreBC^-/P36⁺)。

7、稳定性试验：将步骤(6)获得无抗性标记的突变株SLW05连续传代培养20代，经PCR方法验证获得稳定的突变株。

8、动物安全试验：将5.8×10⁸CFU/ml、5.8×10⁷CFU/ml、5.8×10⁶CFU/ml、5.8×10⁵CFU/ml的亲本弱毒菌株SLW03和表达猪肺炎支原体P36基因的重组猪传染性胸膜肺炎放线杆菌弱毒菌株SLW05(APPapxIC^-/apxIIC^-/UreBC^-/P36⁺)分别腹腔接种8只5-6周龄的Balb/C小鼠，分别记录死亡时间和数量，连续记录一个星期。

9、动物保护性试验：根据8所得的试验结果用1.8×10⁷CFU/ml的不含抗性标记的表达猪肺炎支原体P36基因(参照GenBank登录号为X67286的基因序列)的重组猪传染性胸膜肺炎放线杆菌弱毒菌株SLW05免疫6周龄的Balb/C小鼠，设猪肺炎支原体弱毒疫苗免疫对照组和TSB(即胰蛋白大豆琼脂培养基，购自美国GIBCO公司，以该培养基为基本成分，附加按体积比为1％的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和10％的小牛血清)空白免疫对照组，检测支原体肺炎和特异的P36抗体水平。

本发明的有益效果：

1、本发明的有益效果之一是利用胸膜肺炎放线杆菌作为活疫苗载体。本发明是以App血清1型弱毒株(SLW03)作为载体，亦是细菌载体的一种，而细菌疫苗载体具有以下几个优点：①它的生产相对低廉，不论在发达国家还是发展中国家都适用于在大范围内免疫接种；②细菌载体疫苗大多数是对抗生素敏感的，如果在免疫接种时出现其他意想不到的急性反应时，可以利用抗生素加以控制；③可以通过口服和鼻饲接种，方法简便易行；④可以携带较大的基因片段，易于构建多价疫苗；⑤具有免疫佐剂的作用，不仅可以刺激机体的全身免疫，而且可以刺激机体的黏膜免疫；⑥诱导作用位点比较明确，比较安全可靠。

2、本发明的有益效果之二是生物安全性高。本发明是采用将带有强启动子序列的P36基因插入到脲酶结构基因中，构建含抗生素标记和负向筛选标记的中间转移载体pEUN36。将pEUN36转化大肠杆菌X7213感受态细胞，再与胸膜肺炎1型弱毒菌株SLW03进行接合转移试验，通过同源重组，利用营养缺陷筛选法和负向筛选法，获得P36基因插入脲酶基因的APP突变株SLW05(APPapxIC^-/apxIIC^-/UreBC^-/P36⁺)，该突变株不含抗生素抗性基因。

3、本发明的有益效果之三是提供猪传染性胸膜肺炎和猪支原体肺炎的双价基因工程疫苗株。目前我国猪肺炎支原体和胸膜肺炎放线杆菌单独感染或混合感染是引起目前呼吸道综合症的主要原因之一，给养猪业造成严重的危害。而目前针对临床中这两种病原同时感染或继发感染的现状，而分别接种单独的疫苗会造成猪只的应激和养殖成本增加，以致弱的胸膜肺炎放线杆菌表达MHP主要抗原蛋白的突变株，并研制有效的基因工程疫苗，是预防这两种呼吸道传染病的策略。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明的猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)血清1型弱毒株SLW03染色体中插入的猪支原体肺炎抗原性基因的核苷酸序列。

图1：显示了用于构建猪支原体肺炎与胸膜肺炎放线杆菌中间转移质粒pEIU物理图谱及构建流程图。

图2：显示了用于构建猪支原体肺炎与胸膜肺炎放线杆菌中间转移质粒pUCN36物理图谱及构建流程图。

图3：显示了用于构建猪支原体肺炎与胸膜肺炎放线杆菌中间转移质粒pEUN36物理图谱及构建流程图。

图4：同源臂脲酶基因扩增片段(P5/P6，P7/P8)，图中M：DNA marker(DL2,000)；1为Ure下臂；2为Ure上臂；3为阴性对照；

图5：P36基因扩增片段(P3/P4)，图中M：DNA marker(DL2,000)；1为P36基因；2为阴性对照；

图6：Pner基因的扩增片段图(P1/P2)；图中M：DNA marker(DL2,000)；1为Pner基因；2为阴性对照；

图7：转移质粒pEIU和pUNC36的酶切鉴定图，图中M1：DNA marker(DL 15,000)；M2：DNAmarker(DL2,000)；1：pEIU/SmaI+NotI；2：pEIU/NotI+SalI；3：pEIU/SalI+SmaI；4：pUNC36/XhoI+SalI；5：pUNC36/KpnI+SalI；6：pUNC36/XhoI+KpnI。

图8：转移质粒pEUN36的酶切鉴定图，图中M1：DNAmarker(DL 15,000)；M2：DNAmarker(DL 2,000)；1：pEUN36/NotI+SmaI；2：pEUN36/SmaI+SalI。

图9：不含抗性标记的传染性胸膜肺炎弱毒菌株SLW05UreBC基因缺失突变菌株的PCR鉴定图(P9/P10)，图中M1：DNA marker(DL 2,000)；1为重组菌株；2为亲本菌株SLW03对照。

图10：不含抗性标记的表达猪肺炎支原体P36基因的重组猪传染性胸膜肺炎放线杆菌弱毒菌株SLW05的遗传稳定性实验结果。图示为重组菌中P36基因片段的PCR鉴定结果，图中M：DNA marker(DL 2,000)；1为亲本菌株SLW03即对照；2-11为1-20代重组菌株

图11：是用SDS-PAGE方法检测P36基因的表达，图中M为蛋白质marker；1为亲本菌株SLW03对照；2为重组菌株SLW05；3为原核表达P36对照；箭头所示为融合表达蛋白P36。

图12：是用Western-blot方法检测P36基因的表达，图中1为重组菌株SLW05；2为亲本菌株SLW03即对照。

图13：检测不含抗性标记的表达猪肺炎支原体P36基因的重组猪传染性胸膜肺炎放线杆菌弱毒菌株SLW05不同培养时间P36基因表达量的Western-blot分析结果。图中M为蛋白质marker；1-4分别是取3h、5h、7h、9h培养后的菌体；5为亲本菌株SLW03即对照。

图14：是不含抗性标记的表达猪肺炎支原体P36基因的重组猪传染性胸膜肺炎放线杆菌弱毒菌株SLW05和亲本菌株SLW03生长曲线的比较图。

图15：是购自宝生物工程(大连)有限公司的pMID-18T质粒图谱。

图16：是质粒pMD-18T-P36酶切图谱，图中M：DNA marker(DL2,000)和DNA marker(DL15,000)；1，2：pMD-18T-P36/BamHI+HindIII。

图17：是购自宝生物工程(大连)有限公司的pGEX-KG质粒图谱。

图18：是质粒pGEX-KG-P36酶切鉴定图，图中M：DNA marker(DL15,000)和DNA marker(DL2,000)；1，2：pGEX-KG-P36/BamHI+HindIII。

具体实施方式

实施例1构建中间转移质粒

1.引物的设计(用于表1所示基因克隆和分子检测)

表1：PCR引物

表中引物序列中下划线部分是对应的酶切位点，P36基因设计的引物序列后面下划线的分别是酶切位点和核糖体结合位点，表1的引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

2.脲酶基因同源臂、强启动子序列和P36基因的扩增

用APP血清1型弱毒菌(SLW03)的基因组为模板用引物对P5和P6、P7和P8分别扩增上下同源臂。PCR扩增反应体系为：10×Taq Buffer5.0μl(含mg²⁺)，2.5mmol/L dNTPs 4μl，20μmol/L上、下游引物各1.0μl，DMSO 5.0ul、TaqDNA聚合酶0.5μl，模板2μl，无菌双蒸水加至50μl。PCR反应条件：94℃变性4min，进入30个循环(94℃变性45sec，58复性45sec，72℃延伸1min)，最后72℃延伸10min。扩增的PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳分析，一条大小518bp带为同源上臂，一条大小为770bp带为同源下臂。

以含有Ner强启动子序列的质粒pMIDG301(由英国Imperial university Dr.Langford PR教授惠赠)为模板，用引物对P1和P2扩增强启动子序列。PCR扩增反应体系为：10×Taq Buffer5.0μl(含mg²⁺)，2.5mmol/LdNTPs 4μl，20μmol/L上、下游引物各1.0μl，DMSO 5.0ul、PrimerSTAR HS DNA聚合酶1.0μl，模板2μl，无菌双蒸水加至50μl。PCR反应条件：94℃变性4min，进入30个循环(98℃变性15sec，57复性30sec，72℃延伸1min)，最后72℃延伸10min。扩增的PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳分析，一条大小351bp带为Ner强启动。

用猪支原体肺炎活疫苗(购自南京天邦生物科技有限公司。批准文号：兽药生字(2006)100991026，网址：http://home.njtb.com/Article/cpsj/cpsj/200608/214.html)的基因组为模板用引物对P3和P4扩增免疫原性P36基因，PCR扩增反应体系为：10×Taq Buffer5.0μl(含mg²⁺)，2.5mmol/L dNTPs 4μl，20μmol/L上、下游引物各1.0μl，DMSO 5.0ul、TaqDNA聚合酶0.5μl，模板2μl，无菌双蒸水加至50μl。PCR反应条件：94℃变性4min，进入30个循环(94℃变性45sec，58复性45sec，72℃延伸1min)，最后72℃延伸10min。扩增的PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳分析，一条大小948bp带为P36。

实施例2中间转移质粒pEIU、pUCN36和pEUN36构建

将PCR产物进行回收纯化后，用Sal I和Not I双酶切同源右臂和pEMOC2载体，回收纯化后连接，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆子，小量提取质粒，用限制内切酶对重组质粒进行酶切鉴定，经0.8％琼脂糖凝胶电泳，证实其大小与预期符合；再用Sma I和Sal I双酶切同源左臂和含有同源右臂的pEMOC2，回收纯化后连接，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆子，小量提取质粒，用限制内切酶对重组质粒进行酶切鉴定，经0.8％琼脂糖凝胶电泳，证实其大小与预期符合；经测序证实同源右臂和同源左臂的无碱基误配，该重组质粒被命名为pEIU。

将PCR产物进行回收纯化后，用EcoR I和Kpn I双酶切Ner强启动子序列和pUC18载体并连接，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆子，小量提取质粒，用限制内切酶对重组质粒进行酶切鉴定，经0.8％琼脂糖凝胶电泳，证实其大小与预期符合；再用Kpn I和Sal I双酶切P36和含有Ner序列的pUC18载体，回收纯化后连接，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆子，小量提取质粒，用限制内切酶对重组质粒进行酶切鉴定，经0.8％琼脂糖凝胶电泳，证实其大小与预期符合；经测序证实无碱基误配，该重组质粒命名为pUCN36。

对中间转移质粒pEIU用SalI单酶切并去磷酸化后回收纯化，中间转移质粒pUCN36用Xho I和SalI双酶切后回收纯化小的片段。再用T4链接酶对回收的片段进行连接，转化大肠杆菌X7213，筛选阳性克隆子，小量提取质粒，用限制性酶切对重组质粒进行酶切鉴定，经0.8％琼脂糖凝胶电泳，证实其大小与预期符合，将该重组质粒命名为pEUN36。

实施例3接合转移

将构建的重组质粒pEUN36采用热激法(黄培堂等译.萨姆布鲁克J，拉塞尔D W著.分子克隆实验指南(第三版)，北京：科学出版社，2002)转化大肠杆菌X7213，获得的阳性大肠杆菌和胸膜肺炎放线杆菌1型弱毒菌株SLW03亲本菌株分别培养过夜，收集菌体用无菌PBS洗两遍，调整菌浓度至OD₆₀₀为0.8。各取100μl菌悬液混合，将无菌硝酸纤维滤膜贴于含NAD和DAP的TSA固体平板上，将混合菌液滴于滤膜上，37℃培养过夜，同时做供体和受体对照。洗下滤膜上菌液，无菌PBS洗两遍，涂布含TSA、Cm的TSA平皿，SLW03亲本株和大肠杆菌X7213不能生长，重组菌能生长；将重组菌进一步进行SacB负向筛选，和氯霉素抗性敏感筛选(参照：Tonpitak W等，Construction of an Actinobacillus pleuropneumoniae serotype2 prototype live negative-marker vaccine.Infect Immun，2002，70(12)：7120-7125.)，获得无抗性标记的重组突变株SLW05。

实施例4重组突变株的鉴定

提取不含抗性标记的表达猪肺炎支原体P36基因的重组猪传染性胸膜肺炎放线杆菌弱毒菌株SLW05(APPapxIC^-/apxIIC^-/UreBC^-/P36⁺)基因组，以该基因组为模板，用引物对P3/P4扩增，观察是否出现预期的948bp条带；同时用引物对P9/P10扩增，进行PCR扩增鉴定突变株脲酶基因缺失片段。PCR扩增反应体系为：10×Taq Buffer5.0μl(含mg²⁺)，2.5mmol/L dNTPs 4μl，20μmol/L上、下游引物各1.0μl，DMSO 5.0ul、TaqDNA聚合酶0.5μl，模板2μl，无菌双蒸水加至50μl。PCR反应条件：94℃变性4min，进入30个循环(94℃变性45sec，57复性45sec，72℃延伸2min)，最后72℃延伸10min。经0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测看是否出现预期的1889bp大小的条带。其鉴定结果中含有948bp大小的条带，而无1889bp大小条带的菌株为突变株。

实施例5表达P36基因片段的重组菌株SLW05的生物学特性

1、P36基因片段大肠杆菌表达产物豚鼠抗血清的制备

用EcoR I和Hind III双酶切质粒pMD18-P36(见图15，16)中的P36片段和pGEX-KG(购自宝生物工程(大连)公司，见图17)，回收纯化后用T₄ DNA ligase连接，转化大肠杆菌DH5。感受态细菌，37℃在固体LB平板上培养12h，挑菌小量制备质粒从而获得表达质粒pGEX-KG-P36(酶切鉴定见图18)。将pGEX-KG-P36质粒进行序列测定，证实克隆正确后，转化大肠杆菌BL21(购自宝生物工程(大连)有限公司)，在含有氨苄青霉素(Amp，终浓度50μg/mL)固体LB平板上挑取阳性转化子到液体LB培养基，37℃、200r/min培养至对数生长期(吸光值OD₆₀₀＝0.6～1.0)加入IPTG(终浓度1mM)进行诱导表达4h，使用GST融合蛋白提取试剂盒Glutathione Sepharose 4B Kit(购自美国Qiagen公司)，对表达产物进行纯化，获得浓度为171μg/mL的融合表达蛋白，命名为GST-P36。将100μg表达产物GST-P36与等体积弗氏完全佐剂(购自美国Sigma公司)均匀混合，皮下注射豚鼠(购自湖北省预防医学科学院实验动物中心)，分别在2周(二免)后加强免疫1次(使用弗氏不完全佐剂，购自美国Sigma公司)。在2免后14d采血，提取血清，0.22μm滤膜过滤除菌，置-20℃备用。

2、SLW05(APPapxIC^-/apxIIC^-/UreBC^-/P36⁺)重组菌株的表达特性分析

挑取重组菌株SLW05(APPapxIC^-/apxIIC^-/UreBC^-/P36⁺)的单菌落在TSB液体培养基中，37℃、200r/min培养16h，8,000r/min离心收集菌体，进行聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，并使用鼠抗GST-P36血清进行Western-blotting分析。结果表明SLW05(APPapxIC^-/apxIIC^-/UreBC^-/P36⁺)能表达大小为36kDa左右的重组蛋白，且表达的重组蛋白具有良好的免疫学反应原性(见图12)。

3、SLW05(APPapxIC^-/apxIIC^-/UreBC^-/P36⁺)重组菌株的脲酶活性的鉴定

将SLW05(APPapxIC^-/apxIIC^-/UreBC^-/P36⁺)重组菌株与亲本株SLW03(APPapxIC^-/apxIIC^-)接种含NAD的TSB培养基，然后用脲素检测试剂盒(购自美国Sigma公司，按照该试剂盒的说明书操作)，结果表明重组菌株SLW05检测结果为阴性，而亲本菌株SLW03为阳性，证明成功构建了脲酶缺失突变株。

4、SLW05(APPapxIC^-/apxIIC^-/UreBC^-/P36⁺)重组菌株的生长特性分析

通过对亲本菌SLW03和重组突变株SLW05的生长曲线比较(如图14)。将过夜培养的亲本菌株SLW03和不含抗性标记的表达猪肺炎支原体P36基因的重组猪传染性胸膜肺炎放线杆菌弱毒菌株SLW05分别以1∶1000比例接种到100ml TSB培养基，接种后每隔1.5小时取样，共取6次，测定活菌数，比较两株菌增长能力。发现它们的生长速度并没有很大差别，说明重组突变株SLW05在体外的生长能力并没有受到显著影响。

5、SLW05(APPapxIC^-/apxIIC^-/UreBC^-/P36⁺)重组菌株的遗传稳定性试验

将本发明制备的SLW05(APPapxIC^-/apxIIC^-/UreBC^-/P36⁺)重组菌株在TSA固体平板上划线培养，挑取单菌落到TSB培养基中，37℃、200r/min培养16h，按体积1∶1,000的比例转接到TSB培养基中培养12h，再次按体积1∶1,000的比例转接到TSB液体培养基中，连续进行10次转接。用引物P3/P4进行PCR扩增，扩增P36在重组菌中的遗传情况见图10。图10表明，每次扩增结果均无可见差别，表明本发明制备的SLW05重组菌株能够稳定遗传。

实施例6Western blot分析

收集不含抗性标记的表达猪肺炎支原体P36基因的重组猪传染性胸膜肺炎放线杆菌弱毒菌株SLW05的菌体，经煮沸变性后跑SDS-PAGE，并设P36蛋白对照和亲本菌株SLW03对照。

(1)转膜：当SDS-PAGE电泳结束后，采用半干转移法转印硝酸纤维素膜，转膜时间一般2h。转膜结束后，丽春红染色至膜上出现蛋白带，用软铅笔标出作为分子量标准的参照蛋白的位置，然后用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，其间换水数次。

(2)封闭：把硝酸纤维素滤膜放入可加热封接的杂交袋中，以滤膜面积0.1~0.15mL/cm²的量加入封闭液(含1％牛血清白蛋白即BSA的TBST)，尽可能排除气泡后密闭袋口，平放于摇床上室温温育0.5-1h。

(3)与一抗接合：将硝酸纤维素膜转移到新的杂交袋中，按0.1~0.15mL/cm²的量，分别加入用TBST稀释的鼠抗P36血清(作为一抗，多抗体积比为1∶100)，排除气泡后密封，平放于摇床上室温温育1h。TBST洗3遍，每次5~10min。

(4)与二抗接合：将滤膜转移到新的杂交袋中，按0.1~0.15ml/cm²的量加入用TBST以体积比为1∶2500(DAB为底物)稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，室温温育0.5~1h。TBST洗3遍，每次5~10min。再用TBS洗2遍，每次5~10min。

(5)显色：以DAB为底物，则将硝酸纤维素滤膜放入10mL底物液中，显色1~15min，一旦出现蛋白带，立即用去离子水终止，照相。

实施例8动物安全性试验

将5.8×10⁸CFU/ml、5.8×10⁷CFU/ml、5.8×10⁶CFU/ml、5.8×10⁵CFU/ml的亲本菌株SLW03(APPapxIC^-/apxIIC^-)和不含抗性标记的表达猪肺炎支原体P36基因的重组猪传染性胸膜肺炎放线杆菌弱毒菌株SLW05(APPapxIC^-/apxIIC^-/UreBC^-/P36⁺)分别腹腔接种8只Balb/C小鼠，分别记录死亡时间和数量，连续记录一个星期。试验结果见表2。

表2：本发明的重组疫苗菌株SLW05与亲本株SLW03力比较毒试验

实施例9本发明的重组菌株SLW05(APPlapxIC^-/apxIIC^-/UreBC^-/p36⁺)在小鼠体内的免疫效力检测

1、小鼠的免疫程序：

使用5-6周龄的BALB/c小鼠作为免疫效力评价，根据试验要求分为3组，分别为本发明制备的SLW05(APPapxIC^-/apxIIC^-/UreBC^-/P36⁺)重组菌株疫苗组、猪支原体肺炎活疫苗(购自南京天邦生物科技公司)组和非免疫空白对照组。免疫途径为肌肉注射0.2mL(含1.8×10⁷CFU活菌量)细菌液或TSB培养基，14天后加强免疫1次。分别于免疫前0天、首免后14天、28天检测猪肺炎支原体血清抗体(用IDEXX公司的MHP抗体检测试剂盒)。同时以实施例5中制备的GST融合表达产物GST-P36为抗原(256ng/孔)包被ELISA板，按间接ELISA方法(参照柳忠辉等，免疫学常用实验技术，北京：科学出版社，2002)检测P36基因重组蛋白抗体水平。

2、免疫小鼠体液免疫抗体水平检测

小鼠免疫前采血，第二、三次采血分别在首免后14、28天进行，每组选取10只经尾静脉负压采血，分离血清，分别检测抗猪肺炎支原体血清抗体、P36特异性抗体效价，取平均值。结果见表3。从表3中可以看出，首免后第2周本发明的SLW05(APPapxIC^-/apxIIC^-/UreBC^-/P36⁺)重组菌疫苗组和猪支原体肺炎活疫苗(购自南京天邦生物科技公司)组猪肺炎支原体抗体均为1∶20和1∶160，二免2周后(即首免后28天)，本发明的SLW05(APPapxIC^-/apxIIC^-/UreBC^-/P36⁺)重组菌疫苗组和猪支原体肺炎活疫苗(购自南京天邦生物科技公司)组猪肺炎支原体抗体升至1∶40和高于1∶1280。首免2周本发明的SLW05(APPapxIC^-/apxIIC^-/UreBC^-/P36⁺)重组菌疫苗组和猪支原体肺炎活疫苗(购自南京天邦生物科技公司)组P36特异性抗体效价为1∶160和1∶320，二免后2周，本发明的SLW05(APPapxIC^-/apxIIC^-/UreBC^-/P36⁺)重组菌疫苗组和猪支原体肺炎活疫苗(购自南京天邦生物科技公司)组P36特异性抗体效价分别上升为1∶320和1∶640。而同步进行的PBS对照均为阴性(＜1∶10、＜1∶20)。二免后2周(即首免后4周)，本发明制备的SLW05(APPapxIC^-/apxIIC^-/UreBC^-/P36⁺)重组菌疫苗组和猪支原体肺炎活疫苗(购自南京天邦生物科技公司)组产生的ELISA抗体均有一定程度的上升，虽然本发明制备的SLW05重组菌与猪支原体肺炎活疫苗(购自南京天邦生物科技公司)组相比，猪肺炎支原体的抗体和P36特异抗体效价都相对偏低，但是本发明制备的SLW05(APPapxIC^-/apxIIC^-/UreBC^-/P36⁺)重组菌疫苗组均能产生猪肺炎支原体和P36特异性抗体，抗体效价平均水平分别为1∶40和1∶320，PBS对照组抗体检测仍为阴性(＜1∶10、＜1∶20)。上述结果表明本发明制备的SLW05(APPapxIC^-/apxIIC^-/UreBC^-/P36⁺)重组菌疫苗免疫小鼠后能诱导机体产生特异性的抗猪肺炎支原体的体液免疫应答。

表3本发明制备的重组菌SLW05(APPapxIC^-/apxIIC^-/UreBC^-/P36⁺)疫苗免疫小鼠血清抗体检测(ELISA法)

尽管本发明的内容是结合本实施例进行说明，但是不能认为是对本发明范围的限制，本发明的范围由所附权利要求书限定。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样落在本发明范围内。

序列表

<110>华中农业大学

<120>猪支原体肺炎与猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清1型基因工程株疫苗及应用

<130>

<141>2009-04-13

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1394

<212>DNA

<213>Mycoplasma hyopneumoniae

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1394)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(327)..(1274)

<223>

<400>1

gttaacacgc caccaggaat tgatctaaaa aaattagaac taaataatgt cgatggttat     60

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                             1               5

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Gly Ala Gly Asn Val Gly Asn Ser Phe Leu Tyr Ala Ala Met Asn Gln

10                  15                  20                  25

gga ctt gca tcc gag tat gga att att gat att aat cct gat ttt gcc      449

Gly Leu Ala Ser Glu Tyr Gly Ile Ile Asp Ile Asn Pro Asp Phe Ala

                30                  35                  40

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Asp Gly Asn Ala Phe Asp Phe Glu Asp Ala Ser Ala Ser Leu Pro Phe

            45                  50                  55

ccg att agt gtc tcc cgt tat gaa tat aaa gat cta aaa gat gct gat    545

Pro Ile Ser Val Ser Arg Tyr Glu Tyr Lys Asp Leu Lys Asp Ala Asp

        60                  65                  70

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Phe Ile Val Ile Thr Ala Gly Arg Pro Gln Lys Pro Gly Glu Thr Arg

    75                  80                  85

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Leu Glu Leu Val Ala Asp Asn Ile Arg Ile Ile Arg Glu Ile Ala Leu

90                  95                  100                 105

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Lys Val Lys Glu Ser Gly Phe Ser Gly Ile Ser Ile Ile Val Ala Asn

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Pro Val Asp Ile Ile Thr Arg Ala Tyr Arg Asp Ala Ser Gly Phe Ser

            125                 130                 135

gat caa aaa gtt atc ggt agt gga act gtt tta gat aca gca agg ctt    785

Asp Gln Lys Val Ile Gly Ser Gly Thr Val Leu Asp Thr Ala Arg Leu

        140                 145                 150

caa ttt gca atc gca aaa aga gca aaa gta tcg cct aat tcg gtt cag    833

Gln Phe Ala Ile Ala Lys Arg Ala Lys Val Ser Pro Asn Ser Val Gln

    155                 160                 165

gcc tac gtg atg ggt gaa cat ggt gat tca tct ttt gtt gct tat tca    881

Ala Tyr Val Met Gly Glu His Gly Asp Ser Ser Phe Val Ala Tyr Ser

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Asn Ile Lys Ile Ala Gly Glu Cys Phe Cys Ala Tyr Ser Lys Leu Thr

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Gly Ile Asp Ser Ser Asn Tyr Glu Lys Glu Leu Glu Tyr Pro Val Ser

            205                 210                 215

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Arg Arg Ala Tyr Glu Ile Ile Asn Arg Lys Arg Ala Thr Phe Tyr Gly

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Ile Gly Ala Ala Ile Ala Lys Ile Val Ser Asn Ile Ile Lys Asp Thr

    235                 240                 245

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Lys Asn Ile Met Ile Ala Gly Ala Asn Leu Arg Gly Glu Tyr Gly Phe

250                 255                 260                 265

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His Gly Val Asn Ile Gly Val Pro Val Val Leu Gly Ala Asn Gly Ile

                270                 275                 280

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Glu Lys Ile Ile Glu Ile Ser Leu Asn Asp Lys Glu Lys Glu Lys Phe

            285                 290                 295

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Ala Lys Ser Val Ala Ile Ile Asp Lys Ile Tyr Gln Asp Ala Ile Lys

        300                 305                 310

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Asn Ile

    315

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tagcaaaaaa attgaagctt                                              1394

<210>2

<211>315

<212>PRT

<213>Mycoplasma hyopneumoniae

<400>2

Met Lys Pro Ile Lys Ile Ala Leu Ile Gly Ala Gly Asn Val Gly Asn

1               5                   10                  15

Ser Phe Leu Tyr Ala Ala Met Asn Gln Gly Leu Ala Ser Glu Tyr Gly

            20                  25                  30

Ile Ile Asp Ile Asn Pro Asp Phe Ala Asp Gly Asn Ala Phe Asp Phe

        35                  40                  45

Glu Asp Ala Ser Ala Ser Leu Pro Phe Pro Ile Ser Val Ser Arg Tyr

    50                  55                  60

Glu Tyr Lys Asp Leu Lys Asp Ala Asp Phe Ile Val Ile Thr Ala Gly

65                  70                  75                  80

Arg Pro Gln Lys Pro Gly Glu Thr Arg Leu Glu Leu Val Ala Asp Asn

                85                  90                  95

Ile Arg Ile Ile Arg Glu Ile Ala Leu Lys Val Lys Glu Ser Gly Phe

            100                 105                 110

Ser Gly Ile Ser Ile Ile Val Ala Asn Pro Val Asp Ile Ile Thr Arg

        115                 120                 125

Ala Tyr Arg Asp Ala Ser Gly Phe Ser Asp Gln Lys Val Ile Gly Ser

    130                 135                 140

Gly Thr Val Leu Asp Thr Ala Arg Leu Gln Phe Ala Ile Ala Lys Arg

145                 150                 155                 160

Ala Lys Val Ser Pro Asn Ser Val Gln Ala Tyr Val Met Gly Glu His

                165                 170                 175

Gly Asp Ser Ser Phe Val Ala Tyr Ser Asn Ile Lys Ile Ala Gly Glu

            180                 185                 190

Cys Phe Cys Ala Tyr Ser Lys Leu Thr Gly Ile Asp Ser Ser Asn Tyr

        195                 200                 205

Glu Lys Glu Leu Glu Tyr Pro Val Ser Arg Arg Ala Tyr Glu Ile Ile

    210                 215                 220

Asn Arg Lys Arg Ala Thr Phe Tyr Gly Ile Gly Ala Ala Ile Ala Lys

225                 230                 235                 240

Ile Val Ser Asn Ile Ile Lys Asp Thr Lys Asn Ile Met Ile Ala Gly

                245                 250                 255

Ala Asn Leu Arg Gly Glu Tyr Gly Phe His Gly Val Asn Ile Gly Val

            260                 265                 270

Pro Val Val Leu Gly Ala Asn Gly Ile Glu Lys Ile Ile Glu Ile Ser

        275                 280                 285

Leu Asn Asp Lys Glu Lys Glu Lys Phe Ala Lys Ser Val Ala Ile Ile

    290                 295                 300

Asp Lys Ile Tyr Gln Asp Ala Ile Lys Asn Ile

305                 310                 315