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评价牛个体的胴体重量的基因标记及使用其的胴体重量评价方法

摘要

本发明提供使用基因标记的评价牛个体的胴体重量的评价方法。确定牛NCAPG基因的e9位点的碱基,该碱基为G时,评价为胴体重量大。或者,确定牛NCAPG蛋白的E9位点的氨基酸,该氨基酸为甲硫氨酸时,评价为胴体重量大。

著录项

法律信息

  • 法律状态公告日

    法律状态信息

    法律状态

  • 2015-05-20

    未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12Q1/68 授权公告日:20120711 终止日期:20140330 申请日:20090330

    专利权的终止

  • 2012-07-11

    授权

    授权

  • 2010-01-13

    实质审查的生效

    实质审查的生效

  • 2009-11-18

    公开

    公开

说明书

技术领域

本发明涉及评价牛个体的胴体重量(carcass weight)的基因标记及使用该基因标记的胴体重量评价方法。

背景技术

牛的肉质和胴体重量是直接关系到价格的经济性状,对于怎样评价关于这些性状的遗传能力来帮助牛的改良的问题,一直以来设计并采用基于育种值的方法等。

肉质和胴体重量被认为是涉及多个基因的量的性状。如果可以确定对肉质和胴体重量有较大影响的基因或基因组区域(QTL),从而进行优良的基因型的判别,则可以将其用于牛的改良。

目前为止,报道了根据采用黑毛和种种公牛的父系半同胞家系的QTL分析,在牛6号染色体上存在影响体重或胴体重量的基因组区域(Takasuga等(2007)Mamm.Genome 18卷125-136页)。然后,在另外的黑毛和种种公牛中,在6号染色体的相同区域中确认到QTL(Setoguchi等(2006)日本动物遗传育种学会第7届大会摘要(Abstract of the 7th meeting of Japanese Society of Animal Breeding and Genetics))。另一方面,在某些褐毛和种种公牛及继承其优良的遗传性状的子代种公牛中也在与上述基本相同的区域检出了QTL。

发明内容

然而,实际上并不清楚是怎样的遗传信息承载了优良的遗传性状,因此在评价牛个体的胴体重量时,无法使用基因型等遗传信息。

于是,本发明的目的在于提供使用基因标记的评价牛个体的胴体重量的评价方法。

本发明人通过详细分析牛6号染色体上的影响体重或胴体重量的基因组区域,发现在NCAPG基因的SNP中,e9位点的SNP是6号染色体上的体重或胴体重量QTL的关键SNP或与关键SNP存在连锁不平衡的SNP,藉此,包括NCAPG基因的e9位点且e9位点的碱基为G的DNA可用作使胴体重量增加的基因标记,还发现e9位点的碱基为G的SNP为显性突变以及具有该SNP的NCAPG基因编码E9位点的氨基酸为甲硫氨酸的突变NCAPG蛋白等情况,从而完成了本发明。

于是,本发明的评价牛个体的胴体重量的评价方法的特征在于,确定NCAPG基因的e9位点的碱基或NCAPG蛋白的E9位点的氨基酸。

此外,本发明的牛NCAPG基因的e9位点为G。本发明的牛NCAPG蛋白的E9位点的氨基酸为甲硫氨酸。

此外,本发明的DNA具有包括牛NCAPG基因的e9位点的所述基因的部分或全部,该e9位点的碱基为G。

此外,本发明的评价牛个体的胴体重量的基因标记由具有包括牛NCAPG基因的e9位点的所述基因的部分或全部的DNA构成。

此外,本发明的选择胴体重量大的牛个体的选择方法包括:对于各牛个体,确定NCAPG基因的SNP中的e9位点的碱基的步骤;选择在NCAPG基因的至少一个等位基因中该碱基为G的个体的步骤。

此外,本发明的使野生型牛个体的胴体重量增加的方法的特征在于,在不进行交配的情况下,使用基因重组技术,制造在NCAPG基因的至少一个等位基因中将e9位点的碱基置换为G的牛,或者制造表达E9位点的氨基酸为甲硫氨酸的NCAPG蛋白的牛。

此外,本发明的牛具有编码E9位点的氨基酸为甲硫氨酸的NCAPG蛋白的外源性DNA。该外源性DNA可以是表达该NCAPG蛋白的表达载体。

如果采用本发明,则可以提供使用基因标记的评价牛个体的胴体重量的评价方法。

具体实施方式

以下,参照实施例,对基于上述发现而完成的本发明的实施方式进行详细说明。实施方式和实施例中没有特别说明的情况下,使用记载于以下标准试验方案集中的方法,或者对其进行改进或修改后的方法:J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis编,《分子克隆实验指南(Molecular cloning,a laboratory manual)》(第三版),冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press),冷泉港(Cold Spring Harbor),纽约(2001);F.M.Ausubel,R.Brent,R.E.Kingston,D.D.Moore,J.G.Seidman,J.A.Smith,K.Struhl编,《新编分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》,约翰威立出版有限公司(John Wiley & Sons Ltd.)等。此外,在使用市售的试剂盒和测定装置的情况下,没有特别的说明时,则使用它们所附的试验方案。

本发明的目的、特征、优点和其思路通过本说明书的记载,从业者可以了解,根据本说明书的记载,只要是从业者就可以容易地再现本发明。以下记载的发明的实施方式和具体的实施例等是本发明的优选实施方式,是为了示例或说明而例举的,本发明并不局限于这些实施方式。在本说明书中所揭示的本发明的意图及范围内,基于本说明书的记载,可以进行各种改进和修改,这一点对于从业者是可以了解的。

牛NCAPG基因的SNP

牛野生型NCAPG基因的e9位点的碱基为T,但如实施例所示,牛NCAPG基因的e9位点的碱基为G时,胴体重量增加。因此,如果确定NCAPG基因的SNP中的e9位点的碱基,则可以评价或预测胴体的重量。

在这里,e9位点是指序列编号1的牛NCAPG基因的cDNA(NM_001102376)中的第1372个碱基以及牛基因组中的NCAPG和转录产物hnRNA、NCAPG基因同源物等中与该碱基对应的所有碱基。

牛野生型NCAPG蛋白的E9位点的氨基酸为异亮氨酸,但e9位点的碱基为G的牛突变NCAPG基因编码E9位点的氨基酸为甲硫氨酸的突变NCAPG蛋白。因此,可以确定牛NCAPG蛋白的E9位点的氨基酸来代替NCAPG基因的e9位点的碱基。

在这里,E9位点是指序列编号2的牛NCAPG蛋白(NP_001095846)中的第442个氨基酸以及部分肽或NCAPG同源物等中与该氨基酸对应的所有氨基酸。

基因标记

本发明中,评价牛个体的胴体重量时的诊断标记是指用于检测牛NCAPG基因的e9位点的SNP的基因相关物质。例如,包括含NCAPG基因的DNA、作为转录物的hnRNA和mRNA、作为翻译物的多肽、作为最终产物的蛋白质等。

诊断标记为NCAPG基因等DNA的情况下,为了检测上述SNP,能够确定具有SNP的碱基即可。具体来说,可以直接确定碱基序列,也可以采用PCR或RFLP,对检测方法没有特别限定。诊断标记为作为NCAPG基因的转录产物的hnRNA或mRNA的情况下,可以通过确定RNA序列来检测SNP。直接检测这些SNP的情况下,测序的核酸不需要包括整个NCAPG基因,可以是NCAPG基因或cDNA的一部分,包括具有SNP的碱基(这里为e9位点的碱基)且能够确定该碱基即可。

诊断标记为NCAPG蛋白等肽的情况下,为了检测上述突变,可以通过常规方法直接确定具有突变的氨基酸。直接检测该突变的情况下,测序的肽不需要包括整个NCAPG蛋白,可以是NCAPG蛋白的一部分,包括具有突变的氨基酸(这里为E9位点的氨基酸)且能够确定该氨基酸即可。

SNP的判定方法

e9位点的碱基的种类以分子生物学方式确定即可,例如从牛细胞提取基因组DNA,通过常规方法确定e9位点的碱基。如果该e9位点的碱基为G的杂合型或G的纯合型,则可以作出该牛的胴体重量大的评价。

E9位点的氨基酸也例如使用抗体等从牛细胞中纯化NCAPG蛋白,通过常规方法确定氨基酸序列即可。如果该E9位点的氨基酸为甲硫氨酸,则可以作出该牛的胴体重量大的评价。

此外,使用该评价方法,可以从大量的牛中选择胴体重量大的牛个体。即,对于各牛个体,确定NCAPG基因的SNP中的e9位点的碱基,选择在至少一个等位基因中该碱基为G的个体,或者确定NCAPG蛋白的E9位点的氨基酸,选择具有至少该氨基酸为甲硫氨酸的突变NCAPG蛋白的个体,从而可以选择胴体重量大的牛个体。

在这里,NCAPG基因在牛中是高度保守的,因此作为实施本发明的对象的牛的种类为黑毛和种、褐毛和种、荷斯坦种等,没有特别限定。

SNP的人工操作

因在NCAPG基因的至少一个等位基因中e9位点的碱基为G而表达E9位点的氨基酸为甲硫氨酸的NCAPG蛋白的突变牛中,如实施例所示,胴体重量增加。该NCAPG基因中,是否有e9位点以外的突变与胴体重量的增加无关。

因此,为了使野生型牛个体的胴体重量增加,在不进行交配的情况下,使用敲除动物制造、敲减动物制造、转基因动物制造等众所周知的个体的基因重组技术,制造在NCAPG基因的至少一个等位基因中将e9位点的碱基置换为G的牛,或者制造表达E9位点的氨基酸为甲硫氨酸的NCAPG蛋白的牛即可。

目前为止,使用牛获得了胚胎干细胞(Biochem.Biophys.Res.Commun.309卷104-113页2003),也制成了敲除牛(Nat Ganet 36卷671-672页2004)。使用这样的发育工程学的基因重组技术,在牛个体中将特定的碱基置换为目标碱基也是可能的。

于是,为了使在NCAPG基因的两个等位基因中都不具有G作为e9位点的碱基的牛个体的胴体重量增加,例如制造在NCAPG基因的至少一个等位基因中将e9位点的碱基置换为G的牛即可。该情况下,该突变等位基因是显性的,因此并不需要置换两个等位基因,仅置换一方即可。

或者,如实施例所示,由于该突变是显性突变,因此通过制造牛个体中表达NCAPG蛋白的E9位点的氨基酸为甲硫氨酸的突变蛋白的牛,也可以制造胴体重量增加的牛个体。具体来说,例如制造导入有表达该突变蛋白的表达载体的转基因牛即可。

实施例

以下,使用实施例进行更详细的说明。

[1]DNA的提取以及微卫星多态和SNP的分型

基因组DNA从精液、肾周围脂肪或血液通过常规方法提取。使用可以特异性地扩增目标基因组片段的引物,通过PCR法扩增该基因组区域。对于微卫星多态,荧光标记反向侧引物,将PCR扩增产物用ABI 3730 DNA分析仪(应用生物系统公司(アプライドバイオシステム社))进行电泳后,通过GENESCAN和GeneMapper软件(应用生物系统公司)分析,从而进行分型。对于SNP,使用Big Dye Terminator v.3.1循环测序试剂盒(应用生物系统公司)进行PCR扩增产物的直接测序,从而确定序列,进行SNP的检测和分型。对于表2的SNP 19,因为重复序列是多型的,所以荧光标记反向侧引物,将PCR扩增产物用ABI 3730 DNA分析仪(应用生物系统公司)进行电泳后,通过GENESCAN和GeneMapper软件(应用生物系统公司)分析,从而进行分型。

[2]胴体重量的测定方法

胴体重量使用屠宰场出售的牛的胴体的分级成绩。

[3]与胴体重量相关的SNP的统计学处理

本实施例中,NCAPG基因的e9位点产生的向G的突变是显性突变,显示对胴体重量产生影响。

对于在牛6号染色体上检出了胴体重量或体重QTL的3头黑毛和种种公牛(A~C)和2头褐毛和种种公牛(D、E)的基因组DNA,通过使用牛基因组序列制成的多种微卫星标记和SNP标记进行分型比较。这时,为了分清通过各标记得到的2个等位基因的基因型是来源于相同染色体的优良型(Q)还是非优良型(q),对于各种公牛的子代也进行了分型。表1中表示所用的引物。

【表1】

cM标记名正向引物(序列编号)反向引物(序列编号)碱基DIK9014AGCCAGCTGAGTCAAATTCC(3)GTGAGACAGATGGCCAATCA(4)37,780,13045.93DIK4852TCAGCTTCTGTACCCATGGAC(5)AGCCAGGGTTTCCAGAAAAG(5)37,855,588SNP 0CACCATGTCCTGACCTCAGAT(53)TAACAGTGCCCTGCATGAGA(54)38,009,208DIK9015CCTTTGTTTGCTGGGTCAAT(7)GGGCTTGATCTCTGGTTGAG(8)38,051,344DIK9016ATGGCAACCCACTACTCCAG(9)TTGCTACCAAGCAAGCACTG(10)38,102,885DIK9017GTAAACTCAAGCCACGGCA(11)CGACAACCTTGATGTGACAAA(12)38,670,448DIK9018GATGGCACTCGAGGTAGAGC(13)CAACGCCATGGATTGTAACC(14)38,948,770

cM:连锁地图上的位置(Ihara等(2004)Genome Res.14 1987-1998)

碱基:以牛基因组序列(2007-9-13)中的引物的第一个碱基的编号表示的牛6号染色体上的位置(http://www.hgsc.bcm.tmc.cdu/)

其中,SNP 0的碱基表示SNP的位置

其结果表明,包括NCAPG基因的约660kb(SNP0-DIK9017)的区域在5头种公牛的优良型等位基因中共通,且5头种公牛都包含可以与非优良型等位基因区别开的标记。

对存在于该区域的4个基因的蛋白质翻译区域中存在的SNP进行了检索,发现了5处在种公牛A中为杂合且伴随氨基酸置换的SNP。针对它们,考察了各种公牛,结果5头种公牛都以杂合具有的SNP仅有e9位点的SNP。

对于包括该SNP的邻近的19个SNP(表2),考察了对胴体重量的影响。

【表2】

位置(碱基):以牛基因组序列(2007-9-13)中的碱基的编号表示的牛6号染色体上的位置(http://www.hgsc.bcm.tmc.cdu/)

MAF:190头黑毛和种中的次要等位基因频率(Minor allele frequency)

GenBank登录号:LOC523874 XM_602183;NCAPG NM_001102376;LOC540095 XM_001250262在这里,用于PCR的引物示于表3。

【表3】

SNP ID正向序列(序列编号)反向序列(序列编号)SNP 1TGTACCTTGTGATACATGCTTTAAAAT(15)GATCTGTACACAATAGGAGTTCAATAA(18)SNP 2CACAGGGGAGTTGAATAGCAG(17)CCTGTTGGTTCCAAGTAGACC(18)SNP 3CAGAAGCAGCTGACACAGGA(19)ACTCACAGACTGCTGCATCG(20)SNP 4GGAGAAAACCCACAAGCTCA(21)GCCTCCGAGACAAAGTTTCA(22)SNP 5GGGATGTTGGCAGAAAAGAA(23)CATCCCAAATATTTTTCAAAGG(24)SNP 6TTGTAGATAATTTTCTTAGGTGAAGGA(25)GGACACTCTTTCCTAAACCTTTT(26)SNP 7TTCTCACTTAATGGGGAGCTG(27)TTAGGAGAGCAAATTAGAACAAGAG(28)SNP 8TTTCAGAATGTGAATTTTGGCTTA(29)AGCCAAAAGCACTGAAAACAC(30)SNP 9TTTCAGAATGTGAATTTTGGCTTA(31)AGCCAAAAGCACTGAAAACAC(32)SNP 10TGGATACTGTTTGGAGTTTTGTG(33)TCAGTCGGGCACATACAGAA(34)SNP 11TGGATACTGTTTGGAGTTTTGTG(35)TCAGTCGGGCACATACAGAA(38)SNP 12TTCTGTATGTGCCCGACTGA(37)TCTGGCAGCTAAATTAAGCAAA(38)SNP 13TTTACTTTTGGTGGGGGATG(39)TGCTAAAAATGACCTTGCACA(40)SNP 14GAGCTTACATGGGGAGGGTTA(41)CTTCAAGAAATGAGCACCAAA(42)SNP 15AGTATTTGGTGCTCATTTCTTGA(43)TGAATTTAATTAGAAAAACTCTTCCAT(44)SNP 16GCTGCTTTTGGGACTGATTG(45)GCAGCAGCAAGACATTGAAA(45)SNP 17TTTTAAGCTCAATGGAATCAGGA(47)TGGAATCGCACACAGAAAT(48)SNP 18ATGGGGTACCTCACAGCACT(49)AAGAAAAACCTGAATCTTTTTCACC(50)SNP 19CGCCGCTCGTATGTAAATG(51)TGAACTGACCCGAAAGGAAG(52)

首先,对7990头黑毛和种阉牛的胴体重量上端群(570-670kg;上端4.7%)中的94头(同一种公牛的子代至多5头)、下端群(290-410kg;下端4.6%)中的96头(同一种公牛的子代至多5头)进行分型,以2×2表进行了Fisher的精确检验(参照表3“p值”),与该e9位点的相关性最高(表4的SNP 9:p(等位基因数)=1.2×10-11)。

【表4】

SNP ID  p值(等位基因数)  p值(显性模型中的检验)  p值(隐性模型中的检验)SNP 1  9.9E-05  2.1E-04  0.011SNP 2  1.0E-04  0.1E-06  0.0072SNP 3  4.4E-05  3.1E-04  0.0035SNP 4  0.0010  0.0030  0.091SNP 5  1.0  ND  NDSNP 6  1.0  ND  NDSNP 7  0.91  ND  NDSNP 8  0.82  ND  NDSNP 9  1.2E-11  6.7E-11  0.012SNP 10  0.0037  0.0032  0.20SNP 11  0.012  0.0055  0.15SNP 12  0.0067  0.0041  0.12SNP 13  1.0  ND  NDSNP 14  0.0016  0.0030  0.091SNP 15  0.82  ND  NDSNP 16  1.6E-10  6.1E-10  0.024SNP 17  0.83  ND  NDSNP 18  0.0091  0.0066  0.12SNP 19  0.0081  0.0056  0.12

ND:种公牛A为纯合等位基因,所以未进行检验。

接着,使用fastPHASE程序(Scheet,P.和M.Stephens(2006)Am J HumGenet 78,629-644.),推测由19个SNP构成的单倍型,结果仅该e9位点为G的单倍型在胴体重量上段群内的频率比下段群内的频率大(表5的单倍型5和6:对于这些单倍型和除此之外的单倍型的2×2表的Fisher的精确检验值为p=6.7×10-11)。

【表5】

由此可知,对胴体重量产生影响的突变是在NCAPG基因的e9位点产生的G,该突变是显性突变。

[4]作为标记的利用

对种公牛A-D的子代进行分型,考察与胴体重量的相关性。结果示于表6和表7。

【表6】

种公牛D(母子代)以外的子代都为阉牛

【表7】

贡献率:基因型所说明的效果在表现型值的总方差中所占的比例种公牛D(母子代)以外的子代都为阉牛

对于以NCAPC基因的e9位点的向G的突变判定的胴体的重量增加效果,一个等位基因的突变(杂合个体)通常显示出效果,即使两个等位基因发生突变(纯合个体),与杂合个体相比,虽然效果根据家系而不同,但效果也比最初的突变小。由此确认,该突变是不完全显性的。

此外,不仅是特定的家系,对任意群的375头进行分型的结果中也得到同等的结果,由此可知,该SNP可以广泛地被用作可以判别使胴体重量增加的基因型的优良的标记。

序列表

<110>社团法人畜产技术协会

<120>评价牛个体的胴体重量的基因标记及使用其的胴体重量评价方法

<130>P1547

<160>54

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>3231

<212>DNA

<213>家牛

<400>1

ggtaggcgaa cgtgaacagg ctttgtctcg gccgggtact ggcgccatgg ggaaggagaa  60

gagactgctg ctgattaagg aggccttcca gctggcgcag cagcctcacc agaaccaggc  120

gaagctggtg gtggcgctga accgcaccta cggctcggtg gatgacaaaa cagattttca  180

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taaacttaac cttgcacaat ttctcaatga agatacaagt taggagaaga aatgatggag  3120

gtggagtcct ttgaaaaatg gcctttaaaa ttatgttcag ttctttgctt taataaagtt  3180

acccttgtat gaaaattaaa gtctgattct tgcagaaaaa aaaaaaaaaa a           3231

<210>2

<211>1018

<212>PRT

<213>家牛

<400>2

 Met Gly Lys Glu Lys Arg Leu Leu Leu Ile Lys Glu Ala Phe Gln Leu

 1               5                   10                  15

 Ala Gln Gln Pro His Gln Asn Gln Ala Lys Leu Val Val Ala Leu Asn

             20                  25                  30

 Arg Thr Tyr Gly Ser Val Asp Asp Lys Thr Asp Phe His Glu Glu Phe

         35                  40                  45

 Val His Tyr Leu Lys Tyr Ala Met Val Val Tyr Lys Arg Glu Pro Ala

     50                  55                  60

Val Glu Arg Val Ile Glu Phe Ala Ala Lys Phe Val Thr Ser Phe His

65                  70                  75                  80

Gln Ser Asp Met Glu Asn Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Gly Gly Ile

                85                  90                  95

Leu Asn Tyr Leu Leu Thr Phe Leu Leu Lys Ser His Glu Ala Asn Ser

            100                 105                 110

Asn Ala Val Arg Phe Arg Ala Cys Gln Leu Ile Asn Lys Leu Leu Gly

        115                 120                 125

Asn Met Pro Glu Asn Ala Gln Ile Asp Asp Asp Leu Phe Asp Lys Ile

    130                 135                 140

Asn Glu Ala Met Leu Ile Arg Leu Lys Asp Lys Val Pro Asn Val Arg

145                 150                 155                 160

Ile Gln Ala Val Leu Ala Leu Ser Arg Leu Gln Asp Pro Lys Asp Asp

                165                 170                 175

Glu Cys Pro Val Val Asn Ala Tyr Ala Thr Leu Ile Glu Asn Asp Ser

            180                 185                 190

Asn Pro Glu Val Arg Arg Ala Val Leu Ser Cys Ile Ala Pro Ser Ala

        195                 200                 205

Lys Thr Leu Pro Lys Ile Val Gly Arg Thr Lys Asp Val Lys Glu Thr

    210                 215                 220

Val Arg Lys Leu Ala Tyr Gln Val Leu Ala Glu Lys Val His Met Arg

225                 230                 235                 240

Ala Leu Ser Ile Ala Gln Arg Val Met Leu Leu Gln Gln Gly Leu Asn

                245                 250                 255

Asp Arg Ser Asp Ala Val Lys Gln Ala Met Gln Lys His Leu Leu Gln

            260                 265                 270

Gly Trp Leu Arg Phe Thr Glu Gly Asn Ile Leu Glu Leu Leu His Arg

        275                 280                 285

Leu Asp Val Glu Asn Ser Ser Glu Val Ala Val Ser Val Leu Asn Ala

    290                 295                 300

Leu Phe Ser Met Thr Pro Leu Asn Glu Leu Ala Glu Ile Cys Lys Asn

305                 310                 315                 320

Asn Asp Gly Arg Lys Leu Ile Pro Ala Asp Thr Leu Thr Pro Glu Phe

                325                 330                 335

Ala Leu Tyr Trp Arg Val Leu Cys Glu His Leu Lys Ser Lys Gly Glu

            340                 345                 350

Glu Gly Glu Glu Phe Leu Glu Gln Ile Leu Pro Glu Pro Val Val Tyr

        355                 360                 365

Ala Glu Tyr Leu Leu Ser Tyr Ile Gln Ser Ile Pro Val Val Thr Glu

    370                 375                 380

Glu Gln Arg Gly Asp Phe Ser Tyr Ile Gly Asn Leu Met Thr Lys Glu

385                 390                 395                 400

Phe Ile Gly Gln Gln Leu Ile Leu Ile Ile Lys Ser Leu Asp Thr Asn

                405                 410                 415

Glu Glu Gly Gly Arg Lys Arg Ile Leu Gly Ile Leu Gln Glu Ile Leu

            420                 425                 430

Thr Leu Pro Thr Thr Pro Ile Ser Leu Ile Ser Phe Leu Val Glu Arg

        435                 440                 445

Leu Leu His Ile Ile Ile Asp Asp Asn Lys Arg Ile Gln Ile Val Thr

    450                 455                 460

Glu Ile Ile Ser Glu Ile Arg Ala Pro Ile Val Thr Val Ala Val Asn

465                 470                 475                 480

Asn Asp Pro Ala Asp Ala Arg Lys Lys Glu Leu Lys Met Ala Glu Ile

                485                 490                 495

Lys Val Lys Leu Ile Glu Ala Lys Asp Ser Leu Glu Asn Cys Ile Thr

            500                 505                 510

Leu Gln Asp Phe His Arg Ala Ser Glu Leu Lys Glu Glu Ile Lys Ala

        515                 520                 525

Leu Glu Asp Ala Lys Ile Asn Leu Leu Lys Glu Thr Glu Gln His Glu

    530                 535                 540

Met Lys Glu Val His Ile Glu Lys Asn Asp Ala Glu Thr Leu Gln Lys

545                 550                 555                 560

Cys Leu Ile Leu Cys Tyr Glu Leu Leu Lys Gln Met Ser Thr Ser Thr

                565                 570                 575

Gly Ile Gly Ala Thr Met Asp Gly Ile Ile Glu Ser Leu Ile Leu Pro

            580                 585                 590

Gly Ile Ile Asn Val His Pro Val Val Arg Asn Leu Ala Val Leu Cys

        595                 600                 605

Leu Gly Cys Cys Gly Leu Gln Asn Gln Asp Phe Ala Ser Lys His Phe

    610                 615                 620

Val Leu Leu Leu Gln Val Leu Gln Ile Asp Asp Val Thr Ile Lys Ile

625                 630                 635                 640

Ser Ala Leu Lys Ala Ile Phe Asp Gln Leu Met Thr Phe Gly Phe Glu

                645                 650                 655

Pro Phe Lys Thr Lys Lys Ile Lys Ala Thr Gln Lys Glu Gly Ala Glu

            660                 665                 670

Ile Asn Ser Ser Glu Glu Gln Glu Ser Lys Glu Ser Glu Glu Glu Thr

        675                 680                 685

Ala Ile Ala Lys Asn Val Leu Lys Leu Leu Ser Asp Phe Leu Asp Ser

    690                 695                 700

Glu Val Ser Glu Leu Arg Thr Gly Ala Ala Glu Gly Leu Ala Lys Leu

705                 710                 715                 720

Met Phe Ser Gly Leu Leu Val Ser Ser Arg Ile Leu Ser His Leu Val

                725                 730                 735

Leu Leu Trp Tyr Asn Pro Val Thr Glu Glu Asp Ile Arg Leu Arg His

            740                 745                 750

Cys Leu Gly Val Phe Phe Pro Met Phe Ala Tyr Ala Ser Arg Thr Asn

        755                 760                 765

Gln Glu Cys Phe Glu Glu Ala Phe Leu Pro Thr Leu Gln Thr Leu Ala

    770                 775                 780

Asn Ala Pro Ala Ser Ser Pro Leu Ala Glu Ile Asp Ile Thr Asn Val

785                 790                 795                 800

Ala Glu Leu Leu Val Asp Leu Thr Arg Pro Ser Gly Leu Asn Pro Gln

                805                 810                 815

Ala Lys Asn Pro Pro Asp Tyr Gln Ala Leu Thr Val His Asp Asn Leu

            820                 825                 830

Ala Met Lys Ile Cys Asn Glu Ile Leu Thr Cys Pro His Ser Pro Glu

        835                 840                 845

Val Arg Val Tyr Thr Lys Ala Leu Ser Ser Leu Glu Leu Ser Ser Asp

    850                 855                 860

Leu Ala Lys Asp Leu Leu Val Val Leu Asn Glu Ile Leu Glu Gln Val

865                 870                 875                 880

Lys Asp Arg Thr Cys Leu Arg Ala Leu Glu Lys Ile Lys Ile Gln Ile

                885                 890                 895

Glu Lys Gly Ile Lys Glu His Ser Asp Gln Ala Val Ala Ala Gln Asp

            900                 905                 910

Asp Ile Thr Thr Met Thr Val Leu Gln Ser Glu Asp Glu Lys Asn Lys

        915                 920                 925

Asp Val Tyr Ile Thr Pro Val Lys Glu Val Lys Ala Thr Arg Met Lys

    930                 935                 940

Ser Thr Gln Gln Lys Thr Asn Arg Gly Arg Arg Lys Val Val Ala Ser

945                 950                 955                 960

Ala Arg Thr Asn Arg Arg Cys Gln Thr Ile Glu Ala Glu Ala Asn Ser

                965                 970                 975

Glu Ser Asp His Glu Val Pro Glu Pro Glu Ser Glu Met Lys Met Arg

            980                 985                 990

Leu Pro Arg Arg Ala Lys Thr Ala Ala Leu Glu Lys Ser Lys Leu Asn

        995                 1000                1005

Leu Ala Gln Phe Leu Asn Glu Asp Thr Ser

    1010                1015

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>家牛

<400>3

agccagctga gtcaaattcc    20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>家牛

<400>4

gtgagacaga tgggcaatca    20

<210>5

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<212>DNA

<213>家牛

<400>5

tcagcttctg tacccatgga c  21

<210>6

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<213>家牛

<400>6

agccagggtt tccagaaaag    20

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>家牛

<400>7

cctttgtttg ctgggtcaat    20

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>家牛

<400>8

gggcttgatc tctggttgag    20

<210>9

<211>20

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<213>家牛

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atggcaaccc actactccag    20

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>家牛

<400>10

ttgctaccaa gcaagcactg    20

<210>11

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<212>DNA

<213>家牛

<400>11

gtaaactcaa gccacggca    19

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>家牛

<400>12

cgacaacctt gatgtgacaa a  21

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>家牛

<400>13

 gatggcactg gaggtagagc   20

<210>14

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<213>家牛

<400>14

caaccccatg gattgtaacc    20

<210>15

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<213>家牛

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tgtaccttgt gatacatgct ttaaaat    27

<210>16

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<213>家牛

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gatctgtaca caataggagt tcaataa    27

<210>17

<211>21

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<213>家牛

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cacaggggag ttgaatagca g          21

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<213>家牛

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cctgttgctt ccaagtagac c          21

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<213>家牛

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cagaagcagc tgacacagga            20

<210>20

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<213>家牛

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<210>21

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<212>DNA

<213>家牛

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ggagaaaacc cacaagctca                 20

<210>22

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<213>家牛

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<213>家牛

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catgccaaat atttttcaaa gg              22

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<213>家牛

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<210>27

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<213>家牛

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ttctcactta atggggagct g      21

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<213>家牛

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tttcagaatg tgaattttgg ctta   24

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agccaaaagc actgaaaaca c    21

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tggatactgt ttggagtttt gtg  23

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tggatactgt ttggagtttt gtg  23

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