红曲协同发酵提高蛹虫草子实体和虫草菌素产量的方法

摘要

本发明公开了红曲协同发酵提高蛹虫草子实体和虫草素产量的方法，事前，需要进行菌种活化和拮抗试验，嗣后需要进行虫草菌素的检测；该方法包括4个阶段：(1)红曲培养；(2)蛹虫草培养；(3)双菌混合协同发酵；(4)子实体管理。本方法不仅能明显提高蛹虫草子实体产量，提高达30％多；而且还能提高蛹虫草子实体的质量，使子实体里虫草菌素含量提高20％，达到20.2mg/g以上。这对提高蛹虫草固体发酵的产量和效率，以及提高药物蛹虫草菌粉和胶囊中有效成分的含量具有重要意义，具有良好的应用开发前景。

说明书

技术领域

本发明涉及真菌发酵工程，具体而言涉及蛹虫草的固体培养及其次生代谢产物的生产。

背景技术

蛹虫草[Cordyceps militaris(L.)Link]又名北冬虫夏草，隶属于真菌界、子囊菌门、子囊菌纲、粪壳菌亚纲、肉座菌目、麦角菌科、虫草属，又名北虫草，北冬虫夏草。它是虫草属真菌的模式种，其宿主主要为鳞翅目的蚕蛾科、舟蛾科、天蚕蛾科等。它是由子座与菌核两部分组成的复合体。其无性型为蛹草拟青霉[Paecilomyces militaris(Kob.)Br.&Sm.]。其分布广泛，在我国河北、陕西、安徽、吉林、辽宁、云南、青海、贵州、四川、广西等均有发现。蛹虫草含有多种有效成分，包括虫草酸(D-甘露醇)、虫草多糖、虫草菌素(cordycepin)、N⁶-甲基腺苷(N⁶-methyladenosine)、0⁵-乙酰虫草素(0⁵-acetylcordycepin)、腺苷、3-氨基-3-脱氧腺苷、高瓜氨酰氨基腺苷、赖氨酰氨基腺苷、麦角甾醇过氧化物(ergosterol peroxide)和虫草环肽(cordycepeptide)等。虫草菌素是蛹虫草最重要的活性成分之一，具有显著的药理作用。

《新华本草纲要》记载蛹虫草功效为：“全草味甘，性平，有益肺肾、补精髓、止血化痰”。蛹虫草可用于肺结核、老人虚弱、贫血等，是具有滋补功能的珍贵中药材。于2003年被批准为国家一类新药(中药)。人们对蛹虫草的药理作用进行了大量的研究，证实其具有广泛的药理学活性及临床作用。比如：抗肿瘤作用，提高免疫功能的作用，调节神经系统的作用，对肺虚咳嗽，急慢性支气管炎，哮喘等有较好的疗效。对肾虚所致的阳痿早泄有良好的治疗及保健作用，对肾虚腰痛，糖尿病，蛋白尿等肾功能障碍患者也有较好的治疗效果。具有明显的抗氧化、抗衰老作用。

虫草菌素即3′-脱氧腺苷(3′-Deoxyadenosine)，又称蛹虫草菌素，由Cunningham等于1951年从蛹虫草的培养滤液中分离得到。虫草菌素是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗菌素。虫草菌素的分子式为C₁₀H₁₃N₅O₃，分子量251，碱性，针状或片状结晶，熔点230～231℃，溶于水、热乙醇和甲醇，不溶于苯、乙醚和氯仿，蒽酮反应阳性，紫外光最大吸收波长为259nm。虫草菌素具有多种生物学活性，比如：抑菌作用，抗肿瘤作用，抑制人体免疫缺陷病毒HIVI型病毒的作用，免疫调节作用和明显降血糖、降血脂作用。其中，降血脂方面的效果尤为明显，与市售的法国力博福尼制药公司生产的非诺贝特(力平之)效果相当或优于非诺贝特；在治疗白血病方面在美国进入了临床研究。虫草菌素的结构式为：

近年来，虫草的生产与应用受到了人们的关注，涉及虫草的专利申请上百件。例如9⁴115054.2号“冬虫夏草的深层发酵工艺”、03117400.0号“一种诱发蛹虫草子实体原基的化学方法”、200410059964.X号“蛹虫草食品和蛹虫草基质及其制备方法”、200610028671.4号“一种发酵虫草菌粉的水溶性活性组分及其应用”等。然而迄今为止，尚无利用红曲协同发酵提高蛹虫草子实体和虫草菌素产量技术的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供利用红曲协同发酵提高蛹虫草子实体和虫草菌素产量的方法，提高蛹虫草子实体的产量与质量。

本发明所使用的菌株为：红曲为紫红曲M.purpureus菌株ATCC 16365；蛹虫草(Cordyceps militaris)为无性型蛹草拟青霉(paecilomycesmilitaris)PM-71菌株，此菌株已于2008年4月17日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏登记入册编号为：CGMCCNo.2459。

发明人指出，在实现红曲协同发酵之前，需要进行菌种活化和拮抗试验，具体方法是：

1、菌种活化分6步进行

(1)配PDA培养基：马铃薯200g，水煮30min，用4层纱布过滤，取滤液，葡萄糖20g，琼脂15～20g，加水至1000ml；

(2)将配好的PDA培养基分装到试管，包扎，121℃灭菌30min；

(3)灭好菌的试管培养基凝固前摆斜面，冷却；

(4)将原始菌种从4℃冰箱中取出，室温下在超净操作台上无菌接种；

(5)接种红曲(ATCC 16365)的试管置30℃下黑暗恒温培养，接种蛹虫草(CGMCCNo.2459)的试管置26℃下黑暗恒温培养。

(6)3～5天后，等菌种长满斜面，用无菌水洗斜面制成孢子悬液(在超净工作台上无菌操作)。

2、拮抗实验

用点种法，在沙氏平板上同时接种蛹虫草(CGMCCNo.2459)和红曲(ATCC16365)，并使二者相距2cm，另在沙氏平板上分别接种单一的蛹虫草、红曲，作对照。2个单一的只接种蛹虫草和红曲的平板和3个接种双菌的平板作为一组，共接5组，根据蛹虫草和红曲各自最适生长温度设置协同发酵的培养温度梯度，将5组平板分别放在26℃，27℃，28℃，30℃及26℃，6h/30℃，6h交替的培养箱中黑暗培养，筛选出使二者生长良好且均衡的培养温度为26℃。

本发明的红曲协同发酵提高蛹虫草子实体和虫草素产量的方法包括：

1、红曲培养：

在容积为350ml的圆柱形无色玻璃瓶(内径6.2cm，高度15cm)中装入25g大米，按1∶1.6的料水比加入40ml蒸馏水；用耐高温单层聚丙烯塑料膜封口，121℃、30min高压灭菌，冷却后接种已活化好的红曲(ATCC 16365)菌株的孢子悬液，置30℃下黑暗恒温培养；

2、蛹虫草培养：

在容积为350ml的圆柱形无色玻璃瓶中装入25g大米，麦麸1.2g，玉米粉0.4g，豆粉0.4g，按1∶1.6的料水比加入43.2ml营养液；用耐高温单层聚丙烯塑料膜封口，121℃下高压灭菌30min，冷却后，接种蛹虫草(CGMCCNo.2459)菌株的孢子悬液，置26℃下黑暗恒温培养；

3、双菌混合：

待培养的红曲和蛹虫草都封底后，在无菌条件下将红曲与蛹虫草的大米培养物按1∶9的比例混合，混合后搅拌均匀，置于26℃下黑暗恒温培养，5～7d后进入蛹虫草子实体管理阶段；

4、子实体管理：

为刺激子实体原基形成，增加光照和温差刺激，每天散射光光照不少于10h，温度每天18℃，10h/25℃，14h(光照)交替，相对湿度提高至80％左右，每天通风10min以补充新鲜空气；蛹虫草子座长出后，增加光照强度至1000LX，温度保持22℃左右，空气湿度85％左右；每天通风换气3次，每次10min；待子实体生长30天后，收获橙黄色的子实体。

上述方法的蛹虫草培养阶段中，所述的营养液配方为葡萄糖10g，蛋白胨5g，MgSO₄·7H₂O 1g，KH₂PO₄ 2g，柠檬酸铵1g，水1000ml。

虫草菌素的检测方法如下：通过HPLC分析虫草菌素的含量，HPLC测定用PC2000型HPLC分析仪(Scientific systems Inc.，PA，USA)；检测波长为259nm；柱温30℃；流动相为10mM KH₂PO₄溶于甲醇/双蒸水(15∶85)，流速为1ml/min；进样量为20μl。先精密称取干菌丝粉0.2g置于具塞试管中，加入双蒸水10ml，超声处理30min，然后在5000g下离心15min，最后经0.45μm滤膜过滤除去固体杂质后检测其中虫草菌素的含量；若测定前样品经过稀释，则乘以稀释倍数。无红曲协同发酵的实验组蛹虫草子实体平均产量为2.87g/瓶(干重)，与红曲协同发酵的蛹虫草子实体平均产量为3.74g/瓶，蛹虫草子实体产量提高30％多。子实体里虫草菌素平均含量提高20％，达到20.2mg/g。

表1 红曲和蛹虫草协同发酵时红曲加入量对其子实体和虫草菌素产量的影响。

本发明的红曲协同发酵提高蛹虫草子实体和虫草素产量的方法不仅能明显提高蛹虫草子实体产量(提高达30％多)，而且还能提高蛹虫草子实体的质量，使子实体里虫草菌素含量提高20％(达到20.2mg/g以上)，这对提高蛹虫草固体发酵的产量和效率，以及提高药物蛹虫草菌粉和胶囊中有效成分的含量具有重要意义。

具体实施方式

实施例1：在洗净的10个无色玻璃瓶中分别装入25g大米，按1∶1.6的料水比加入40ml蒸馏水，封口后在121℃，30min高压灭菌，冷却后接种已活化好的红曲(ATCC16365)菌株的孢子悬液，置30℃下，黑暗恒温培养。在90个罐头瓶中分别装入25g大米，麦麸1.2g，玉米粉0.4g，豆粉0.4g，按1∶1.6的料水比加入43.2ml营养液(配制方法为葡萄糖10g，蛋白胨5g，MgSO₄□7H₂O 1g，KH₂PO₄ 2g，柠檬酸铵1g，水1000ml)；高压灭菌，冷却后，接种蛹虫草(CGMCCNo.2459)菌株的孢子悬液，置26℃下黑暗恒温培养。

待培养的红曲和蛹虫草封底后，在无菌条件下将红曲与蛹虫草的大米培养物按1∶9比例混合，混合后搅拌均匀，置于26℃下黑暗恒温培养，5～7d后增加光照和温差刺激，每天光照不少于10h，温度每天18℃，10h/25℃，14h(光照)交替，相对湿度提高至80％左右，蛹虫草子座长出后，增加光照强度至1000LX，温度保持22℃左右，空气湿度85％左右，待子实体生长30天后，收获子实体并烘干。

实施例2：在洗净的20个无色玻璃瓶中分别装入20g大米，按1∶1.6的料水比加入32ml蒸馏水，封口后在121℃，30min高压灭菌，冷却后接种已活化好的红曲(ATCC 16365)菌株的孢子悬液，置30℃下，黑暗恒温培养。在180个罐头瓶中分别装入20g大米，麦麸1g，玉米粉0.3g，豆粉0.3g按1∶1.6的料水比加入34.6ml营养液(配制方法为葡萄糖10g，蛋白胨5g，MgSO₄·7H₂O 1g，KH₂PO₄ 2g，柠檬酸铵1g，水1000ml)；高压灭菌，冷却后，接种蛹虫草(CGMCCNo.2459)菌株的孢子悬液，置26℃下黑暗恒温培养。

待培养的红曲和蛹虫草封底后，在无菌条件下将红曲与蛹虫草的大米培养物按1∶9的比例混合，混合后搅拌均匀，置于26℃下黑暗恒温培养，5～7d后增加光照和温差刺激，每天光照不少于10h，温度每天18℃，10h/25℃，14h(光照)交替，相对湿度提高至80％左右，蛹虫草子座长出后，增加光照强度至1000LX，温度保持22℃左右，空气湿度85％左右，待子实体生长30天后，收获子实体并烘干。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。