一种棘胸蛙微卫星DNA标记及其用途

摘要

本发明公开了一种棘胸蛙微卫星DNA标记，该微卫星DNA标记的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：8这8种序列中的任意一种。本发明还同时提供了该棘胸蛙微卫星DNA标记的用途：用于对棘胸蛙进行遗传分析、种质资源调查和辅助育种。

说明书

技术领域

本发明涉及分子标记技术，具体涉及一种棘胸蛙的DNA分子遗传标记及其用途。

背景技术

微卫星(又称为简单重复序列，SSR)是由1-6个核苷酸组成的短序列串联重复多次而组成的一段DNA。由于微卫星侧翼序列相对保守，根据其侧翼序列设计引物，可用PCR扩增出微卫星位点的序列。由于微卫星中重复单元的重复次数不同，因而扩增出的微卫星序列的长度呈现多态性。微卫星序列广泛存在于真核生物基因组中，而且随机分布，具有高度多态性，选择上中性，共显性等特点，是十分有效的遗传标记，被广泛应用于遗传图谱构建、基因定位、遗传关系分析、品种鉴定等领域。如用微卫星标记分析苎麻品种的亲缘关系(Zhou等，2005，Progress in Natural Science，15：137-142)、用微卫星DNA标记进行猪品种分类的专利申请“适于猪品种分类的猪微卫星DNA标记”(公开号CN1370834A)、用微卫星DNA标记进行家蚕分子连锁遗传分析的专利申请“家蚕的SSR标记及其应用”(公开号CN1970792A)。

棘胸蛙(Paa spinosa David)，属两栖纲、无尾目、蛙科。棘胸蛙个体大，肉质细嫩洁白，味道鲜美，具有很高的营养价值和药用价值，素有“百蛙之王”的美称。由于人为捕杀和自然环境的恶化，野生棘胸蛙资源遭到严重破坏，开展棘胸蛙人工养殖既有助于保护野生资源，又能满足市场需求。现在，棘胸蛙是我国重要的养殖蛙类之一，但是由于其基础研究薄弱，要实现规模养殖还有许多亟待解决的问题，其中包括需要一套有效的分子标记对其进行遗传关系分析、种质资源调查、标记辅助育种等。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种棘胸蛙微卫星DNA标记，利用这些分子标记能对棘胸蛙进行遗传分析、种质资源调查和辅助育种。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种棘胸蛙微卫星DNA标记，该微卫星DNA标记的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：8这8种序列中的任意一种；所述SEQID NO：1对应的微卫星编号为Psp16，SEQ ID NO：2对应的微卫星编号为Psp17，SEQ IDNO：3对应的微卫星编号为Psp18，SEQ ID NO：4对应的微卫星编号为Psp19，SEQ ID NO：5对应的微卫星编号为Psp20，SEQ ID NO：6对应的微卫星编号为Psp21，SEQ ID NO：7对应的微卫星编号为Psp22，SEQ ID NO：8对应的微卫星编号为Psp23。

作为本发明的棘胸蛙微卫星DNA标记的改进：棘胸蛙微卫星DNA标记引物选自下列引物对，其中的核苷酸序列为5′→3′，

Psp16     正向：GTATCATTTTGTGTTTTTT

          反向：TTTGAATTGTCTTTTGTC

Psp17     正向：AGTTATGTGGCAGAGAAAC

          反向：AAGAGCACAGGAGAGTCA

Psp18     正向：GCTTATTGTTGGGCTTCA

          反向：TCACTGGCATCAGGTCTG

Psp19     正向：TCACAATCGACGTAATGG

          反向：ACACACAGAGGGTCACACT

Psp20     正向：TTGGCTCATCAACTACCC

          反向：AGTCACATAACATACCCCCT

Psp21     正向：ACTCTCGCCTCAATCC

          反向：ATGTAGCTCAGCGTACTG

Psp22     正向：ATCTTAGGTGCAGCAACTT

          反向：TCCCTTGTGTAGTGTTCAGT

Psp23     正向：TCGACGATTGCCAGAGACC

          反向：GCTGGTGGGGAAACTACATTAT。

本发明还同时提供了该类棘胸蛙微卫星DNA标记的用途：用于对棘胸蛙进行遗传分析、种质资源调查或辅助育种。

实现上述发明的技术方案包括棘胸蛙(CA)n微卫星富集文库的构建、含微卫星序列的阳性克隆的筛选及测序，确定了8个多态性丰富的微卫星标记Psp16、Psp17、Psp18、Psp19、Psp20、Psp21、Psp22、Psp23。

本发明旨在分离克隆微卫星DNA标记，建立棘胸蛙的微卫星DNA的技术体系并利用这些分子标记进行遗传分析、种质资源调查和辅助育种。因此，本发明提供了8个棘胸蛙微卫星位点的DNA序列及扩增上述8个棘胸蛙微卫星位点的引物序列和扩增方法，8个棘胸蛙微卫星位点用于棘胸蛙种质资源研究，遗传关系分析，标记辅助选种和标记辅助育种，重复性好，多态性高，是一种可靠有效的分子标记。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是本发明涉及的13个棘胸蛙自然种群的structure聚类图(K＝3)。

具体实施方式

实施例1、棘胸蛙(CA)_n微卫星富集文库的构建

依次进行以下步骤：

1)、用经典的酚-氯仿抽提法提取棘胸蛙(广西龙胜)基因组DNA。用限制性内切酶Sau3AI酶切棘胸蛙基因组DNA，酶切产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，紫外光下切下300-1000bp大小的DNA片段并用凝胶回收试剂盒纯化回收酶切产物。

2)、将碱基互补的寡核苷酸Sau3AI Oligo A：5′-GGCCAGAGACCCCAAGCTTCG-3′和Oligo B：5′-pGATCCGAAGCTTGGGGTCTCTGGCC-3′(上海生工合成，HPLC级纯化，200pmol/μl)各取10μl轻轻蜗旋混匀，在PCR仪上80℃变性10分钟，然后在室温下使寡核普酸链缓慢退火复性约1小时，加入60μl高纯水制备成浓度为25pmol/μl带有Sau3AI酶切识别位点的接头。

3)、将上述步骤1)所得的酶切产物和步骤2)所得的接头用T₄DNA连接酶连接，将所得的连接液用维特洁公司的清洁试剂盒纯化，去除盐离子、蛋白和多余的接头片段，溶解于50μl TE缓冲液中；得连接产物。

4)、用生物素标记的寡核苷酸探针(CA)₁₅与步骤3)所得的连接产物DNA片段杂交。具体操作为：在总体积100μl杂交液(6×SSC，0.1％SDS)中加入500ng连接产物和100pmol生物素标记的寡核苷酸探针，并在95℃下变性10min，60℃杂交1小时。

5)、在步骤4)所得物中加入100μl(10μg/μl)磁珠(Dynabeads M-280，购自Dynal Biotech公司)，并在室温放置30分钟。

6)、在磁力架上吸附磁珠，弃上清。磁珠用400μl洗涤缓冲液(6×SSC，0.1％SDS)在60℃下洗涤15分钟，然后在室温下分别用2×SSC和1×SSC溶液洗涤两次，并弃上清。

7)、在步骤6)所得物中加入50μl无菌水，在90℃下保温10分钟，小心吸取上清，上清液即为含有(CA)n重复序列的单链DNA片段。以Oligo A为引物，以单链DNA片段为模板进行PCR扩增获得双链目的片段。

25μlPCR反应体系包含：大约100ng单链DNA片段，20mm Tris-HCI(pH8.3)，100mmKCI，3mm MgCl₂，dNTP各1000μm，3pmol Oligo A，0.8units Taq polymerase(Shanghaipromega)。

PCR循环程序设置为：95℃预变性3分钟，接着5个循环包括95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，然后进行另外30个循环的92℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸55s，最后于72℃下延伸10分钟。检测PCR产物并使用维特洁公司的纯化试剂盒纯化，产物溶解于30μl TE缓冲液中。

8)、将步骤7)所得的扩增产物纯化后连接到PMD18-T载体上，然后将连接产物转化至大肠杆菌感受细胞，转化菌液涂布在含有IPTG和X-gal的LB固体培养基平板上进行蓝白斑筛选。

实施例2、含微卫星序列的阳性克隆的筛选、测序及微卫星引物设计

依次进行以下步骤：

1)、挑取实施例1所得的白色菌落并接种到3ml LB培养液中，37℃培养过夜，然后提取质粒。

2)、以质粒DNA为模板，采取三引物法(Gardner等，1999，Journal of Heredity，90，301-304)筛选含有(CA)n微卫星序列的阳性克隆。

3)、将阳性克隆测序，分析是否含有(CA)n重复序列，以及是否有足够的侧翼序列用于引物设计。

4)、根据微卫星重复序列两侧的保守序列，用primer premier5.0软件设计引物，引物长度一般在16—22碱基之间，选择扩增的目标片段在150-350bp之间。

实施例3、棘胸蛙微卫星DNA标记稳定性和多态性检测

用上述实施例2所得的微卫星标记扩增32个来自同一自然种群的棘胸蛙个体(浙江)，确定了8个多态性丰富，适于棘胸蛙遗传多样性检测的微卫星标记(表1)。具体操作过程如下：

1)、用经典的酚-氯仿法抽提32个棘胸蛙个体的DNA作为模板。

2)、设计的引物合成后对引物正确性和可行性进行实验验证，用温度梯度PCR扩增多个模板。15μl的PCR反应体系中含大约50ng基因组DNA，10mm Tris-HCI(pH8.3)，50mm KCI，1.5mm MgCl₂，dNTP各500μm，1pmol微卫星引物，0.5units Taq polymerase(Shanghai promega)。根据实验结果确定哪些引物能够扩增出稳定的目的条带，以及确定最佳退火温度(见表一)。最终筛选出8个位点，分别命名为：Psp16、Psp17、Psp18、Psp19、Psp20、Psp21、Psp22、Psp23。

3)、分别用上述8个位点的8对引物(引物序列见表1)扩增这若干个棘胸蛙个体的DNA。其中任意一条SSR引物的5’端被加上一段没有远红外荧光标记的M13序列，而另一条IRDye标记的M13引物同时包含在这个反应体系中。按上述步骤2)的反应条件进行PCR扩增。PCR产物在LI-COR4300s遗传自动分析仪上进行基因分型，配合使用内置STR分子量标准(STR Marker，LI-COR Bioseienee)和软件SAGA^GT自动判读条带，辅以人工校正。

4)、使用软件CERVUS 2.0统计等位基因数目，多态信息含量(PIC)，观测杂合度(Observed heterozygosities，Ho)和期望杂合度(Expected heterozygosities，He)。哈迪-温伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)偏离测试和位点间的连锁不平衡检验(Linkagedisequilibrium，LD)使用GENEPOP软件version3.4完成，之后辅以连续的Bonefermni校正。使用MICRO-CHEKER软件估算每个位点的无效等位基因情况。

最终确定了以下8个棘胸蛙微卫星DNA标记，分别是：

编号为Psp16的微卫星DNA标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

编号为Psp17的微卫星DNA标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

编号为Psp18的微卫星DNA标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

编号为Psp19的微卫星DNA标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；

编号为Psp20的微卫星DNA标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；

编号为Psp21的微卫星DNA标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；

编号为Psp22的微卫星DNA标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；

编号为Psp23的微卫星DNA标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。

表1、引物特性表：引物序列，退火温度，片段大小

实施例4、棘胸蛙种群遗传多样性和遗传结构分析

用上述实施例3所得的8对微卫星引物扩增来自13个采样点总共210个个体，检测其遗传多样性和种群遗传结构。具体操作过程如下：

1)、用于种群遗传分析的棘胸蛙样本210只。采样点及其代号详见表2。

表2、棘胸蛙样品信息

 

采样地点种群代号样本量观察资料安徽黄山HS15野生浙江金华JH14野生浙江丽水LS18野生福建建阳JY13野生湖南平江PJ23野生江西新干XG10野生福建武夷WY19野生江西井冈山JG24野生广西龙胜LH27野生

 

广西永福YF16野生广东阳山YS17野生云南屏边PB9野生越南VT5野生

2)、棘胸蛙基因组DNA的提取

通过标准的蛋白酶K消化和酚/氯仿抽提的方法(Sambrook and Fritsch，et.al，1989)，从腿部肌肉提取基因组DNA。

3)、微卫星DNA的PCR扩增

(1)PCR反应体系

大约50ng基因组DNA，10mm Tris-HCI(pH8.3)，50mm KCI，1.5mm MgCl₂，dNTP各500μm，1pmolSTR引物，0.5units Taq polymerase(Shanghai promega)，0.5pmol荧光标记M13引物，IRD700或IRD800(LICOR Bioseienee)。

(2)PCR反应程序

PCR循环条件如下：95℃预变性3min，接着35个循环的95℃变性30s，位点特异性退火温度(见表一)30s，72℃延伸30s，最后72℃延链8min。

(3)PCR反应产物的检测

PCR产物在LI-COR4300s遗传自动分析仪上进行基因分型，配合使用内置STR分子量标准(STR Marker，LI-COR Bioseienee)和软件SAGA^GT自动判读条带，辅以人工校正。

4)、数据分析

使用软件CERVUS2.0(Marshall et al.1998)统计等位基因数目，多态信息含量(PIC)，观测杂合度(observed heterozygosities，Ho)和期望杂合度(expeeted heterozygosities，H_E)。哈迪-温伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)偏离测试和位点间的连锁不平衡检验(linkage disequilibrium，LD)使用GENEPOP软件version3.4，(Raymond & Rousset 2004)完成。用软件STRUCTURE(Pritchart et al.2000)进行种群聚类分析，所生成的聚类图如图1所示。图1中：每一条垂线表示一个个体，三种颜色分别代表聚类后的一个分枝，纵坐标表示可能的概率。垂线的颜色组成显示该个体可能属于软件限定某一个分枝。图中显示，基本可以将黄山种群(HS)、金华种群(JH)、丽水种群(LS)、建阳种群(JY)聚为一类；平江种群(PJ)、新干种群(XG)、武夷山种群(WY)、井冈山种群(JG)、永福种群(YF)聚为一类；龙胜种群(LH)、阳山种群(YS)、屏边种群(PB)聚为一类；越南种群(VT)聚类与实际情况不符，可能由于样本量有限导致的误差。

5)、结果如下：

表3、每个种群的样本量、平均等位基因数、平均期望杂合度、平均多态信息含量(PIC)

 

种群代号样本量NaH_EPICHS156.080.6760.617JH146.080.6870.623LS189.330.7490.702JY139.580.7970.745PJ2311.170.7420.705XG109.420.8300.774WY1914.580.8920.855JG2413.580.7950.765LH2713.000.8280.793YF168.670.8270.776YS1712.080.8260.786PB96.750.7850.710VT53.920.7000.574

表4、八个位点的观测杂合度(H_O)、期望杂合度(H_E)、多态信息含量(PIC)、等位基因数(Na)及平均值

 

位点Locus观测杂合度(H_O)期望杂合度(H_E)多态信息含量PIC等位基因数NaPsp160.6880.8880.87813Psp170.4280.9530.9498Psp180.6790.9150.90611Psp190.5720.9200.91324Psp200.4190.7590.73418Psp210.6280.9660.96312Psp220.6090.9530.94819Psp230.4880.9450.9405平均mean0.56380.91230.903813.75

表5、八个微卫星位点在13个种群中的等位基因数量、种群内期望杂合度、各种群多态信息含量

注：表中的*表示显著偏离哈迪-温伯格平衡。

由上述图1及表1～3可以看出，由本发明的8个微卫星标记体现出高度的种群遗传多样性，聚类分析结果能很好的反映这十三个种群的实际状况。由此可见，本发明克隆的八个微卫星标记能很好的用于棘胸蛙种群的遗传多样性分析和遗传结构的检测，并用于种质资源的调查和辅助育种。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

SEQ ID NO：1

SEQ ID NO：2

SEQ ID NO：3

SEQ ID NO：4

SEQ ID NO：5

SEQ ID NO：6

SEQ ID NO：7

SEQ ID NO：8