细菌基因组DNA抽提液及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种血液和血小板制品中细菌基因组DNA的提取液和制备方法及使用方法。本发明所述的细菌基因组DNA抽提液由chelex－100，吐温，NP－40，SDS，溶葡萄球菌素，破壁酶，蛋白酶K和水组成。本发明可有效用于抽提细菌基因组DNA，抽提效率高，生产方法和使用操作简单、方便。

说明书

技术领域

本发明涉及一种从血液、血小板制品中抽提细菌基因组DNA的提取液和制备方法及使用该抽提液提取细菌基因组DNA的方法。

背景技术

血液、血小板制品中存在的细菌污染问题成为危胁血液制品安全的一大隐患。近年来备受重视。以往对于细菌污染的检测都是基于传统的培养方法，这种方法耗时长一般需要24小时得出初步报告，七天获得最终报告。而对于一些菌量少或难以培养的细菌易产生假阴性结果，危及了输血的安全性。随着分子生物学技术的发展，PCR、荧光定量PCR技术被广泛地应用于细菌的诊断中。这不仅使原来难以培养的细菌得以检出，而且大大缩短了检出时间。在这一操作过程中，细菌基因组抽提工作至关重要。

常规使用的商品化细菌基因组抽提试剂盒，基于SDS/酚/氯仿提取，为提高裂解效果，通常加入溶菌酶，增强细菌细胞壁的裂解效果。溶菌酶可以切断N一乙酰葡糖胺与N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4键分子连接，从而破坏细菌细胞壁结构。但对于一些细胞壁的结构比较特殊的细菌，如金黄色葡萄球菌，其基因组DNA不能有效地释放出来，因此不能使用溶菌酶进行溶菌。

另外，常规使用的细菌基因组抽提试剂盒操作复杂，从收集细菌到获得基因组DNA要经历十多步骤，其间很容易引入细菌或其基因组DNA的污染。因此需要一种快速，有效地适用于从血液、血小板制品中提取细菌基因组DNA的方法。

发明内容

本发明的目的之一就在于提供一种新的细菌基因组DNA抽提液，该种DNA抽提液可方便抽提细菌基因组DNA，且抽提效率高。

本发明的另一个目的是提供上述细菌基因组DNA抽提液的制备方法。

本发明的另一个目的是提供上述细菌基因组DNA抽提液的具体使用方法。

为达上述目的，本发明采取的具体技术方案是：

一种细菌基因组DNA抽提液，由体积百分比为50～70％的甲液和30～50％的乙液组成，其中

甲液是由chelex-100、SDS、NP-40和吐温组成，且浓度分别为5％～20％g/ml、0.03％～3％g/ml、0.5％～5％V/V和0.5％～5％V/V，其余为水；

乙液是由溶葡萄球菌素、破壁酶(10U/ul)和蛋白酶K(20mg/ml)组成，且体积比为0.5～1.5∶4.5～5.5∶0.75～1.75。

上述的乙液中，溶葡萄球菌素的原液浓度优选为2mg/ml，破壁酶10U/ul，蛋白酶K20mg/ml。

上述细菌基因组DNA抽提液的制备方法，包括下列步骤：

①取SDS、NP-40和吐温加入水中混合，然后过滤除菌，最后加入适量chelex-100，配成浓度分别为SDS 0.03％～3％g/ml、NP-400.5％～5％V/V 1、吐温0.5％～5％V/V和chelex-1005％～20％g/ml的混合物，制得甲液；

②将溶葡萄球菌素、破壁酶和蛋白酶K的原液按0.5～1.5∶4.5～5.5∶0.75～1.75的体积比混合，YM-100蛋白过滤柱过滤后离心，制得乙液；

③按比例将经步骤①得到的甲液加入步骤②得到的乙液中。

在本抽提液中，甲液可以部分程度地破坏细菌细胞壁，而且chelex-100作为一种弱酸性鳌合交换剂，对多价阳离子具有很强的选择度，可以有效去除这类污染杂质对后续PCR反应的抑制作用。而乙液的加入通过多重酶的联合作用进一步增强对细菌细胞壁的裂解效果，促进了细菌基因组DNA的释放。

使用本发明的抽提液，用以提取血液及血小板制品中细菌DNA的方法，包括以下步骤：

①取标本50～5000ul，10000～15000g/分钟，离心10～15min收集细菌；

②弃上清液，加入上述的抽提液25～250ul；

③30～37℃孵育30～60分钟，50～65℃孵育20～120分钟；

④加热煮沸5～20分钟，于0℃放置5～120秒；

⑤10000～15000g/分钟，离心10～15分钟，所得上清液即为细菌基因组DNA。

本发明的优点和有益效果：

在本发明中，利用了细菌细胞壁的特点和DNA的性质，基于这些特点和性质创造了从血液及血小板中提取细菌基因组DNA方法。与其它常规细菌DNA提取方法相比，本发明有几个明显的优点和有益效果：

1.抽提液制备简单，便于应用、储存、运输，该抽提液只由两种试剂组成，使用时只要将其按比例进行混匀即可；2.抽提过程简便，最短可在90分钟内从标本中提取细菌基因组DNA；3.抽提效率高，细菌细胞壁裂解充分，释放出的基因组DNA都存在于上清液中；4.提取过程不使用酚、氯仿，减少了对实验人员的身体健康伤害。

具体实施方式

实施例1：

按以下配方制作细菌基因组DNA提取液：

①将适量SDS、NP-40和吐温加入水中混合，然后用0.22μm滤器过滤除菌，最后加入适量chelex-100，使最终浓度为5％(g/m1)，调节SDS、NP-40和吐温的浓度分别为0.03％(g/ml)、1％(ml/ml)和1％(ml/ml)，制得混合物甲液；

②将溶葡萄球菌素、破壁酶和蛋白酶K的原液按体积比1∶5∶1.25的比例混合，YM-100蛋白过滤柱过滤14000g/分钟，4℃离心24分钟，制得乙液；

③将经步骤①得到的液体230ul，加入100ul经步骤②得到的液体，即得产品细菌基因组DNA抽提液。

按以下程序进行操作以提取细菌基因组DNA：

①取血小板制品200ul，13000g/分钟，离心10分钟，收集细菌；

②弃上清，加入本发明的抽提液33ul，

③37℃孵育30分钟，56℃孵育30分钟，

④加热煮沸10分钟，于0℃放置60秒，

⑤13000g/分钟，离心10分钟，所得上清液即为细菌基因组DNA，-20℃保存。

实施例2：

按以下配方制作细菌基因组DNA提取液：

①将适量SDS、NP-40和吐温加入水中混合，然后用0.22μm滤器过滤除菌，最后加入适量chelex-100，使浓度为10％(g/ml)，SDS、NP-40和吐温配成浓度分别为0.05％(g/ml)、1.5％(ml/ml)和1.5％(ml/ml)，制得甲液；

②将溶葡萄球菌素、破壁酶和蛋白酶K的原液按1.5∶4.5∶1.75的比例混合，YM-100蛋白过滤柱过滤14000g/分钟，4℃离心24分钟，制得乙液；

③将经步骤①得到的液体400ul，加入200ul经步骤②得到的液体，即得产品细菌基因组DNA抽提液。

按以下程序进行操作以提取细菌基因组DNA：

①取血浆800ul，13000g/分钟，离心10分钟，收集细菌；

②弃上清，加入本发明的抽提液50ul，

③37℃孵育50分钟，56℃孵育60分钟，

④加热煮沸10分钟，于0℃放置60秒，

⑤13000g/分钟，离心10分钟，所得上清液即为细菌基因组DNA，-20℃保存。

试验例

应用本发明的细菌基因组DNA抽提液实施例1与商品化试剂盒TaKaRa MiniBESTBacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0，分别对血小板制品中等量的大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌进行抽提，随后应用荧光定量PCR技术验证抽提效率，结果如下：

荧光定量PCR验证两种方法抽提细菌基因组所得CT值

在两种菌中应用本发明的细菌基因组DNA抽提液实施例1进行抽提，抽提产物应用荧光定量PCR进行鉴定，其CT值均小于试剂盒法所得细菌基因组DNA模板的CT值。证明本发明的细菌基因组DNA抽提液抽提效率高。