作为脑啡肽酶和氨肽酶N混合抑制剂的包含二硫基的氨基酸衍生物

摘要

本发明涉及式(I)的新型化合物：H2N－CH(R1)－CH2－S－S－CH2－CH(R2)－CONH－R5，其中：R1是烃链、苯基或苄基、被5原子或6原子杂环取代的亚甲基；R2是苯基或苄基、5原子或6原子芳杂环、被5原子或6原子杂环取代的亚甲基；R5是CH(R3)－COOR4基团，其中R3是氢、OH或OR基、饱和烃基、苯基或苄基并且OR4是亲水的酯，或者R5是包含若干个选自氮、硫和氧的杂原子的5元或6元杂环，并且至少包含两个氮原子，其中所述杂环被C1－C6的烷基、苯基或苄基取代。还公开了药物形式的本发明化合物的用途，包含所述化合物和药学可接受的赋形剂的药物组合物，与大麻素衍生物中的至少一种类型和/或吗啡或其衍生物一起用于增强式(I)的新型化合物的镇痛和抗抑郁作用的用途。

说明书

技术领域

本发明涉及脑啡肽酶和氨肽酶N的新型混合抑制剂。

背景技术

已知天然的阿片样肽或脑啡肽-(Tyr-Gly-Gly-Phe-Met或 Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu)-主要通过两种锌金属肽酶降解，这两种酶是切 断Gly3-Phe4键的脑啡肽酶(EC 3.4.24.11)(Nature 276(1978)523)和切 断这些肽的Tyr1-Gly2键的氨肽酶N(EC 3.4.11.2)(Eur.J.Pharmacol. 117(1985)233；综述于Pharmacological review.，1993，45，87-146)。已 知这两种酶的混合抑制剂完全保护内源性脑啡肽免于酶降解，它们显示 脑啡肽的药理活性，尤其是镇痛和抗抑郁活性。在现有技术中描述的这 两种酶活性的混合抑制剂是具有异羟肟酸酯官能团的化合物(FR 2 518 088和FR 2 605 004)、氨基次膦酸化合物(FR 2 755 135和FR 2 777 780) 和氨基酸衍生物(FR 2 651 229)。在这些专利申请中公开的化合物在通过 脑室内途径施用后表现出极好的体内和体外活性；在异羟肟酸的情况下 尤其表现出这种活性(Eur.J.Pharmacol.，102，(1984)，525-528；Eur.J. Pharmacol.，165，(1989)，199-207；Eur.J.Pharmacol，192，(1991)， 253-262)，这些化合物在大鼠关节炎模型中静脉内(IV)施用后也能够显 示出明显的活性(Brain Research，497，(1989)，94-101)。在膦衍生物和氨 基酸衍生物的情况下，当将所研究的分子溶于油、乙醇和水的混合物中 时，通过iv途径施用后显示出良好的体内活性(J.Med.Chem.，43，(2000)， 1398-1408；J.Med.Chem.，44，(2001)，3523-3530；J.Pharm.Exp.Ther.， 261，(1992)，181-190)。然而，即使证明属于氨基酸衍生物系列的化合物 中的一种是相对可溶于水的(Pain，73，(1997)，383-391)，也没有一种先前 公开的分子表现出在水相中的可溶解性以及经口途径施用的足够的生 物可利用率和待适于人的动物中足够低的剂量提供有利的镇痛应答。同 样地，没有一种先前所述的分子能够静脉内施用，这是因为在动物试验 中它们需要溶于与通过该途径施用于人不相容的混合物中。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种新型水可溶性化合物，其能够联合抑 制引起脑啡肽降解的两种酶活性并在溶于含水溶剂中并且在静脉内、皮 下、经皮、鞘内或关节内注射和经口或经鼻途径施用之后显示其药理特 性。

通常认为疏水性和非极性分子更容易通过血脑屏障。然而，出人意 料地，合成的亲水分子在中枢试验中显示出强烈的应答，表明存在通过 几种施用途径(除局部途径之外)到达脑结构的良好能力。本发明的另一 个目的是提供表现出吗啡类物质的性质的新型化合物，尤其是表现出镇 痛、对行为的有益效果(减少疼痛的情绪成分和抗抑郁反应)和外周作用 (止泻、镇咳、抗炎)，但是不具有吗啡类物质的主要缺点(耐受性、生理 和心理依赖性、呼吸抑制、便秘、恶心)。

此外，经口途径施用根据本发明的化合物可以减轻或甚至消除外周 部分明显的炎性疼痛和神经性疼痛，因此这些化合物不必到达中枢神经 系统。通过使用不能进入脑的拮抗剂有效地证实了该高度有利但出人意 料的结果。这完全降低了由于本发明化合物对脑阿片样受体的刺激而产 生的所有作用，但不改变所述化合物对这些类型疼痛、尤其是神经性疼 痛的镇痛效果。

最特别地，本发明涉及下式(I)的化合物以及所述化合物(I)与药学可 接受的无机酸或有机酸的加成盐：

H₂N-CH(R₁)-CH₂-S-S-CH₂-CH(R₂)-CONH-R₅

其中：

R₁表示：

-含有1～6个碳原子的饱和或不饱和、直链或支链的烃链，其任选地 被以下基团取代：

^＊OR、SR或S(O)R基团，其中在这些基团的每一个中，R表示 氢、具有1～4个碳原子的直链或支链的烃链、苯基或苄基，

^＊苯基或苄基，

-任选地被以下基团取代的苯基或苄基：

^＊1～5个卤素，特别是氟，

^＊OR、SR或S(O)R基团，其中在这些基团的每一个中，R如上 限定，

-被芳族的或饱和的5原子或6原子杂环取代的亚甲基，所述杂环具有 氮或硫的原子作为杂原子，任选地氧化为N氧化物或S氧化物的形式；

R₂表示：

-任选地被以下基团取代的苯基或苄基：

^＊1～5个卤原子，特别是氟，

^＊OR或SR基团，其中在这些基团的每一个中，R如上限定，

^＊任选地被具有1～6个碳原子的脂肪族、环状或直链基团单取代 或二取代的氨基，

^＊5原子或6原子的芳环，

-5原子或6原子的芳杂环，杂原子是氧、氮或硫，

-被芳族的或饱和的5原子或6原子杂环取代的亚甲基，杂原子是氧、 氮或硫，氮原子和硫原子可以氧化为N氧化物或S氧化物的形式，

R₅表示：

a)CH(R₃)-COOR₄基团，其中

R₃表示：

-氢，

-OH或OR基团，并且R如上限定，

-直链或支链的任选地被OR或SR基团取代的含有1～6个碳原子 的饱和烃链(烷基)，其中在这些基团的每一个中，R如上限定，

-任选地被以下基团取代的苯基或苄基：

^＊1～5个卤素，特别是氟，

^＊OR或SR基团，并且R如上限定，

并且

OR₄表示：

-OCH₂COOR′羟基乙酸酯基团或OCH(CH₃)COOR′乳酸酯基团， 其中在这些基团的每一个中R′表示

^＊直链或支链的具有1～6个碳原子的饱和烃链(烷基)，并且 任选地被C1～C3的烷氧基取代，优选任选地被甲氧基取 代的C1～C4烷基，

^＊C5～C8的环烷基，优选C5～C6的环烷基，

^＊苯基、苄基、杂芳基、烷基杂芳基，

-OCH(R″)O(CO)OR′或OCH(R″)O(CO)R′基团，其中在这些基团 的每一个中R′如上限定，并且R″表示以下基团：

^＊氢原子，

^＊直链或支链的C1～C6烷基链，任选地被C1～C3的烷氧 基取代，优选任选地被甲氧基取代的C1～C4烷基，

^＊C5～C8的环烷基，优选C5～C6的环烷基，

^＊苯基、苄基、杂芳基、烷基杂芳基，

-OCH(CH₂OCOR′)₂或OCH₂-CH(OCOR′)-CH₂OCOR′三酸甘油 酯基团，其中在这些基团的每一个中R′如上限定，

-糖苷基团，例如D-葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-吡喃半乳糖或β- 吡喃半乳糖，

-OCH₂CH₂(SO₂)CH₃磺酸酯基团，

-OCH(CH₂OH)₂基团；

b)包含若干个选自氮、硫和氧的杂原子的5元或6元杂环，其中2 个原子为氮，所述杂环可以被C1-C6烷基、苯基或苄基取代。

本发明还涉及用药学可接受的有机酸或无机酸得到的式(I)化合物 的目标加成盐，例如磷酸盐、盐酸盐、乙酸盐、甲磺酸盐、硼酸盐、乳 酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、半琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、半酒 石酸盐、马来酸盐、抗坏血酸盐、半富马酸盐、己酸盐、庚酸盐、马尿 酸盐、氢化肉桂酸盐、苯甲酰甲酸盐和烟酸盐。

在本发明的范围内，表述“烃链”是指烷烃、烯烃或炔烃。特别地， 表述“饱和烃链”是指直链或支链的包含1～6个碳原子(C1-C6)或包含 1～4个碳原子(C1-C4)的烷基。包含1～4个碳原子的烷基的实例包括甲 基、乙基、丙基、丁基、异丙基、1-甲基-乙基、1-甲基-丙基和2-甲基- 丙基。包含1～6个碳原子的烷基的实例还包括戊基、己基、1-甲基-丁 基、1-甲基-戊基、2-甲基-丁基、2-甲基-戊基、3-甲基-丁基、3-甲基-戊 基、4-甲基-戊基或1-乙基-丙基、1-乙基-丁基和2-乙基-丁基。表述“不 饱和烃链”是指直链或支链的包含2～6个碳原子或包含2～4个碳原子 的烯基(至少一个双键)例如乙烯基、烯丙基等，或炔基(至少一个叁键)。

在本文中所用的术语“卤素”是指氯、溴、碘或氟。

作为具有氮原子或硫原子作为杂原子的芳族的或饱和的5原子或6 原子杂环核的非限定性实例，可以列举下列基团：噻吩基、吡咯基、咪 唑基、吡唑基、异噻唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吡咯烷 基、吡咯啉基、咪唑烷基、吡唑烷基、吡唑啉基、哌啶基、哌嗪基、噻 二唑基，所述氮原子和硫原子任选地氧化为N氧化物或S氧化物的形式。

作为具有氧原子作为杂原子的芳族的或饱和的5原子或6原子杂环 核的非限定性实例，可以列举下列基团：呋喃基、吡喃基、异噁唑基、 吗啉基、呋咱基、噁唑基、噁唑烷基和噁唑啉基。

基团R₁有利地表示任选地被OR、SR或S(O)R基团取代的具有1～ 4个碳原子的烷基，其中在这些基团的每一个中，R如上限定。R₁甚至 更有利地表示具有1～4个碳原子的被SR基团取代的烷基，R如上限定， 特别地R表示具有1～4个碳原子的直链或支链的饱和烃链。

基团R₂有利地表示：

-苄基或苯基，

-被含有氮原子或硫原子作为杂原子的芳族的或饱和的5原子或6 原子杂环取代的亚甲基，所述氮原子或硫原子任选地氧化为N氧 化物或S氧化物的形式。

特别地，基团R₂表示苄基或被具有氮原子或硫原子作为杂原子的芳 族的或饱和的5原子或6原子杂环取代的亚甲基，所述氮原子或硫原子 任选地氧化为N氧化物或S氧化物的形式，基团R₂甚至更有利地表示 苄基或被噻吩基取代的亚甲基。

基团R₅是增加整个分子的亲水特性的基团，该分子通常是较疏水的 分子。

根据本发明的第一实施方案，基团R₅表示CH(R₃)-COOR₄基团。

在该第一实施方案中，基团R₃有利地表示氢原子或任选地被OR或 SR基团取代的具有1～6个碳原子、甚至更有利地具有1～4个碳原子 的烷基，其中在这些基团的每一个中，R如上限定。基团R₃甚至更有 利地表示氢原子或被OH或SH基团取代的具有1～6个碳原子、甚至 更有利地具有1～4个碳原子的烷基。

基团OR₄有利地表示：

-OCH₂COOR′羟基乙酸酯基团，R′如上限定(特别地，R′表示任选 地被甲氧基取代的C1-C4烷基或C5-C6环烷基)，

-OCH(R″)O(CO)OR′或OCH(R″)O(CO)R′基团，R′和R″如上限 定(特别地，R′和/或R″表示任选地被甲氧基取代的C1-C4烷基 或C5-C6环烷基或者R″表示氢原子)，

-OCH(CH₂OCOR′)₂或OCH₂-CH(OCOR′)-CH₂OCOR′三酸甘油 酯基团，其中在这些基团的每一个中R′如上限定，

-糖苷基，例如D-葡萄糖，

-OCH₂CH₂(SO₂)CH₃磺酸酯基团，

-OCH(CH₂OH)₂基团。

特别地，基团OR₄表示OCH(R″)O(CO)OR′或OCH(R″)O(CO)R′ 基团，R′基团表示C1-C4烷基链(特别是乙基)，R″基团表示甲基、 CH(CH₃)₂、环己基或苯基。

根据本发明的第二实施方案，基团R₅表示包含若干个选自氮、硫和 氧的杂原子的5元或6元杂环，其中的2个原子是氮，所述杂环可以被 C1-C6烷基或苯基或苄基取代。

在所述第二实施方案中，所述杂环有利地是任选地被C1-C4烷基链 取代的包含2个氮原子的5元杂环，特别是2-乙基-1，3，4-噻二唑。

本发明特别涉及下列化合物：

1-(2-(1-(2，3-二乙酰氧基丙氧基羰基)-乙基氨基甲酰基)-3-噻吩-3-基 丙基二硫甲基)-3-甲硫基丙胺，

1-(2-(1-(2-甲磺酰基乙氧羰基)-乙基氨基甲酰基)-3-噻吩-3-基丙基 二硫甲基)-3-甲硫基丙胺，

1-(2-(1-(1-乙氧基羰基氧基乙氧基羰基))-乙基氨基甲酰基)-3-噻吩 -3-基-丙基二硫甲基)-3-甲硫基丙胺，

1-(2-(1-乙氧基羰基甲氧基羰基乙基氨基甲酰基)-3-噻吩-3-基-丙基 二硫甲基)-3-甲硫基丙胺，

1-(2-(1-(1-乙氧基羰基氧基乙氧基羰基)-2-羟丙基氨基甲酰基)-3-噻 吩-3-基丙基二硫甲基)-3-甲硫基丙胺，

1-(2-(1-(2-乙酰氧基-1-乙酰氧基甲基乙氧基羰基)-乙基氨基甲酰 基)-3-噻吩-3-基丙基二硫甲基)-3-甲硫基丙胺，

1-(2-(1-(2-羟基-1-羟甲基乙氧基羰基)-乙基氨基甲酰基)-3-噻吩-3- 基丙基二硫甲基)-3-甲硫基丙胺，

1-(2-(1-(3，4，5，6-四羟基四氢吡喃-2-基甲氧基羰基)-乙基氨基甲酰 基)-3-噻吩-3-基-丙基二硫甲基)-3-甲硫基丙胺，

1-(2-(1-(1-乙氧基羰基氧基-乙氧基羰基)-2-羟丙基氨基甲酰基)-3- 苯基丙基二硫甲基)-3-甲硫基丙胺，

1-(2-(1-(2-乙酰氧基-1-乙酰氧基甲基-乙氧基羰基)-2-羟丙基氨基甲 酰基)-3-苯基丙基二硫甲基)-3-甲硫基丙胺，

1-(2-((1-乙氧基羰基氧基-乙氧基羰基甲基)-氨基甲酰基)-3-苯基-丙 基二硫甲基)-3-甲硫基丙胺，

3-(2-氨基-4-甲硫基-丁基二硫基)-2-苄基-N-(5-乙基-(1，3，4)-噻二唑 -2-基)-丙酰胺，

1-(2-((1-乙氧基羰基氧基-2-甲基-丙氧基羰基甲基)-氨基甲酰基)-3- 苯基-丙基二硫甲基)-3-甲硫基-丙胺，

1-(2-((环己基-乙氧基羰基氧基-甲氧基羰基甲基)-氨基甲酰基)-3- 苯基-丙基二硫甲基)-3-甲硫基-丙胺，

1-(2-((乙氧基羰基氧基-苯基-甲氧基羰基甲基)-氨基甲酰基)-3-苯 基-丙基二硫甲基)-3-甲硫基-丙胺，

3-甲硫基-1-(3-苯基-2-((1-丙酰基氧基-乙氧基羰基甲基)-氨基甲酰 基)-丙基二硫甲基)-丙胺，

1-(2-((2-甲基-1-丙酰基氧基-丙氧基羰基甲基)-氨基甲酰基)-3-苯基 -丙基二硫甲基)-3-甲硫基-丙胺，

1-(2-((环己基-丙酰基氧基-甲氧基羰基甲基)-氨基甲酰基)-3-苯基- 丙基二硫甲基)-3-甲硫基-丙胺，

3-甲硫基-1-(3-苯基-2-((苯基-丙酰基氧基-甲氧基羰基甲基)-氨基甲 酰基)-丙基二硫甲基)-丙胺。

式(I)化合物能够具有2～9个不对称中心。引入基团R₁、R₂和R₃， 以得到与通过酶活性识别的立体化学相对应的光学纯的链。基团R₄任 选地含有未拆分的不对称中心。

通过以下步骤得到式(I)化合物：

1)在THF(四氢呋喃)溶液中，通过甲氧基羰基磺酰氯，使氨基官能 团被叔丁氧羰基(Boc)保护的β-氨基硫醇(II)与硫醇酸(III)缩合，得到 IV。

根据本领域技术人员已知的方法(J.Med.Chem.，35，(1992)1259)， 由相应的具有绝对构型S的商用Boc氨基酸制备Boc β-氨基硫醇II，并 保持构型。

由相应的丙二酸单甲酯V得到硫醇酸III，根据本领域技术人员已 知的方法(Ber.，57，(1924)，1116)将丙二酸单甲酯V转化为丙烯酸酯VI。

将硫代乙酸加到丙烯酸酯VI中，得到外消旋衍生物VII (Biochemistry，16，(1977)，5484)。通过α-胰凝乳蛋白酶拆分，分离出光 学纯的乙酰基硫代羧酸VIII(Bioorg.Med.Chem.Let，3，(1993)，2681)。 碱性水解该硫酯得到化合物III。

2)通过以下合成路线可以得到式(I)化合物，其中基团R₅表示 CH(R₃)-COOR₄基团。

2.1)在常规肽偶联条件下使不对称的二硫化物IV与氨基酯IX偶联， 得到保护的抑制剂X。

根据替代的方法，通过利用甲氧基羰基亚磺酰基氯使Boc-β-氨基硫 醇II与式XI的巯基酰基氨基酯缩合，可以得到化合物X。

由化合物III制备巯基酰基氨基酯XI。通过乙醇碘溶液将化合物III 氧化成二硫化物XII。在常规肽偶联条件下，使化合物XII与氨基酯IX 偶联，得到XIII。用还原剂(例如3N Zn+HCl混合物)处理XIII，释放 化合物XI。

在甲酸作用下脱去X的N-端Boc基团，释放XIV。通过以下步骤定 量地改变XIV的反离子：用一当量0.1M NaHCO₃处理，在具有游离氨 官能团的化合物的有机介质(EtOAc)中萃取，然后加入一当量所选的有 机酸或无机酸以得到I。

2.2)通过以下步骤得到氨基酯IX：使Boc氨基酸XII与醇R₄OH缩 合，然后通过三氟乙酸(TFA)脱保护并通过纯碱(soda)中和。如果醇 R₄OH是伯醇，则在常规条件下进行与XII的偶联(1-[3-(二甲基氨基)丙 基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、1-羟基苯并三唑水合物(HOBt)或活 化酯)。如果醇R₄OH是仲醇，则通过Mitsunobu反应(Synthesis(1981) 1-28)，利用偶氮二羧酸二乙酯/三苯基膦(DEAD/PPhe₃)的混合物进行缩 合。

醇R₄OH在大多数情况下是商用化合物。当R₄OH是导致酯“级联 (cascade)”的醇时，其由在文献中描述的方法合成。

2a)通过以下合成路线可以得到式(I)化合物，其中基团R₅表示杂环基 团，例如如上限定的。

2.a.1)

在常规肽偶联条件下，使不对称的二硫化物IV与氨基杂环XV偶 联，得到XVI。如上进行Boc基团的脱保护，得到衍生物XVII。

根据文献中描述的方法合成氨基杂环XV。

例如，如描述的(Takatori等，Yakugaku Zasshi 79，1959，913)，通过 使氨基硫脲XVIII和丙酰氯XIX的缩合得到2-氨基-5-乙基-(1，3，4)噻二 唑XVa。

2.a.2)

根据替代方法，通过使杂环XV缩合到化合物XII上以得到XX，可 以得到式(1)化合物，其中基团R₅表示杂环。在切断二硫化物桥之后， 如上所述，使所得化合物XXI缩合到II上，以得到XVI。

本发明的目的之一还涉及一种药物组合物，该组合物包含作为活性 成分的至少一种通式(I)的化合物或其盐或其盐的水合物以及一种或更 多种药学可接受的惰性载体或其它赋形剂。这些化合物表现出吗啡类物 质的性质，尤其是镇痛，包括外周部分(炎性、神经性)，对行为具有有 益作用，特别是在抑郁和/或焦虑的情况下，而不表现出吗啡类物质的 主要缺点(耐受性、依赖性、呼吸抑制、便秘)。

因此，与同δ受体相互作用的外源性阿片样激动剂相反，本发明的 混合抑制剂具有抗抑郁作用，但没有引发癫痫样行为或惊厥的危险，并 且它们是快速作用的(Baamonde A.等，1992，Jutkiewicz E.M.等，2005)。 这些化合物可以通过血脑屏障。因此，根据本发明的化合物主要应用在 镇痛、抗抑郁和抗焦虑领域中。

本发明的药物组合物例如可以是通过口、鼻(通过气雾剂施用)、舌 下(经舌扩散施用)、直肠、肠胃外、静脉内和经皮途径施用的组合物。 经口途径施用的组合物的实例包括片剂、明胶胶囊、颗粒、微球、粉末 和口服溶液或混悬液。基团R₅赋予根据本发明的化合物足够的亲水性， 因此根据本发明的化合物在不存在各种表面活性剂的情况下可溶于水 和亲水性溶剂。尤其是，本发明的化合物可溶于醇/聚山梨醇酯 (polysorbate)/水溶剂，特别是乙醇//水、和甘露醇/水，或者 在适于施用于人的环糊精的协助下，其常常用于通过静脉内途径施用。 因此可以通过静脉内途径施用根据本发明的组合物。本发明的组合物也 可以通过口或鼻途径施用，特别是通过气雾剂或经舌扩散或在合适的草 药制剂(微乳剂)内施用。同样地，这些组合物可以用于透皮施用。这些 组合物尤其可以用作主要的镇痛药(用于炎性疼痛和神经性疼痛的强效 镇痛药)和抗抑郁药。

非常有利的是，可以经口或鼻途径以气雾剂(微乳)的形式或者经静 脉内途径施用根据本发明的组合物。因此这些施用途径允许通过非消化 途径施用本发明的组合物。当所述组合物包含互补化合物例如大麻素衍 生物时是特别有利的，该互补化合物可能对消化系统(特别是肠)表现出 不希望的作用。这还增加化合物或组合的脑部生物可利用度。

本发明的另一个目的是如上限定的化合物或通过上述方法得到的 化合物作为药物的用途。

出人意料地，还注意到，根据本发明的新型化合物与大麻素衍生物 的组合产生甚至更强的镇痛效果(优于观察到的每种化合物，即根据本 发明的化合物或大麻素衍生物的效果的总和)。

直到1954年，大麻一直被视为表现出多种特性的药用植物：镇痛、 镇痉、抗惊厥、抗炎、镇吐、支气管扩张、血管扩张、弛缓和催眠。最 近，表现出抗增殖和抗神经变性的性质。

已经描述了通常与施用过量有关的大麻的几种有害作用：抑郁患者 的焦虑发作和当在饮品(茶)或食物(蛋糕)中消耗产品时的幻觉。

通过大麻对大麻素受体的作用来说明大麻的作用。这些受体存在于 许多脑结构中，并且已经鉴定了与受体天然相关的内源性分子，花生四 烯酸乙醇胺(anandamide)。

已经表征了两种类型的受体：在中枢神经系统及外周发现的CB1 受体、和主要在外周的CB2受体。CB1受体似乎与调节脑中的兴奋性 或抑制性神经递质的神经元释放有关。CB2受体的作用不太清楚，但是 似乎它们干涉免疫系统的调节。

与CB1和CB2受体相关的内源性分子称为“内源性大麻素”，例如 花生四烯酸乙醇胺，其通过诱导多种药理作用与脑内和外周内的大麻素 受体相互作用。

存在于大麻(Cannabis sativa)中的最大量的精神药物化合物是Δ⁹四 氢大麻酚(Δ⁹THC)。

Δ⁹THC由于与脑CB1受体相互作用而诱导多种药理反应，例如镇 痛、低体温、运动行为减少以及丧失警惕性和注意力。这些特性中的一 些对于治疗疼痛和青光眼以及减轻用具有严重副作用的抗肿瘤和抗病 毒化合物治疗的患者的恶心和刺激食欲具有有利的治疗用途。Δ⁹THC， 更通常是CB1受体激动剂，还能减轻与多发性硬化有关的疼痛作用， 同时延缓疾病的发展。然而，这导致开发了SATIVEX，SATIVEX是一 种直接源于植物(大麻)的制剂，其含有等份的Δ⁹THC和大麻二酚(存在 于该植物中的另一种物质)的混合物。该制剂目前处于临床试验的末期。 然而，经口颊(orobuccal)途径施用的剂量高且已经观察到副作用 (Current Opinion in Investigational Drugs 2004，5，748)。

内源性大麻素(花生四烯酸乙醇胺)体系的另一个特征涉及该特异性 神经递质的合成方式和分泌方式。通过酶途径由细胞器膜磷脂形成的花 生四烯酸乙醇胺通过转运体由突触后神经元分泌，以与位于突触前末端 上的CB1受体相互作用(逆向神经传递)(Piomelli等，TIS，2000，21， 218-224)。

然而，通过长期暴露于天然或合成大麻素产生的几种行为效果(例 如丧失警惕性和注意力、镇静、共济失调、视觉障碍、心动过速、低体 温和行为障碍例如幻觉、焦虑、惊恐发作和记忆障碍)限制它们的临床 应用(综述于E.A.Carlini，The good and the bad effects of (-)trans-delta-9-tetrahydrocannabinol Δ⁹THC on humans，Toxicon，2004， 44，461-467中)。此外，在人类中，在接近于导致上述有害作用的量的 高剂量时得到Δ⁹THC的镇痛效果(Campbell F.A.等，Are cannabinoids an effective and safe treatment option in management of pain？A quantitative systemic review，Br.Med.J.，2001，323，12-16)。

出人意料地，已经注意到，共施用(同时或时间错开)低剂量的大麻 素衍生物(特别是Δ⁹THC)能够增强根据本发明衍生物(式(I))的镇痛作 用和抗抑郁作用，而不会明显引起所述大麻素的有害作用，通过静脉内 (iv)途径施用时有害作用似乎在4-5mg/kg时开始出现(镇静)。

在本发明中，表述“非常低的大麻素浓度”表示大麻素浓度低于导致 所述不希望副作用的那些浓度。

在本发明中，表述“大麻素”表示Δ⁹THC、合成的CB1受体激动剂 或花生四烯酸乙醇胺降解抑制剂。引入到根据本发明的组合物中的大麻 素优选为Δ⁹THC。

本发明的目的之一还涉及一种药物组合物，该药物组合物包含至少 一种如上限定的式(I)化合物、至少一种大麻素衍生物(特别是Δ⁹THC) 或其代谢保护物(综述于Piomelli等，TIPS，2000中)和药学合适的赋形 剂，尤其是适于通过口、鼻、静脉内或经皮途径施用的赋形剂。

本发明还涉及至少一种大麻素衍生物，尤其是Δ⁹THC，在药物组 合物中增强如上限定的式(I)化合物的镇痛和/或抗抑郁作用的用途。

本发明还涉及至少一种如上限定的式(I)化合物和至少一种大麻素 衍生物(尤其是Δ⁹THC)的组合在制备用于治疗抑郁和疼痛的药物中的 用途。

本发明的另一个目的是一种作为用于同时、分开或交错使用的组合 产品的包含以下组分的药物组合物：

i)至少一种如上限定的式(I)化合物，

ii)至少一种大麻素衍生物。

同样地，本发明的目的之一还涉及一种作为用于同时、分开或交错 使用的组合产品的包含以下组分的药物组合物在制备用于治疗抑郁和 疼痛的药物中的用途：

i)至少一种如上限定的式(I)化合物，

ii)至少一种大麻素衍生物。

在本发明的范围内，术语“疼痛”表示各种类型的疼痛，例如急性疼 痛、炎性疼痛和神经性疼痛，包括与多发性硬化相关的疼痛。任选地与 大麻素衍生物组合的根据本发明的化合物还适于治疗青光眼。

本发明的目的之一还涉及根据本发明的新型化合物与吗啡或其衍 生物的组合。实际上，吗啡也能够增强由根据本发明的化合物引起的镇 痛作用。

因此，本发明的目的之一为一种药物组合物，该药物组合物包含至 少一种如上限定的式(I)化合物、吗啡或吗啡的衍生物和药学合适的赋形 剂，尤其是适于通过口、鼻、静脉内或经皮途径施用的赋形剂。该组合 物还可以包含至少一种大麻素衍生物(特别是Δ⁹THC)或其代谢保护物。

该组合物可以用作药物，尤其是用于治疗抑郁和疼痛的药物。多种 化合物可以以同时、分开或交错的方式用作组合产品。

根据本发明的式I化合物的良好的水可溶性极大地有利于适于通过 静脉内、鼻、肺(气雾剂)或经皮途径施用的用于治疗的制剂(微乳液，在 表面活性剂存在下的溶液中等)的构建。

本发明化合物的有效剂量随多种参数变化，例如所选的施用途径； 患者的体重、年龄和性别；待治疗病状的阶段；和患者的感受性。因此， 将由相关专家根据认为相关的参数确定最佳剂量。

在下面的实施例中将进一步举例说明本发明，但不以任何方式限制 本发明。表1列出根据实施例12制备的化合物的列表。对于在这些实 施例中公开的所有化合物：

-R₁表示-CH₂-CH₂-S-CH₃基

-CH₂-(C:CH.S.CH:CH)表示噻吩-3-基甲基

-C:CH.CH:CH-CH:CH表示苯基，

-C₆H₁₁表示环己基。

表1：实施例12a～12r的基团。

附图说明

图1：通过iv途径向小鼠注射吗啡或化合物15引起的镇痛的剂量/ 反应曲线(热板试验，52℃)；X轴：以mg/kg计的剂量，Y轴：镇痛％。 黑线(上)对应于由吗啡得到的结果，灰线(下)对应于由化合物15得到的 结果。

图2：

A)通过在热板试验(52℃，跳跃潜伏期，秒)前20分钟向雄性OF1 小鼠(n＝10)经口注入化合物15引起的抗伤害反应；X轴：以mg/kg计 的化合物15的剂量，Y轴：镇痛％。

B)经口施用后化合物15的效果动力学(n＝10～17)；X轴：时间(分 钟)，Y轴：镇痛％。

图3：通过化合物15和Δ⁹-四氢大麻酚的组合诱导的抗伤害反应。热 板(52±1℃)，跳跃潜伏期，雄性OF1小鼠。Cuff-off：240秒。^＊＊＊相对 于对照组p＜0.001，###相对于化合物15和Δ⁹THC p＜0.001。ANOVA+ Newman-Keuls。X轴：化合物15(0.4mg/kg)、THC(0.375mg/kg)以及化 合物15/THC(0.4和0.38mg/kg)的剂量，Y轴：镇痛％。

具体实施方式

实施例1：Boc蛋氨酸硫醇(methioninethiol)(化合物1)的合成

按照J.Med.Chem.，35，1992，2473中记载的方案制备该化合物。白 色固体：mp：37℃；Rf(环己烷(CHex)：乙酸乙酯(AcOEt)＝1.1)0.73； α_D^20℃：-21.1°(c＝1.0CHCl₃)。

实施例2：(2S)-2-巯基甲基-3-苯基丙酸(化合物2)的合成

步骤1.根据(Ber.，57，1924，1116)通过硫代乙酸对相应丙烯酸酯的甲 酯的作用得到2-乙酰基硫甲基-3-苯基丙酸甲酯，并根据(Bioor.Med. Chem.Let.，3，1993，2681)中记载的通用方案用α-胰凝乳蛋白酶处理2- 乙酰基硫甲基-3-苯基丙酸甲酯。

产率：71.4％；对映体过量(ee)：88％，α_D^20℃：-42.7°。

步骤2.(2S)-巯基甲基-3-苯基丙酸。将步骤1的化合物溶于0℃的 脱气甲醇(MeOH)中。在惰性气氛下，加入3当量(eq)的1N纯碱(NaOH)。 在室温(RT)下搅动混合物30分钟。通过加入6N盐酸(HCl)(25ml)酸化 混合物，减压蒸发MeOH。用2×125ml AcOEt萃取水相。用饱和氯化 钠溶液(饱和NaCl)洗有机相，然后用硫酸钠(Na₂SO₄)干燥并蒸发至干。 得到黄色油。

产率为100％。Kromasil C18 HPLC CH₃CN/H₂O(0.5％三氟乙酸酯 TFA)60-404.96分钟。

实施例3：(2RS)2-巯基甲基-3-噻吩-3-基丙酸(化合物3)的合成

步骤1：用Dean-Stark装置，在270ml甲苯中回流丙二酸二甲酯(392 mmol，45ml，1当量)、噻吩-3-基醛(0.357mmol)、哌啶(1.87ml；0.05当 量)和苯甲酸(4.58g；0.05当量)的混合物12h。用2×140ml的1N HCl、 2×140ml 10％碳酸钠(NaHCO₃)和140ml饱和NaCl清洗有机相。用 Na₂SO₄干燥有机相并蒸发至干。得到油。

产率为100％。Kromasil C18 HPLC CH₃CN/H₂O(0.5％TFA)60-40： 5.97分钟。

步骤2：将步骤1的化合物(340mmol)溶于MeOH(540ml)中。将 混合物冷却到0℃并逐渐加入硼氢化钠(NaBH₄)。在室温下搅拌混合物 15分钟。通过加入450ml 1N HCl猝熄反应。蒸发甲醇并用2×500ml 氯仿(CHCl₃)萃取反应混合物。用饱和NaCl洗有机相，然后用Na₂SO₄干燥并蒸发至干。得到油。

重量＝64.1g。产率为82.4％。

Kromasil C18HPLC CH₃CN/H₂O(0.5％TFA)60-40：5.91分钟。

步骤3：将前述化合物(30mmol)溶于MeOH(27ml)中。将混合物 冷却到0℃并逐渐加入苛性KOH(1.71g 30.6mmol)在MeOH(365ml) 中的溶液中。在4℃下搅动混合物48h。蒸发甲醇并在乙醚Et₂O中研 磨所得固体。过滤所得固体、清洗并干燥。W＝25.2g。产率为71.0％。

Kromasil C18HPLC CH₃CN/H₂O(0.5％TFA)60-40：3.79分钟。

步骤4：将前述化合物(21.9mmol)溶于THF(30ml)中。加入二乙胺 Et₂NH(3.0ml；2当量)和37％甲醛(3.7ml；1.5当量)。混合物回流过夜。 蒸发THF并在90ml AcOEt中处理混合物。用3×30ml 1N HCl、饱和 NaCl洗有机相，然后用Na₂SO₄干燥并蒸发至干。得到无色油。

W＝13.1g。产率为72.0％。

Kromasil C18HPLC CH₃CN/H₂O(0.5％TFA)50-50：14.75分钟。

步骤5：在硫代乙酸CH₃COSH(10ml，144mmol，2当量)中将前述 化合物(72mmol)加热到80℃，并保持5h。减压蒸发硫代乙酸。用环 己烷共蒸发混合物数次。得到橙色油。W＝18.6g。产率为100％。

Kromasil C18HPLC CH₃CN/H₂O(0.5％TFA)50-50：17.16分钟。

步骤6：将步骤5的化合物溶于0℃下的脱气MeOH中。在惰性 气氛下，加入3当量1N NaOH。在RT下搅动混合物30分钟。通过 加入6N HCl(25ml)酸化混合物并减压蒸发MeOH。用2×125ml AcOEt 萃取水相。用饱和NaCl洗有机相，然后用Na₂SO₄干燥并蒸发至干。 得到黄色油。

产率为100％。Kromasil C18 HPLC CH₃CN/H₂O(0.5％TFA)50-50 6.80分钟。

实施例4：(2S)-2-巯基甲基-3-噻吩-3-基丙酸(化合物4)的合成

步骤1：如在合成2(步骤1)中所描述的，用α-胰凝乳蛋白酶处理在 化合物3的合成步骤5中描述的2-乙酰基硫甲基-3-噻吩-3-基丙酸甲酯。 产率为87.3％。Kromasil C18 HPLC CH₃CN/H₂O(0.5％TFA)50-50 7.37 分钟。ee＝76％

步骤2：如在化合物2的步骤2中所描述的，处理在步骤1中得到 的(2S)乙酰基硫甲基-3-噻吩-3-基丙酸。产率为97.0％。Kromasil C18 HPLC CH₃CN/H₂O(0.5％TFA)50-50 6.80分钟。

实施例5：2(2S)-苄基-3-((2S)2-叔丁氧羰基氨基-4-甲硫基-丁基二硫基)- 丙酸(化合物5)的合成

在氮气下，将23ml MeOH和23ml THF的混合物冷却到0℃，并 加入氯磺酰氯(1.3ml，15.25mmol，1.09当量)。在0℃下搅动混合物15 分钟，以得到甲氧基碳基亚磺酰氯。然后，一次性加入在16ml THF/MeOH中的化合物1(14.86mmol，1.06当量)。使混合物回到室温 并搅动30分钟。在Et₃N(1当量)存在下，将前述溶液滴加入化合物 2(14.02mmol，1当量)在100ml脱气CHCl₃中的溶液中。在室温下搅动 溶液1h。减压蒸发溶剂。在二氯甲烷CH₂Cl₂中处理混合物。用10％柠 檬酸、饱和NaCl洗有机相，然后用Na₂SO₄干燥，以得到粗产物，用 环己烷(CHex)/AcOEt为8/2、然后6/4的混合物作为洗脱剂在二氧化硅 上色谱分离。W＝4.1g。产率：65.9％。Kromasil C18 HPLC CH₃CN/H₂O (0.5％TFA)70-30：8.20分钟。

实施例6：3-((2S)2-叔丁氧羰基氨基-4-甲硫基-丁基二硫基)-(2RS)2-噻吩 -3-基甲基-丙酸(化合物6)的合成

按照合成5所描述的方案并用化合物3替代化合物2，得到化合物 6。产率：77.0％。Kromasil C18 HPLC CH₃CN/H₂O(0.5％TFA)70-30： 7.36分钟。

实施例7：3-((2S)2-叔丁氧羰基氨基-4-甲硫基-丁基二硫基)-(2S)2-噻吩 -3-基甲基-丙酸(化合物7)的合成

按照合成5所描述的方案并用化合物4替代化合物2，得到化合物 7。产率：77.0％。Kromasil C18 HPLC CH₃CN/H₂O(0.5％TFA)70/30： 7.36分钟。

实施例8：丙氨酸酯的合成

化合物8a：丙氨酸-2-甲磺酰基乙酯，TFA。

在1.2当量的2-甲磺酰基乙醇在CH₂Cl₂中的溶液的存在下，在室温 下搅动1当量的BocAlaOH、HOBt(1.2当量，879mg)、EDCI(1.2当量， 1.93g)、Et₃N(三乙胺)(3当量，2.9ml)在10ml CH₂Cl₂的溶液12h。减 压蒸发溶剂。在AcOEt/H₂O中处理反应混合物。用10％柠檬酸(2×15 ml)、10％NaHCO₃(2×15ml)、饱和NaCl洗有机相，用Na₂SO₄干燥并 减压蒸发以得到粗产物，用CHex/AcOEt为8/2的混合物作为洗脱剂在 二氧化硅上色谱分离，以得到989mg产物。

产率：61.8％。Rf(CHex/AcOEt：6/4)：0.49。

将435mg(1.488mmol)该产物冷溶于2.5ml CH₂Cl₂中并加入1.2 ml TFA。在室温下搅动混合物2h。减压蒸发溶剂。共蒸发混合物与环 己烷。在Et₂O中冷沉淀产物8a。

产率：100％。Rf(CH₂Cl₂/MeOH：9/1)：0.25。

化合物8b：丙氨酸2，3-二乙酰氧基丙酯。

在CH₂Cl₂中的2，3-二乙酰氧基丙醇(根据Jensen，Topics in Lipid Chemistry，1972，3，1制备)存在下，在室温下搅动1.026g(5.428mmol，1 当量)BocAlaOH、HOBt(1.2当量，879mg)、EDCI(1.2当量，1.93g)、 Et₃N(3当量，2.9ml)在10ml CH₂Cl₂中的溶液12h。减压蒸发溶剂。在 AcOEt/H₂O中处理反应混合物。用10％柠檬酸(2×15ml)、10％ NaHCO₃(2×15ml)、饱和NaCl洗有机相，用Na₂SO₄干燥，并减压蒸发 以得到1.62g粗产物。用CHex/AcOEt为8/2的混合物作为洗脱剂在二 氧化硅上色谱分离混合物，以得到1.29g产物。

产率：68.7％。Kromasil C18 HPLC CH₃CN/H₂O(0.5％TFA) 70-30：4.25分钟。

将该产物冷溶于6ml CH₂Cl₂中并加入6ml TFA。在室温下搅动 混合物2h。减压蒸发溶剂。共蒸发混合物与环己烷。在Et₂O中冷沉淀 产物8b。W＝1.33g。产率：100％。Rf(CHex，EtOAc：6.4)：0.14。

化合物8c：丙氨酸1，3-二乙酰氧基-2-丙酯，TFA。

将1.23g的1，3-二乙酰基-2-丙醇(根据Bentley和McCrae，J.Org. Chem.，1971，35，2082制备)(7mmol，1.1当量)溶于50ml Et₂O中。然后， 加入偶氮二羧酸二乙酯(DEAD)(1.2当量，1.1ml)、Boc丙氨酸(5.83mmol， 1当量)，随后加入三苯基膦(PPh₃)(1.2当量，1.83g)，在室温下搅动混合 物过夜。减压蒸发溶剂。用庚烷/AcOEt为8/2的混合物作为洗脱剂在二 氧化硅上色谱分离混合物，以得到2.14g产物。产率：84.6％。Rf (Hept/AcOEt：6/4)：0.42。

将2.0g(4.7mmol)该产物冷溶于6.5ml CH₂Cl₂中并加入6.5ml TFA。在室温下搅动混合物2h。减压蒸发溶剂。共蒸发混合物与环己 烷，并用CH₂Cl₂/MeOH/AcOH为9/1/0.5的混合物作为洗脱剂在二氧化 硅上进行色谱分离，以得到1.16g化合物8c。

产率：65％。Rf(CH₂Cl₂/MeOH/AcOH：9/1/0.5)：0.22。

化合物8d：丙氨酸1，3(叔丁基二甲基甲硅烷基)羟基-2-丙酯。

将二羟基丙酮(2g，11.10mmol)溶于50ml二甲基甲酰胺(DMF) 中，加入叔丁基二甲基甲硅烷基氯(tBuDMSCl)(4.8当量，8.03g)和咪唑 (10当量，7.56g)，并在20℃下搅动混合物12h。将混合物蒸发至干， 在150ml AcOEt中处理。用水H₂O(2×50ml)、10％HCl(2×50ml)、饱 和NaCl洗有机相，然后用Na₂SO₄干燥，并减压蒸发以得到20.1g粗 产物。用CHex/AcOEt为8/2的混合物作为洗脱剂在二氧化硅上色谱分 离混合物，以得到以得到5.96g产物。产率：84.5％。Rf (CH₂Cl₂/MeOH/AcOH：9/1/0.5)：0.24。

将该产物(8.82g，27.73mmol)溶于THF(74ml)和H₂O(4.8ml)中。 将混合物冷却到5℃并逐渐加入NaBH₄(965mg，1当量)。在5℃下搅 动混合物30分钟。通过加入乙酸(1ml)除去过量的NaBH₄。减压蒸发 THF并在CHCl₃/H₂O中处理混合物。用H₂O(2×50ml)、饱和NaHCO₃(2×50ml)、饱和NaCl洗有机相，然后用Na₂SO₄干燥，并减压蒸发以 得到8.24g产物。产率：93.0％。

将2.93g该化合物(9.07mmol，1.1当量)溶于60ml Et₂O中。在 室温下搅动混合物，加入DEAD(1.2当量，1.56ml)、氨基Boc酸(8.25 mmol，1当量)，随后加入PPh₃(1.2当量，2.59g)。减压蒸发溶剂。用 CHex/AcOEt为95/5的混合物作为洗脱剂在二氧化硅上色谱分离混合 物，以得到4.42g产物。

产率：92.9％。Rf(CHex/AcOEt：9/1)：0.65。

将881mg(1.79mmol)该产物冷溶于3ml CH₂Cl₂中并加入1.36ml TFA。在室温下搅动混合物2h。减压蒸发溶剂。共蒸发混合物与环己 烷。在Et₂O中冷沉淀混合物，以得到920mg化合物8d。

产率：100％。Rf(CHex/AcOEt：9/1)：0.1。

化合物8e：丙氨酸乙氧基甲酰基甲酯，TFA。

将BocAlaOH(5g，26.4mmol)和Et₃N(3.7ml，1当量)溶于40ml AcOEt中。在室温下搅动混合物10分钟。加入溴乙酸乙酯(6.62g，1.5 当量)并回流混合物30分钟。过滤沉淀，然后将30ml H₂O和50ml AcOEt加到滤液中。用3×30ml AcOEt萃取水相。用10％柠檬酸(2×30 ml)、10％NaHCO₃(2×30ml)、饱和NaCl洗有机相，然后用Na₂SO₄干 燥，并减压蒸发以得到7.09g粗产物。用CHex/AcOEt为6/4的混合物 作为洗脱剂在二氧化硅上色谱分离混合物，以得到4.68g产物。

产率：64.3％。Rf(CHex/AcOEt：6.4)：0.35。

将500mg(1.81mmol)该产物冷溶于3ml CH₂Cl₂中，并加入1.4ml TFA。在室温下搅动混合物2h。减压蒸发溶剂。混合物与环己烷共蒸 发。在Et₂O中冷沉淀产物8e。

W＝525mg。产率：100％。Rf(CH₂Cl₂/MeOH：95/5)：0.14。

化合物8f：乙基碳酸酯-1-乙基丙氨酸酯，TFA

将Boc Ala(76.54mmol)和Et₃N(12.27ml，1.2当量)溶于70ml AcOEt中。在室温下搅动混合物15分钟。加入碳酸乙基-1-氯乙基酯(根 据Barcelo等，Synthesis，1986，627制备)(14.01g，1.2当量)和碘化钠 NaI(926mg，0.1当量)，回流混合物16h。过滤沉淀，然后将200ml H₂O 和200ml AcOEt加到滤液中。用3×300ml AcOEt萃取水相。用10％ 柠檬酸(2×150ml)、10％NaHCO₃(2×150ml)、饱和NaCl洗有机相，然 后用Na₂SO₄干燥，并减压蒸发以得到24.5g粗产物。用CHex/AcOEt 为9/1的混合物作为洗脱剂在二氧化硅上色谱分离混合物，以得到18.1 g产物。

产率：77.51％。Rf(CH₂Cl₂/MeOH：9/1)：0.33。

将9.15g(30mmol)该产物冷溶于23ml CH₂Cl₂中，并加入23ml TFA。在室温下搅动混合物2h。减压蒸发溶剂。共蒸发混合物与环己 烷。在Et₂O中冷沉淀产物8f。

W＝9.57g。产率：77.5％(2步)。Rf(CHex/AcOEt：6/4)：0.1。

化合物8g：丙氨酸葡糖基酯，TFA。

在0℃下将五氯苯酚(3当量，10g，37.54mmol)溶于12ml AcOEt 中，并加入N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)(2.58g，12.51mmol)。在-20℃ 下静置混合物12h。将冷己烷(10ml)加到混合物中，过滤固体并用冷己 烷洗。在己烷中重结晶固体，以得到10.3g棕色固体。产率：82.0％。 Mp：115-130℃。

将该混合物加到120ml AcOEt中。全部溶解后，加入Boc丙氨 酸(1.0当量，10.25mmol)，在室温下搅动混合物过夜。减压蒸发溶剂， 然后加入100ml Et₂O。冷却悬浮液1h，然后过滤固体。将后者悬浮在 100ml二氧六环中、过滤并用2×20ml二氧六环清洗。将滤液蒸发至干。 再用二氧六环处理残留物以除去二环己基脲(DCU)。然后将其悬浮在 100ml Et₂O中，并置于冷冻器中过夜。过滤固体，然后干燥以得到1.29 g棕色固体。产率：27.8％。

将葡萄糖(3当量，1.54g)在57ml重蒸吡啶中的溶液加到前述化合 物和咪唑中。在室温下搅动混合物过夜。减压蒸发溶剂以得到粗产物。 用AcOEt/AcOH为20/1的混合物作为洗脱剂在二氧化硅上色谱分离混 合物，以得到883mg产物。产率：88.3％。Rf(AcOEt/AcOH：20/1)：0.13。

将883mg(2.51mmol)该产物冷却到0℃，并加入61ml TFA。在 0℃下搅动混合物5分钟，然后在室温下搅动30分钟。减压蒸发TFA。 共蒸发混合物与环己烷。在Et₂O中冷沉淀混合物，以得到746mg棕色 化合物8g。

产率：81.3％。Rf(AcOEt/AcOH：10/1)：0.10。

实施例9：合成苏氨酸酯

化合物9a：苏氨酸1，3-二乙酰基-2-丙酯，TFA。

按照用于8c的方案，用Boc-苏氨酸替代Boc-丙氨酸，得到该化 合物。

化合物9b：乙基碳酸酯-1-乙基苏氨酸酯，TFA。

按照对于化合物8f所描述的方案，用Boc-苏氨酸替代Boc-丙氨 酸，得到该化合物。

产率：89.7％。Rf(CHex/AcOEt：6/4)：0.1。

实施例10：合成甘氨酸酯

化合物10a：乙基碳酸酯-1-乙基甘氨酸酯，TFA。

按照对于化合物8f所描述的方案，用Boc-甘氨酸替代Boc-丙氨 酸，得到该化合物。

产率：92％。Rf(CHex/AcOEt 8/2)0.22。

化合物10b：乙基碳酸酯1-(2-甲基)丙基甘氨酸酯，TFA。

按照对于化合物10a所描述的方案，用碳酸乙基-1-氯-2-甲基-丙 基酯替代碳酸乙基-1-氯乙基酯，得到该化合物。

产率：88％Rf(CHex/AcOEt 8/2)0.12。

化合物10c：乙基碳酸酯甲基环己基甘氨酸酯，TFA。

按照对于化合物10a所描述的方案，用碳酸乙基-氯甲基环己基酯 替代碳酸乙基-1-氯乙基酯，得到该化合物。

产率：78％；Rf(CHex/AcOEt 7/3)0.31。

化合物10d：乙基碳酸酯甲基苯基甘氨酸酯，TFA。

按照对于化合物10a所描述的方案，用碳酸乙基氯甲基苯基酯替 代碳酸乙基-1-氯乙基酯，得到该化合物。

产率：82％；Rf(CHex/AcOEt 7/3)0.46。

化合物10e：丙酸1-(2-氨基-乙酰氧基)-乙酯 (Gly-OCH(CH₃)O-COEt)。

通过在NaI(0.2当量)和Et₃N(1.2当量)存在下、在乙酸乙酯(10 ml/mmol)中回流过夜缩合Boc-Gly和丙酸-1-氯乙酯(1.1当量)，得到该 化合物。冷却后，用水、10％柠檬酸、10％NaHCO₃、H₂O、饱和NaCl 洗有机相，并用Na₂SO₄干燥。蒸发后，得到油状产物。产率：86％。

如在前述实施例中所描述的，使Boc基团脱保护。白色固体产物， 定量的产率。

Rf(CHex/AcOEt 6/4)0.64。

化合物10f：丙酸1-(2-氨基乙酰氧基)-2-甲基丙酯 (Gly-OCH(CH(CH₃)₂)O-COEt)。

按照在实施例10e中所描述的方案，用丙酸1-氯-2-甲基丙酯替代 丙酸1-氯乙酯，得到该化合物。白色固体，两步产率：78％。Rf (CHex/AcOEt 6/4)0.56。

化合物10g：丙酸(2-氨基乙酰氧基)-环己基-甲酯 (Gly-OCH(CHex)O-COEt)。

按照在实施例10e中所描述的方案，用丙酸氯甲基(环己基)酯替 代丙酸1-氯乙酯，得到该化合物。

白色固体。两步产率：72％。Rf(CHex/AcOEt 6/4)0.38。

化合物10h：丙酸(2-氨基-乙酰氧基)-苯基-甲酯 (Gly-OCH(Ph)O-COEt)。

按照在实施例10e中所描述的方案，用丙酸氯甲基(苯基)酯替代 丙酸1-氯乙酯，得到该化合物。

白色固体。两步产率：75％。Rf(CHex/AcOEt 6/4)0.42。

实施例11：2-氨基-5-乙基-(1，3，4)噻二唑的合成

在40℃下搅动25g(0.27mol)氨基硫脲和46.6ml丙酰氯(0.54mol， 2当量)的混合物4h。然后真空蒸发过量的丙酰氯，并在醚中研磨残留 物。得到固体产物。该产物包含所希望的噻二唑，通过在乙醇中沉淀除 去杂质。白色固体，33.6g(产率：83％)。Kromasil C18 HPLC Tr(保留 时间)在30％CH₃CN中为6.32分钟。

实施例12：混合抑制剂的合成，其中R₅＝CH(R₃)COOR₄。

将二硫化物5、6或7(0.54mmol)溶于4ml DMF中。将六氟磷酸 苯并三唑-1-基-氧-三-(二甲氨基)-鏻盐(BOP)(1.2当量，1.0g)和二异丙基- 乙基-胺(DIEA)(284μl)加到其中，然后加入氨基酸酯8、9或10(1.3当 量)。在室温下搅动混合物20分钟，然后减压蒸发DMF。在AcOEt中 处理产物。用H₂O、10％柠檬酸、10％NaHCO₃、饱和NaCl洗有机相， 并用Na₂SO₄干燥。在二氧化硅上通过色谱分离纯化粗产物。

将所得的化合物(0.38mmol)溶于640μl CH₂Cl₂中，并加入320μl TFA。在室温下搅动混合物1h。减压蒸发过量的溶剂。共蒸发混合物 与环己烷。通过半制备型HPLC、或在己烷/Et₂O混合物中沉淀来纯化 混合物。

化合物12a：1-(2-(1-(2，3-二乙酰氧基丙氧羰基)-乙基氨基甲酰 基)-3-噻吩-3-基丙基二硫甲基)-3-甲硫基丙基铵三氟乙酸盐(化合物6或 7+化合物8b)。

W：176mg；产率：66.9％。Kromasil C18 HPLC CH₃CN/H₂O (0.5％TFA)40-60：9.07分钟和10.18分钟。ESI：(M+H)⁺＝581。正辛醇/ 水分配系数(Log Kow)＝1.31。

化合物12b：1-(2-(1-(2-甲磺酰基乙氧羰基)-乙基氨基甲酰基)-3-噻 吩-3-基丙基二硫甲基)-3-甲硫基丙基铵三氟乙酸盐(化合物6或7+化合 物8a)。

W：200mg；产率：74.1％。Kromasil C18 HPLC CH₃CN/H₂O (0.5％TFA)40-60：5.0和5.35分钟。ESI：(M+H)⁺＝529。Log Kow＝-0.13。

化合物12c：1-(2-(1-(1-乙氧基羰基氧基乙氧基羰基))-乙基氨基甲 酰基)-3-噻吩-3-基-丙基二硫甲基)-3-甲基硫丙基铵三氟乙酸盐(化合物6 或7+化合物8f)。

W：232mg；产率：71.3％。Kromasil C18 HPLC CH₃CN/H₂O (0.5％TFA)50-50：3.84和4.03分钟。ESI：(M+H)⁺＝509。Log Kow＝1.63。

化合物12d：1-(2-(1-乙氧基羰基甲氧基碳基乙基氨基甲酰基)-3-噻 吩-3-基-丙基二硫甲基)-3-甲硫基丙基铵三氟乙酸盐(化合物6或7+化 合物8e)。

W：261mg；产率：83.9％。Kromasil C18HPLC CH₃CN/H₂O (0.5％TFA)50-50：4.90和5.18分钟。ESI：(M+H)⁺＝539。Log Kow＝1.35。

化合物12e：1-(2-(1-(1-乙氧基羰基氧基乙氧基羰基)-2-羟丙基氨基 甲酰基)-3-噻吩-3-基丙基二硫甲基)-3-甲硫基丙基铵三氟乙酸盐(化合物 6或7+化合物9b)。

W：285mg；产率：47.8％。Kromasil C18 HPLC CH₃CN/H₂O (0.5％TFA)40-60：10.55和11.09分钟。ESI：(M+H)⁺＝594。Log Kow＝0.76。

化合物12f：1-(2-(1-(2-乙酰氧基-1-乙酰氧基甲基乙氧基羰基)-乙 基氨基甲酰基)-3-噻吩-3-基丙基二硫甲基)-3-甲硫基丙基铵三氟乙酸盐 (化合物6或7+化合物8c)。

W：171mg；产率：70.1％。Kromasil C18 HPLC CH₃CN/H₂O (0.5％TFA)40-60：7.35和8.09分钟。ESI：(M+H)⁺＝581。Log Kow＝1.31。

化合物12g：1-(2-(1-(2-羟基-1-羟甲基乙氧基羰基)-乙基氨基甲酰 基)-3-噻吩-3-基丙基二硫甲基)-3-甲硫基丙基铵三氟乙酸盐(化合物6或 7+化合物8d)。

W：166mg；产率：67.2％。Kromasil C18 HPLC CH₃CN/H₂O (0.5％TFA)40-60：2.94和3.27分钟。ESI：(M+H)⁺＝497。Log Kow＝ -0.29。

化合物12h：1-(2-(1-(3，4，5，6-四羟基四氢吡喃-2-基甲氧基羰基)-乙 基氨基甲酰基)-3-噻吩-3-基-丙基二硫甲基)-3-甲硫基丙基铵三氟乙酸盐 (化合物6或7+化合物8g)。

W：85mg；产率：93.2％。Kromasil C18 HPLC CH₃CN/H₂O(0.5％ TFA)50-50：2.34分钟。ESI：(M+H)⁺＝585。Log Kow＝-1.15。

化合物12i：1-(2-((1-(1-乙氧基羰基氧基-乙氧基羰基)-2-羟丙基氨 基甲酰基)-3-苯基丙基二硫甲基)-3-甲硫基丙基铵三氟乙酸盐(化合物5 +化合物9b)。

W：1.88g；产率：83.8％。Kromasil C18 HPLC CH₃CN/H₂O(0.5％ TFA)45-55：7.0分钟。ESI：(M+H)⁺＝563。Log Kow＝0.76。

化合物12j：1-(2-(1-(2-乙酰氧基-1-乙酰氧基甲基-乙氧基羰基)-2- 羟丙基氨基甲酰基)-3-苯基丙基二硫甲基)-3-甲硫基丙基铵三氟乙酸盐 (化合物5+化合物9a)。

W：532mg；产率：53.6％。Kromasil C18 HPLC CH₃CN/H₂O (0.5％TFA)40-60：6.16分钟。ESI：(M+H)⁺＝605。Log Kow＝0.44。

化合物12k：1-(2-(1-乙氧基羰基氧基-乙氧基羰基甲基)-氨基甲酰 基)-3-苯基-丙基二硫甲基)-3-甲硫基丙基铵三氟乙酸盐(化合物5+化合 物10a)。

W：1.76g；产率：89.5％。Kromasil C18 HPLC CH₃CN/H₂O(0.5％ TFA)50-50：5.33分钟。ESI：(M+H)⁺＝519。Log Kow＝1.39。

化合物12l：1-(2-((1-乙氧基羰基氧基-2-甲基-丙氧基羰基甲基)-氨 基甲酰基)-3-苯基-丙基二硫甲基)-3-甲硫基-丙基铵三氟乙酸盐(化合物5 +化合物10b)。

W：1.2g；产率：82.3％。Kromasil C18HPLC CH₃CN/H₂O(0.5％ TFA)50/509.33分钟，ESI：(M+H)⁺＝547。

化合物12m：1-2-((环己基-乙氧基羰基氧基-甲氧基羰基甲基)-氨 基甲酰基)-3-苯基-丙基二硫甲基)-3-甲硫基-丙基铵三氟乙酸盐(化合物5 +化合物10c)。

W：2.1g；产率：65.3％。Kromasil C18 HPLC CH₃CN/H₂O(0.5％ TFA)50/5012.65分钟，ESI：(M+H)⁺＝587。

化合物12n：1-(2-((乙氧基羰基氧基-苯基-甲氧基羰基甲基)-氨基 甲酰基)-3-苯基-丙基二硫甲基)-3-甲硫基-丙基铵三氟乙酸盐(化合物5+ 化合物10d)。

W：0.95g；产率：68.1％。Kromasil C18 HPLC CH₃CN/H₂O(0.5％ TFA)50/5010.86分钟。ESI(M+H)⁺＝581。

化合物12o：3-甲硫基-1-(3-苯基-2-((1-丙酰基氧基-乙氧基羰基甲 基)-氨基甲酰基)-丙基二硫甲基)-丙基铵三氟乙酸盐(化合物5+化合物 10e)。

W：1.6g；产率：81.2％。Kromasil C18 HPLC CH₃CN/H₂O(0.5％ TFA)50/506.82分钟。ESI(M+H)⁺＝502。

化合物12p：1-(2-((2-甲基-1-丙酰基氧基-丙氧基羰基甲基)-氨基甲 酰基)-3-苯基-丙基二硫甲基)-3-甲硫基-丙基铵三氟乙酸盐(化合物5+ 化合物10f)。

W：1.05g，产率：83％。Kromasil C18 HPLC CH₃CN/H₂O(0.5％ TFA)50/508.17分钟。ESI(M+H)⁺＝531。

化合物12q：1-(2-((环己基-丙酰基氧基-甲氧基羰基甲基)-氨基甲 酰基)-3-苯基-丙基二硫甲基)-3-甲硫基-丙基铵三氟乙酸盐(化合物5+ 化合物10g)。

W：1.8g；产率：78.2％。Kromasil C18 HPLC CH₃CN/H₂O(0.5％ TFA)50/5012.24分钟。ESI(M+H)⁺＝571。

化合物12r：3-甲硫基-1-(3-苯基-2-((苯基丙酰基氧基-甲氧基羰基 甲基)-氨基甲酰基)-丙基二硫甲基)-丙基铵三氟乙酸盐(化合物5+化合 物10h)。

W：0.98g；产率：76.3％。Kromasil C18 HPLC CH₃CN/H₂O(0.5％ TFA)50/5011.25分钟。ESI(M+H)⁺＝565。

实施例13：混合抑制剂的合成，其中R₅＝杂环

将二硫化物5、6或7(0.54mmol)溶于5ml CH₂Cl₂中，并连续加 入实施例11的氨基噻二唑(1.2当量)、TBTU(O-苯并三唑-1-基 -N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸盐)(3当量)和DIEA(二异丙基乙基胺)(3当 量)。在室温(约20℃)下搅动混合物30分钟。真空蒸发溶剂，并在乙酸 乙酯中处理残留物。用柠檬酸、水、饱和NaCl洗有机相，并用Na₂SO₄干燥。真空过滤和蒸发后，得到白色固体。

将所得化合物溶于甲酸，并在室温下搅动混合物1h。真空蒸发过 量的甲酸。在醚中处理残留物，得到白色沉淀。

化合物13a：3-(2-氨基-4-甲硫基-丁基二硫基)-2-苄基-N-(5-乙基-(1，3，4) 噻二唑-2-基)-丙酰胺

W＝256mg(产率为75％)。

实施例14：反离子的交换

将实施例12和实施例13的化合物(1mmol)溶于9ml蒸馏过的 AcOEt中。用12ml 0.1N NaHCO₃洗有机相。然后干燥有机相，并减 压蒸发。在AcOEt(3ml)中处理产物，冷却到0℃，并加入1当量的在 3ml AcOEt中的所选AH酸。蒸发溶剂，并在Et₂O/己烷的混合物中冷 沉淀产物。

(A＝磷酸根、盐酸根、乙酸根、甲磺酸根、硼酸根、乳酸根、富 马酸根、琥珀酸根、半琥珀酸根、柠檬酸根、酒石酸根、半酒石酸根、 马来酸根、抗坏血酸根、半富马酸根、己酸根、庚酸根、马尿酸根、氢 化肉桂酸根、苯甲酰甲酸根、烟酸根)。

实施例15：药理学结果-根据本发明的化合物

在以下的各种生物学试验中测试下式的化合物15。

热板试验：该试验涉及小鼠在加热为52℃的板上的舔舐和跳跃 反射(在给定的实施例中测量跳跃潜伏期)。采用以下方程，以最大可能 效应％(MPE％)表示结果，即表示为镇痛百分比：

最大潜伏时间＝240秒。

结果以平均值±SEM表示。当p值小于0.05时，认为所观察到的 差异显著。所用的检验是具有多重比较检验的ANOVA检验。

a)在热板试验(52℃，反应/跳跃)中，在通过静脉内(IV)途径将化 合物15注入雄性小鼠(n＝10)后，观察抗伤害反应。

将化合物15溶于水/甘露醇混合物(50mg/ml)中。在通过静脉内途 径注入后10分钟测量跳跃潜伏时间。

表2

  剂量mg/kg   镇痛率％   10   33.4±7.5^＊＊  20   59.2±9.6^＊＊＊  40   90.2±7.0^＊＊＊

结果(表2)表明化合物15表现出剂量依赖性镇痛作用。

^＊＊p＜0.01；^＊＊＊p＜0.001，相对于载体。

有效剂量50，ED₅₀，为16.1mg/kg。

ED₅₀是50％的受试者给出所希望效果的剂量(以g/kg体重计)。

b)当向爪部发炎(通过在爪底注射角叉菜胶引起发炎)大鼠(雄性 Sprague Dawley)的爪部施加压力时，化合物15(口服100mg/kg)对嘶叫 阈的抗伤害作用。

在爪底注射角叉菜胶(1％，在盐水溶液中)后180分钟，施用化合 物15和载体(乙醇/聚乙二醇(PEG)400/水，10/40/50)。

表3

  嘶叫阈(g)  基础阈   298.8±18.7  发炎的爪+载体   205.5±17.8  发炎的爪+化合物15   292.5±20.1^＊＊＊

测量发炎前(B)向爪施加压力时的嘶叫阈基线，并测量注射化合物 15或载体后20分钟向发炎的爪施加压力时的嘶叫阈基线。结果如表3 所示，并以平均值±SEM表示，n＝10。当p值小于0.05时，认为所观 察到的差异明显。这些结果表明化合物15在治疗神经炎性疼痛中有效。 ^＊＊＊相对于载体p＜0.001。

c)在热板试验(52℃，反应/跳跃)中，在通过iv将溶于乙醇/表面 活性剂/水(10/10/80)的化合物15注入雄性OF1小鼠后，观察抗伤害反 应和根据载体的性质的反应的比较。

将化合物15溶于乙醇/EL/水的混合物中。在静脉内 注射后10分钟测量跳跃潜伏时间。结果在图1中给出。

在有效剂量50(ED₅₀)为1.9±0.4mg/kg时，该剂量依赖性反应提 供镇痛反应。该值接近于用吗啡观察到的值(ED₅₀＝1.3±0.2mg/kg)。^＊＊相对于载体p＜0.01。^＊＊＊p＜0.001。

化合物15也可溶于乙醇//水的溶剂，该溶剂常用于通过静 脉内途径施用于人。

在这些溶剂中，与用EL观察到的结果不存在明显差 异。在2.5mg/kg的相同浓度下iv，这如表4所示(注入后10分钟的跳 跃潜伏时间)。^＊＊＊相对于载体p＜0.001。

表4

  镇痛率％   Cremophor EL   56.2±6.9^＊＊＊  Tween 80   44.7±6.2^＊＊＊  Tween 20   48.4±10.2^＊＊＊

d)在热板试验前20分钟经口注入化合物15的抗疼痛作用：a)剂 量-反应曲线；b)经口施用200m/kg后的效果动力学。

将化合物15溶于10/40/50的乙醇/PEG400/水的混合物中。图2a 和2b中给出的结果表明化合物15显示出剂量依赖性镇痛效果(2a)， ED₅₀＝135mg/kg，并表明刚施用后化合物15的镇痛效果非常明显并且 伴随着降低的效果持续至少两个小时(2b)。

^＊p＜0.05；^＊＊p＜0.01；^＊＊＊p＜0.001，相对于载体。

#p＜0.05；###p＜0.001，相对于化合物15。

e)在热板试验(52℃，反应/跳跃)中，在经iv将5mg/kg的化合 物15(n＝14～17)或化合物A(n＝8～14)注入雄性小鼠后，观察到的抗伤 害反应的比较。

化合物A是下式化合物：

其记载于先前的专利申请WO 91/02718(实施例7)中。是表现出镇 痛特性的脑啡肽酶和氨基肽酶的混合抑制剂。其难溶于含水或亲水溶剂 中。

将化合物15和A溶于10/10/80的乙醇/CremophorEL/水的混合 物中。静脉内注射后10分钟测量跳跃潜伏时间。

表5

  镇痛率％   化合物15   87.6±4.6^＊＊，###   化合物A   51.1±7.6^＊＊

表5中给出的结果表明：在相同剂量时(对于通过iv途径施用的 化合物A来说，低)，化合物15比化合物A有效。

^＊＊相对于载体p＜0.01，###相对于化合物A p＜0.001。

f)由通过IV途径注入小鼠的吗啡或化合物15引起的镇痛作用 (热板试验，52℃)。

测量在热板试验(52℃)中由吗啡或化合物15对小鼠(雄性OF1) 产生的镇痛作用。通过iv注射在H₂O/NaCl(9/1000)中的吗啡或溶于载 体EtOH/Cremophor EL/水(10/10/80)的化合物15。注射后10分钟测量 结果，潜伏时间为240秒(实施例15和17中给出的方程)。

结果示于下表6：

表6

  剂量(mg/kg)   1  2.5  5   镇痛率％，化合   物15   46.4±5.6^＊＊＊ 56.3±6.9^＊＊＊ 87.6±4.6^＊＊＊  镇痛率％，吗啡   45.5±4.5^＊＊＊ 66±6.0^＊＊＊ 100^＊＊＊

^**＊p＜0.001，ANOVA检验

注意：化合物15的镇痛效果与用吗啡得到的镇痛效果相当。这与 在相同条件下实施的另一实验的结果一致(图1，实施例15c)。

实施例16：单独的Δ⁹THC的镇痛效果

测量在热板试验(52℃)中Δ⁹THC对小鼠(雄性OF1)产生的镇痛 作用。通过iv途径注射溶于载体EtOH/Cremophor EL/水(10/10/80)中 的Δ⁹THC。注射后10分钟测量结果，潜伏时间为240秒(实施例15和 17中给出的方程)。

结果示于下表7：

表7

  剂量(mg/kg)   0.188   0.375   0.75   1.5   镇痛％   0.4±3.9   18.2±6.4   41.2±12.7^＊＊  57.2±10.9^＊＊＊

^＊＊p＜0.01；^＊＊＊p＜0.001

注意：Δ⁹THC产生剂量依赖性镇痛效果。对于0.75mg/kg和1.5 mg/kg的剂量，观察到明显的镇痛率值。在较低剂量时，镇痛百分比不 明显。

实施例17：根据本发明的化合物+Δ⁹THC的镇痛效果

采用通常用在制药工业中以证实协同作用特性的抗伤害试验，在 啮齿动物(大鼠和小鼠)中，实施用来证实与Δ⁹THC联合的根据本发明 的化合物的协同作用大小的实验，即：

-小鼠的热板试验(Eddie和Leimbach，J.Pharmacol.Exp.Ther. 107，385-389，1953)，

-大鼠的甩尾试验(D’Amour和Smith，J.Pharmacol.Exp.Ther.72， 74-79，1941)，

-小鼠的Porsolt游泳试验(Porsolt Arch.Int.Pharmacodyn.229， 327，1977)。

对于中枢试验(热板、甩尾)：

-大麻素(Δ⁹THC)的浓度优选为0.3～0.5mg/kg，

-根据本发明的化合物(化合物15)的浓度优选为1～2mg/kg。

相对浓度取决于疼痛刺激。

用在下面实例中的Δ⁹THC是购自Sigma-Aldrich的商用产品 (T2386)。

在下面实施例中使用的混合抑制剂是上述化合物15(实施例15) 制备化合物的溶液

将所有化合物溶于乙醇/Cremophor 80/水＝10/10/80的混合物中。

对于增效实验(协同作用)，使用单独使用时不引起明显反应的Δ⁹THC和抑制剂的剂量。

施用方式

通过iv途径以同一注射器中的混合物方式将各种化合物施用于大 鼠或小鼠的尾部。

动物

在这些试验中使用的小鼠是雄性OF1小鼠。在这些试验中使用的 大鼠是雄性Sprague-Dawley大鼠。

药理试验

-热板试验：

该试验涉及小鼠在加热到52℃的板上的舔舐和跳跃反射。采用 以下方程，以最大可能效果％(MPE％)表示结果，即表示为镇痛百分比：

最大潜伏时间＝240秒。

结果以平均值±SEM表示。当p值小于0.05时，认为所观察到的 差异明显。

-甩尾试验：

该试验涉及通过由聚焦在尾部指定部分的光源发射的辐射热刺激 的大鼠甩尾反射。如前述试验中，根据相同的方程由测量的镇痛百分比 表示结果。最大潜伏时间任意地定为15秒。

游泳试验：

该试验测量置于21-23℃无法逃脱水浴中的小鼠的不动时间。不 动时间反映一种抑郁形式；小鼠不再努力逃离危险环境。结果以不动时 间表示。最大不动时间为4分钟。

为了证实化合物15+Δ⁹THC的组合的协同作用，绘制在溶剂乙醇 /Cremophor EL/H₂O(1/1/8)中单独的化合物15和单独的Δ⁹THC的剂量 -反应曲线，这是因为在这些条件(实施例16)下仅可通过iv途径以高浓 度使用Δ⁹THC。镇痛反应(热板)的柱状图(图3)清楚地表明：与单独的 一种或另一种产品相比，Δ⁹THC加化合物15的组合的镇痛效果的非常 大的增强。

a)在热板试验中，通过iv途径将化合物15和Δ⁹THC的混合物 注入雄性OF1小鼠引起的抗伤害反应(图3)。

注射在载体乙醇/Tween 80/水(10/10/80)中的化合物15(0.4mg/kg) 和Δ⁹THC(0.375mg/kg)的混合物。小鼠重25-30g。该溶剂混合物适于 通过IV途径施用于人和动物。

在静脉内注射后10分钟测量跳跃潜伏期。采用上述方程，以镇痛 百分比表示结果，并示于图3。

对于p≤0.05，认为观察到的差异显著-单侧ANOVA，然后是多 重比较检验。

^＊＊＊：相对于对照组p≤0.01，###：相对于化合物15和Δ⁹THC的 混合物p≤0.01。

b)在甩尾试验中，通过iv途径将化合物15和Δ⁹THC的混合物 注入雄性Sprague-Dawley大鼠引起的抗伤害反应。注射在载体乙醇 /Tween 80/水(10/10/80)中的化合物15(5mg/kg)和Δ⁹THC(0.375mg/kg) 的混合物。测量注射前(预试验)和静脉内注射后10分钟(试验)的甩尾潜 伏期。

潜伏时间为15秒。大鼠重260-300g。

结果示于表8。

表8：甩尾试验

  镇痛％   载体   -3.9±3.3   化合物15   -4.2±1.9   Δ⁹THC   23.3±2.4^＊＊＊  化合物15和Δ⁹THC   39.2±7.7^＊＊，^＊＊＊，#

^＊＊＊：相对于载体p＜0.001，^＊＊：相对于化合物15P＜0.001，#：相对于Δ⁹THC p＜0.05。

对于p≤0.05，认为观察到的差异明显。双侧ANOVA，随后多重 比较检验：^＊＊＊：p≤0.001，^＊＊：p≤0.01，相对于载体组；#：p≤0.05，相对 于Δ⁹THC组；^＊＊＊p≤0.001，^＊＊p≤0.01，相对于化合物15组。

c)在游泳试验中，通过iv途径将化合物15和Δ⁹THC的混合物 注入雄性OF1小鼠引起的抗抑郁反应。

在试验前10分钟，通过静脉内途径注射在载体乙醇/Tween 80/水 (10/10/80)中的化合物15(5mg/kg)和Δ⁹THC(0.375mg/kg)的混合物。

测得总不动时间为4分钟。

结果如表9所示。小鼠重约25-30g。

对于p≤0.05，认为观察到的差异明显。单侧ANOVA，随后多重 比较试验：^＊＊＊：p≤0.001，^＊：p≤0.05，相对于载体组；###：p≤0.001，相对 于化合物15/Δ⁹THC组；和Δ⁹THC组。

表9：抑郁/游泳试验

  不动时间(秒)   载体   230.7±4.5   化合物15   180±8.4^＊＊＊  Δ⁹THC   206±6.1   化合物15/Δ⁹THC   137.4±8.8^＊＊＊，###

^＊＊＊：p＜0.001，相对于对照组，###：p＜0.001，相对于Δ⁹THC和化合物 15。

结论：

注意：通过iv途径对小鼠施用小剂量的大麻素Δ⁹THC，即浓度 小于0.5mg/kg，增强由化合物15引起的抗伤害或抗抑郁反应。

在这些条件下，当通过比较Δ⁹THC和化合物15的剂量-反应曲 线与这两种化合物的小于镇痛剂量时产生的效果而得到小鼠在热板试 验中的镇痛效果时，非常明显地表现出协同作用(图3)。

可以注意到，单独的Δ⁹THC的活性剂量/Δ⁹THC加化合物15的 活性剂量，或者反过来，单独的化合物15的活性剂量/化合物15+Δ⁹THC 的活性剂量的放大率在两种情况下均远大于10，而且，由于当化合物 15和Δ⁹THC以相同剂量单独使用时这两种分子所用的剂量是非活性 的，所以不易于精确计算放大率。

通过本发明化合物(混合抑制剂NEP/APN；例如化合物15)和Δ⁹THC的组合(两种物质都以非常低的剂量施用，该剂量下它们没有活性)产 生的抗伤害反应的强度，表明内源性脑啡肽(被本发明的化合物保护)和Δ⁹THC之间存在协同效应。这由药理反应的等辐射分析证实。