日本血吸虫 TSP蛋白胞外环2编码基因、多肽、融合蛋白及在疫苗制备中的用途

摘要

本发明属于生物技术领域，具体解决的技术问题是提供一种新的涉及日本血吸虫中国大陆株tetraspanins(TSP)的胞外环2(EC－2)—编码基因Sj－TSP－2，以其为基础构建的融合蛋白、多肽及其制备方法和应用。该Sj－TSP－2肽段具有81个氨基酸，与曼氏血吸虫对应的氨基酸序列(aa.104～188)有60％的同源性，能够作为一段抗原决定簇。该Sj－TSP－2融合蛋白及Sj－TSP－2多肽脂质体复合物在制备日本血吸虫疫苗方面具有很好的应用前景。

说明书

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及日本血吸虫的tetraspanins蛋白(TSPs，四次跨膜蛋白)胞外环2(EC-2)的编码基因Sj-TSP-2，以及以其为基础构建的融合蛋白和在制备日本血吸虫疫苗中的用途。

背景技术：

血吸虫病是由于人或哺乳动物感染了血吸虫引起的一种人畜共患寄生虫病，在世界范围内其患病人数仅次于疟疾，是第二大热带寄生虫病。该病呈全球性分布，主要发生在发展中国家的城镇周边地区和偏远农村。在76个国家大约6.52亿人受到威胁，超过2亿人受到不同程度的感染，其中1.2亿属现症患者，0.2亿出现严重并发症，严重影响着人类的健康和经济的发展。

在我国流行在我国流行的是日本血吸虫病，该病传播环节多、流行因素复杂，是对健康危害最为严重、防治难度最大的血吸虫病。近年我国血吸虫病的流行范围有所扩大，部分地区疫情死灰复燃，血防工作形势严峻。目前现有患者84.25万，钉螺面积38.46亿平方米，受感染者不计其数。

目前血吸虫的控制主要依赖于诊断和唯一有效的化疗药物——吡喹酮的使用，但吡喹酮虽能降低感染率和发病率，却不能阻断传播，对已经发生的肝脾损害没有作用，接触疫水后仍会发生再次感染。另有证据显示，药物的长期使用尚不能排除血吸虫有潜在抗药性的危险。灭螺和吡喹酮大规模化疗，不能从根本上解决血吸虫病防治问题。面对这样巨大的挑战，寻找长效防治措施成为主要目标，疫苗预防作用被作为血吸虫病防治的重要措施而倍受关注。近年来，世界卫生组织专家Bergquist及其同事在报道中指出，预防性疫苗的单独使用或与化疗药物联合，均为血吸虫病的可持续控制提供了一条理想途径。

为了推动血吸虫疫苗的研制，世界卫生组织——热带病研究培训特别规划(TDR)将血吸虫疫苗研制置于血吸虫病防治研究的重要地位。包括中国、美国、法国、英国和巴西等国家在内的各政府和研究机构都在积极地开展血吸虫疫苗的研究。几十年来，血吸虫疫苗研究逐步从死疫苗、减毒尾蚴疫苗，发展到明确亚单位的基因工程疫苗。随着对血吸虫病保护性免疫、发病机制、肉芽肿形成调节机制的研究，以及现代生物化学及分子生物学在寄生虫领域的应用，筛选出一大批血吸虫疫苗候选分子。上世纪九十年代中期，TDR资助了曼氏血吸虫的6个疫苗候选分子的研究，包括谷胱甘肽S-转移酶(GST)、副肌球蛋白(Sm97)、辐射疫苗5号抗原(IrV-5)、磷酸丙糖异构酶(TPI)、23kDa膜抗原(Sm23)、脂肪酸结合蛋白(Sm14)，结果显示获得的保护水平均未超过WHO为抗原进入临床试验制定的40％的标准。疫苗研制的不理想，一定程度上归因于血吸虫为躲避宿主体内环境的排斥而发生的免疫逃逸。

过去几年，血吸虫分子生物学领域飞速发展，基因组学、转录组学以及大部分蛋白组学已基本完成，人们发现了新的一批颇具研究前景的疫苗候选分子。2003年，巴西科学家破译曼氏血吸虫基因组；2006年，中国科学家破译日本血吸虫基因组，这为认识血吸虫生物学特征、开发抗血吸虫药物以及研制血吸虫疫苗奠定了理论基础。

Tetraspanin是一类进化上保守的细胞表面蛋白，几乎遍布于所有类型的细胞和组织，其主要作用是介导蛋白分子间的相互作用，参与了各种各样的生物学过程，譬如卵细胞的受精、宿主对感染的易感性、癌细胞的转移、中枢神经系统和免疫系统的细胞间相互作用等。曼氏血吸虫体被表面发现的Tetraspanin(TSP-2)能够产生针对血吸虫病的较高的保护力，它与大多数真核细胞包括T细胞和B细胞表面受体同源，可能与抑制血吸虫的免疫逃避机制有关。它是目前最新的曼氏血吸虫疫苗候选分子。而其在日本血吸虫的是否存在同源基因片段以及该同源基因的功能尚未见报道。

发明内容：

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种日本血吸虫中国大陆株的TSPs(tetraspanins，四次跨膜蛋白)的胞外环2(EC-2)多肽Sj-TSP-2的编码基因及其保守性变异体。该编码基因具有如下所示的序列(Seq ID No.1)：

GCAATAATAGAAAAGCCGAAGGTGAAAAGACATGTCACTACAGCATTAAAAGACCTTGTAGGACAATACGGACACGATAGACACTTAGACAAAGTTTTGGACGAAATTCAAGATAAATTACAATGTTGTGGTGCCGAATCGCCTGCTGATTATTCTCGAGGACCACCTCCATCATGTAAGAATTATAATGAGGGATGCATTGGTAAAGTCACCGATCTGACTAAAAAGCACCTAAATGCCACC。

该序列适合在真核系统中表达。

该编码基因的一种保守性变异体具有Seq ID No.2所示的核苷酸序列：

GCAATTATTGAAAAGCCGAAGGTGAAACGTCATGTCACTACAGCATTAAAAGACCTTGTAGGACAATACGGACACGATCGTCACTTAGACAAAGTTTTGGACGAAATTCAAGATAAATTACAATGTTGTGGTGCCGAATCGCCTGCTGATTATTCTCGCGGACCACCTCCATCATGTAAGAATTATAATGAGGGATGCATTGGTAAAGTCACCGATCTGACTAAAAAGCACCTGAATGCCACC。

该序列适合在原核系统中表达。

Seq ID No.1和Seq ID No.2编码的氨基酸序列如Seq ID No.3所示：

AIIEKPKVKRHVTTALKDLVGQYGHDRHLDKVLDEIQDKLQCCGAESPADYSRGPPPSCKNYNEGCIGKVTDLTKKHLNAT。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种上述的TSPs蛋白的胞外环2多肽编码基因与硫氧还蛋白编码基因融合得到的融合编码基因。

进一步的，上述的融合编码基因具有Seq ID No.4或Seq ID No.5所示的核苷酸序列。其中Seq ID No.4所示的序列适合在真核系统中表达，为：

ATGAGCGATAAAATTATTCACCTGACTGACGACAGTTTTGACACGGATGTACTCAAAGCGGACGGGGCGATCCTCGTCGATTTCTGGGCAGAGTGGTGCGGTCCGTGCAAAATGATCGCCCCGATTCTGGATGAAATCGCTGACGAATATCAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAACTGAACATCGATCAAAACCCTGGCACTGCGCCGAAATATGGCATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCGGCAACCAAAGTGGGTGCACTGTCTAAAGGTCAGTTGAAAGAGTTCCTCGACGCTAACCTGGCCGGTTCTGGTTCTGGCCATATGCACCATCATCATCATCATTCTTCTGGTCTGGTGCCACGCGGTTCTGGTATGAAAGAAACCGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCACATGGACAGCCCAGATCTGGACGACGACGACAAGGCAATAATAGAAAAGCCGAAGGTGAAAAGACATGTCACTACAGCATTAAAAGACCTTGTAGGACAATACGGACACGATAGACACTTAGACAAAGTTTTGGACGAAATTCAAGATAAATTACAATGTTGTGGTGCCGAATCGCCTGCTGATTATTCTCGAGGACCACCTCCATCATGTAAGAATTATAATGAGGGATGCATTGGTAAAGTCACCGATCTGACTAAAAAGCACCTAAATGCCACC。

其中Seq ID No.5所示的序列适合在原核系统中表达，为：

ATGAGCGATAAAATTATTCACCTGACTGACGACAGTTTTGACACGGATGTACTCAAAGCGGACGGGGCGATCCTCGTCGATTTCTGGGCAGAGTGGTGCGGTCCGTGCAAAATGATCGCCCCGATTCTGGATGAAATCGCTGACGAATATCAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAACTGAACATCGATCAAAACCCTGGCACTGCGCCGAAATATGGCATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCGGCAACCAAAGTGGGTGCACTGTCTAAAGGTCAGTTGAAAGAGTTCCTCGACGCTAACCTGGCCGGTTCTGGTTCTGGCCATATGCACCATCATCATCATCATTCTTCTGGTCTGGTGCCACGCGGTTCTGGTATGAAAGAAACCGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCACATGGACAGCCCAGATCTGGACGACGACGACAAGGCAATTATTGAAAAGCCGAAGGTGAAACGTCATGTCACTACAGCATTAAAAGACCTTGTAGGACAATACGGACACGATCGTCACTTAGACAAAGTTTTGGACGAAATTCAAGATAAATTACAATGTTGTGGTGCCGAATCGCCTGCTGATTATTCTCGCGGACCACCTCCATCATGTAAGAATTATAATGAGGGATGCATTGGTAAAGTCACCGATCTGACTAAAAAGCACCTGAATGCCACCTAA。

Seq ID No.4和Seq ID No.5的融合蛋白序列如Seq ID No.6所示：

MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLDDDDKAIIEKPKVKRHVTTALKDLVGQYGHDRHLDKVLDEIQDKLQCCGAESPADYSRGPPPSCKNYNEGCIGKVTDLTKKHLNAT

本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种含有上述编码基因的载体、宿主细胞或表达系统。这些载体、宿主细胞或表达系统即可以是原核载体、宿主细胞或表达系统，也可以是真核载体、宿主细胞或表达系统，可以选用本领域常用的各种材料使用本领域的常规方法进行构建。

本发明所要解决的第四个技术问题是提供上述的编码基因在制备日本血吸虫疫苗中的用途。

本发明所要解决的第五个技术问题是提供上述的编码基因表达所得多肽或者融合蛋白。该多肽或者融合蛋白既可以是在原核表达系统中表达得到的，也可以在真核表达系统中表达得到的。

本发明所要解决的第六个技术问题是提供上述多肽和融合蛋白在制备日本血吸虫疫苗中的用途。

本发明所要解决的第七个技术问题是提供一种日本血吸虫疫苗，该日本血吸虫疫苗含有上述的编码基因、载体、宿主细胞、表达系统或蛋白。

进一步的，上述日本血吸虫疫苗是由脂质体包封上述的载体、宿主细胞、表达系统或蛋白。

更进一步的，上述的日本血吸虫疫苗中的脂质体由按摩尔比2∶1～2的二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)：1，2二油酰-3-三甲铵基丙烷(DOTAP)，再加上占脂质体质量百分比0.1～1％的MPLA(Monophosphoryl lipid A，单磷酸脂多糖A)制成。优选为脂质体由按摩尔比2∶1的DOPE、和DOTAP，再加上占脂质体质量百分比0.1～1％的MPLA制成。

其中，当包封的成分为上述Sj-TSP-2多肽时，多肽与脂质体的摩尔比为1∶10～100，优选为1∶20。

通过转录组学和蛋白组学的分析，认识到血吸虫的体被是虫体防御屏障的前沿，也是攻击血吸虫最重要的靶点。本发明通过基于cDNA的信号序列捕获技术(signal sequencetrap，SST)在日本血吸虫中国大陆株的基因组中经日本血吸虫全基因测序得到的一些未知功能的片段，如＞gb|AAX26608.1|unknown[Schistosoma japonicum]、＞gb|AAW24562.1|SJCHGC00584 protein[Schistosoma japonicum]、＞gb|AAX26611.2|SJCHGC02016 protein[Schistosoma japonicum]等中进行功能基因片断的筛选，筛选获得日本血吸虫中国大陆株编码跨膜蛋白的一段新基因，与genebank已发表的其他种的血吸虫的各种基因序列比对，发现其与曼氏血吸虫体被表面发现的Tetraspanin(TSP)胞外段EC-2区同源性为60％，确定为曼氏血吸虫Schistosoma mansoni CD63-like protein Sm-TSP-2 mRNA，即tetraspanins基因胞外环2(EC-2)结构域序列的同源片段，并首次命名为Sj-TSP-2基因。

本发明还建立了该基因的克隆方法并对其进行了一定改造，将其中的大肠杆菌稀有密码子替换为偏爱密码子，大大提高其原核表达产量，得到了适合在原核生物中表达的序列。然后在真核系统和大肠杆菌中的表达方法也得到了建立并表达得到了相应的Sj-TSP-2多肽。该Sj-TSP-2多肽具有81个氨基酸，与曼氏血吸虫对应的氨基酸序列(aa.104～188)有60％的同源性，可以被当作一段抗原决定簇，在制备防治日本血吸虫的药物方面具有好的应用前景。

本发明Sj-TSP-2基因序列可以通过基于cDNA的信号序列捕获技术筛选日本血吸虫中国大陆株编码跨膜蛋白的一段基因获得。设计引物后，用以常规方法制备的日本血吸虫中国大陆株成虫Sj-TSP cDNAs为模板，PCR扩增其编码胞外环EC-2的基因片段Sj-TSP-2(对应肽段为aa.33-113)。然后克隆到原核表达载体pET32a上，构建重组质粒pET32a-Sj-TSP-2，将该Sj-TSP-2基因的5’端连接在硫氧还蛋白基因的3’端，并测定插入的基因核苷酸序列，转化大肠杆菌BL21(DE3)，用IPTG诱导表达。SDS-PAGE凝胶电泳分析表明，重组质粒能够在大肠杆菌BL21(DE3)内能高效表达融合蛋白Trx-Sj-TSP-2。

本发明还进一步通过金属螯合柱亲和层析纯化得到融合蛋白Trx-Sj-TSP-2，并用载体上的肠激酶切位点切割、纯化得到Sj-TSP-2多肽。该融合基因既能更高效的表达，其表达产物又具有更好的免疫原性，实验证明其在制备防治日本血吸虫的药物方面能有更广阔的应用。

通过Western-blotting分析显示重组蛋白Sj-TSP-2可被融合蛋白Trx-Sj-TSP-2免疫小鼠血清识别，而与正常小鼠血清无反应，说明Sj-TSP-2具有良好的抗原性；特别是经肠激酶酶切得到的目的肽段Sj-TSP-2能被重组抗原Trx-Sj-TSP-2免疫小鼠血清识别，而不能被空载蛋白免疫组小鼠血清识别，说明重组抗原疫苗组小鼠体内产生了针对目的肽段Sj-TSP-2的特异性抗体，该肽段具有良好的抗原性和免疫原性。

纯化后的融合蛋白Trx-Sj-TSP-2，免疫Balb/c小鼠，免疫剂量为25μg/只，腹腔注射，共免疫3次，间隔2周。末次免疫后2周用成熟日本血吸虫尾蚴攻击感染，攻击感染后第7周处死小鼠，计数成虫数和肝内虫卵数。结果表明，与PBS对照组相比，融合蛋白免疫组小鼠在感染后的减虫率和肝组织减卵率分别为56％和59％；与空载蛋白(硫氧还蛋白，thioredoxin，Trx)免疫组比较，融合蛋白免疫组小鼠的减虫率和肝减卵率分别为55％和50％。这表明Sj-TSP-2蛋白和Trx-Sj-TSP-2蛋白在用于制备日本血吸虫疫苗方面具有很好的前景。

同时，还将单独的Sj-TSP-2多肽与脂质体制备成Sj-TSP-2脂质体复合物，Sj-TSP-2多肽以我们发明的脂质体配方作为佐剂以及与制备Sj-TSP-2脂质体复合物的工艺相配合可以显著提高Sj-TSP-2多肽的免疫原性，抗体水平达到甚至超过融合蛋白以弗氏佐剂作为免疫佐剂组。

本发明的有益效果在于，首次公开了日本血吸虫的Sj-TSP-2基因的核苷酸序列，并提供了其更易于在原核表达系统中表达的保守性变异体，表达得到的Sj-TSP-2蛋白具有良好的抗原性和免疫原性。同时本发明还将Sj-TSP-2基因与硫氧还蛋白基因融合，得到一全新的融合蛋白，该融合蛋白具有更好的抗原性和免疫原性。而本发明提供的上述Sj-TSP-2蛋白的脂质体复合物也能显著提高免疫原性，抗体水平达到甚至超过融合蛋白以弗氏佐剂作为免疫佐剂组，也是一种很好的疫苗材料，具有更广的应用前景。

附图说明：

图1：日本血吸虫中国大陆株Sj-TSP-2与曼氏血吸虫Sm-TSP-2的胞外环EC-2肽段(aa.104～188)的同源比对分析。

图2：PCR产物的1.8％琼脂糖凝胶电泳图谱

1：10kb DNA marker 2：PCR产物

图3：pUC18-Sj-TSP-2重组子双酶切(Bgl II+Hind III)鉴定图谱。

1：10kb DNA marker  2、3：pUC18-Sj-TSP-2

图4：pET32a-Sj-TSP-2重组质粒双酶切(XbaI+HindIII)鉴定图谱。

1：10kb DNA marker 2：pET32a 3：pET32a-Sj-TSP-2

图5：重组蛋白的诱导表达(图5A)及纯化情况(图5-2)的SDS-PAGE电泳图谱。

图5A：1：蛋白标准分子量2：pET32a/BL21(DE3)诱导后4h

3：pET32a-Sj-TSP-2/BL21(DE3)诱导前  4：pET32a-Sj-TSP-2/BL21(DE3)诱导后4h

图5B：1：蛋白标准分子量2：纯化后的空载蛋白  3：纯化的融合蛋白Trx-Sj-TSP-2

图6：融合蛋白Trx-Sj-TSP-2肠激酶酶切后的Tricine-glycerol SDS-PAGE电泳图谱。

1：超低分子量蛋白标准2：融合蛋白Trx-Sj-TSP-2 3：硫氧还蛋白4：融合蛋白Trx-Sj-TSP-2加0.01U肠激酶5：加0.05U肠激酶6：加0.1U肠激酶7：加0.5U肠激酶8：加1U肠激酶9：加5U肠激酶10：加10U肠激酶

图7：Sj-TSP-2多肽的纯化过程的SDS-PAGE电泳图谱。

1：蛋白标准分子量2、3：肠激酶酶切后产物过DEAE柱穿透峰

4、5：穿透峰过SP柱后洗脱峰

图8：融合蛋白及肠激酶酶解后的融合蛋白的western blotting图谱。

图8A：与空载蛋白免疫小鼠血清反应

图8B：与融合蛋白Trx-Sj-TSP-2免疫小鼠血清反应

1：融合蛋白Trx-Sj-TSP-2  2、融合蛋白Trx-Sj-TSP-2加肠激酶酶解

图9：融合蛋白疫苗免疫组小鼠血清特异性抗体滴度水平变化图。

图10：免疫后6周融合蛋白组、空载蛋白组和PBS组抗Sj-TSP-2抗体比较图。

图11：Sj-TSP-2脂质体复合物的粒径大小示意图。

图12：Sj-TSP-2脂质体免疫组、Sj-TSP-2加弗氏佐剂免疫组、Trx-Sj-TSP-2融合蛋白加弗氏佐剂免疫组、Sj-TSP-2与空白脂质体混合组和PBS组免疫小鼠血清特异性抗体滴度水平变化图。

以下结合附图通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容的思想所实现的技术均属于本发明的范围。

具体实施方式：

实施例1：日本血吸虫中国大陆株Sj-TSP-2基因的筛选及克隆

采用基于cDNA的信号序列捕获技术筛选获得日本血吸虫中国大陆株编码跨膜蛋白的一段基因序列Sj-TSP-2。

首先应用定向随机引物法(directional random priming strategy)构建日本血吸虫(中国大陆株)成虫的cDNA文库。日本血吸虫(中国大陆株)成虫取自尾蚴感染后7～10周的Balb/c小鼠(经门脉灌注)。然后运用以胎盘碱性磷酸酶(PLAP)作为报告基因的信号序列捕获技术(AP-PST)筛选到日本血吸虫(中国大陆株)编码膜蛋白的一段基因。经软件分析，该cDNA片段具有4次跨膜的结构特点，且与编码大多数哺乳动物细胞表面的tetraspanins基因具有较高的同源性，类似于曼氏血吸虫的Sm-TSP基因，故命名为Sj-TSP。

分析日本血吸虫中国大陆株Tetraspanin(Sj-TSP)cDNA，针对目的基因(编码胞外环EC-2的基因序列)设计一对引物：上游5’端引入限制性内切酶Bgl II酶切位点和肠激酶(EK酶)切位点，下游引物5’端引入限制性内切酶Hind III酶切位点，由上海英俊生物技术有限公司合成。

上游引物：5’GAAGATCTGGACGACGACGACAAGGCAATTATTGAAAAGCCGAAGGTGAAACG 3’(Seq ID No.7)

下游引物：5’CTCAAGCTTAGGTGGCATTCAGGTGC 3’(Seq ID No.8)

以上述筛选获得的日本血吸虫中国大陆株成虫Sj-TSP cDNAs为模板，PCR扩增其编码胞外环EC-2的基因片段——Sj-TSP-2(对应肽段为aa.33-113)，反应条件为：94℃预变性4分钟；94℃ 45秒，52℃45秒，72℃45秒，30个循环；最后72℃延长12分钟。

反应完成后，1.8％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果表明扩增出与预期片段大小一致的250bp左右的DNA片段(见图2)。经限制性内切酶Bgl II和Hind III双酶切构建入克隆载体pUC18的Bgl II/Hind III位点中，得到重组质粒pUC18-Sj-tsp-2，酶切鉴定图谱见图3，测序鉴定，序列如Seq ID No.1所示。经同源比对分析发现与曼氏血吸虫Sm-TSP-2氨基酸序列的同源性为60％(见图1)。

经软件分析表明该段基因序列中存在多个大肠杆菌稀有的密码子，这将导致其在大肠杆菌中的表达效率较低。为了提高表达量，将其中的稀有密码子置换为大肠杆菌偏爱密码子，序列如Seq ID No.2所示。采用全基因合成方式得到该基因片段，由上海英俊生物技术有限公司合成。在下面的实例中，采用Seq ID No.2的核苷酸序列做为原核表达的基础。可将鉴定正确的Sj-TSP-2基因克隆入原核表达载体表达Sj-TSP-2蛋白。

实施例2 Sj-TSP-2融合蛋白的表达、纯化及鉴定

本发明设计并制备得到Seq ID No.4和Seq ID No.5所示的编码融合蛋白的基因使用pET-32a(购自Novagen公司)作为表达载体，它以Ptac启动子引发受IPTG调节Seq ID No.5编码的基因的转录。表达产物是由Seq ID No.6编码的，N-端与硫氧还蛋白相融合的重组蛋白Trx-Sj-TSP-2，可利用金属螯合柱亲和层析一步纯化。为了在目的蛋白纯化后将硫氧还蛋白去除得到Sj-TSP-2蛋白，在硫氧还蛋白后又加上了肠激酶(EK酶，Enterokinase)的酶切位点(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys↓)。

采用双酶切(Bgl II/Hind III双酶切)定向克隆法构建表达载体pET32a-Sj-TSP-2，用Xba I/Hind III双酶切进行鉴定(见图4)，筛选出来的重组质粒送去测序验证。鉴定正确后，将重组质粒pET32a-Sj-TSP-2转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，IPTG诱导目的蛋白表达，表达情况见图5。结果表明，pET32a-Sj-TSP-2/BL21(DE3)在IPTG诱导下可表达与预计分子量一致(27kDa左右)的融合蛋白，表达量达到35％以上。破菌上清经金属螯合柱亲和层析一步得到纯化，融合蛋白Trx-Sj-TSP-2纯度可达95％以上，产量可达200～400mg/L。

经Ni柱纯化的融合蛋白Trx-Sj-TSP-2，EK酶酶切后可得到硫氧还蛋白和分子量为8.9kDa左右的Sj-TSP-2多肽(不同量的EK酶切结果见图6)，经DEAE阴离子交换柱吸附切下来的硫氧还蛋白，再过SP阳离子交换柱浓缩Sj-TSP-2多肽(纯化过程见图7)，其纯度可达到95％以上，产量可达50～100mg/L。

大规模制备Trx-Sj-TSP-2融合蛋白和Sj-TSP-2多肽用于以后的动物实验研究。

融合蛋白Trx-Sj-TSP-2蛋白、硫氧还蛋白与Sj-TSP-2多肽均可与免疫融合蛋白组的抗血清进行杂交，而Sj-TSP-2多肽不能与对照组——硫氧还蛋白免疫组的抗血清进行杂交，Western Blot结果见图8，说明融合蛋白免疫组小鼠体内的确产生了针对目的肽段Sj-TSP-2的特异性抗体。

实施例3  融合蛋白Trx-Sj-TSP-2的免疫原性检测

将30只6～8周龄Balb/c小鼠随机分为3组，每组10只。Trx-Sj-TSP-2融合蛋白免疫组、空载蛋白(硫氧还蛋白)免疫对照组、PBS对照组。融合蛋白免疫组的小鼠分别经腹腔注射乳化的25μg/60μl Trx-Sj-TSP-2融合蛋白和弗氏佐剂，共免疫3次，间隔2周，初次免疫使用完全弗氏佐剂，两次加强免疫使用不完全弗氏佐剂；空载蛋白免疫对照组(Trx组)则注射空载蛋白加佐剂；PBS组注射PBS加佐剂，免疫方式均同融合蛋白免疫组。免疫后2、4、6、8、10、12周分别尾静脉采血，收集血清。

用融合蛋白Trx-Sj-TSP-2包板，ELISA法检测各组小鼠血清中抗体的产生情况，融合蛋白Trx-Sj-TSP-2产生抗体的情况如图9所示。结果表明，初次免疫后2周小鼠开始产生抗融合蛋白抗体(滴度为1.6×10³)，第一次加强免疫后(4周)抗体滴度迅速上升，达到1.6×10⁵，第二次加强免疫后(6周)抗体滴度达到最高水平3.2×10⁵，到检测的第12周仍能维持5.12×10⁴的高水平，说明融合蛋白的免疫原性较好。同样，在空载蛋白免疫对照组也能检测到抗硫氧还蛋白抗体，抗体滴度最高水平可达到3.2×10⁵。

为了验证目的肽段Sj-TSP-2产生抗体的情况，我们用EK酶解后去除硫氧还蛋白的Sj-TSP-2包板，ELISA检测特异性抗Sj-TSP-2抗体的产生情况。结果如图10所示，表明只有融合蛋白Trx-Sj-TSP-2免疫组才能产生针对Sj-TSP-2蛋白的特异性抗体，PBS组和空载蛋白组均为阴性。融合蛋白Trx-Sj-TSP-2免疫组免疫后6周抗Sj-TSP-2抗体滴度也可达到3.2×10⁵。一般单独多肽或小分子蛋白的免疫原性较低，没有载体蛋白(牛血清白蛋白或匙孔嘁血蓝蛋白(KLH))的帮助下很难产生较高滴度的抗体；在本发明中，硫氧还蛋白可作为一个较好的载体蛋白帮助融合的外源片段呈现良好的免疫原性，Sj-TSP-2能达到与硫氧还蛋白相同的抗体滴度。

实施例4融合蛋白Trx-Sj-TSP-2的保护性实验

与实施例3相同的方式分组，免疫小鼠，进行3次免疫，末次免疫2周后(即第6周)，实验组与对照组每只小鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴(40±2)条。尾蚴攻击感染7周后，处死小鼠，门脉灌注收集血吸虫成虫，计数每只小鼠收集的成虫数，计算疫苗免疫小鼠的减虫率：

减虫率(％)＝(1-实验组平均检获成虫数/PBS对照组平均检获成虫数)×100％

每只小鼠肝组织称重，分别减碎后按常规方法用5％KOH，37℃消化过夜，计算每克肝组织的减卵率：

肝减卵率(％)＝(1-实验组平均每克肝虫卵数/PBS对照组平均每克肝虫卵数)×100％

成虫减虫率、每克肝组织减卵率和粪卵减卵率的结果分别见表1、表2和表3。

表1日本血吸虫(大陆株)融合蛋白reS j-TSP-2免疫组平均检获成虫数及减虫率

表2日本血吸虫(大陆株)融合蛋白reSj-TSP-2免疫组平均每克肝组织虫卵负荷及减卵率

表3  日本血吸虫(大陆株)融合蛋白reSj-TSP-2免疫组平均每克粪便虫卵计数及减卵率

由表中可见，融合蛋白reSj-TSP-2免疫组与PBS组比较，成虫减虫率为56％(P＜0.001)，肝组织减卵率为59％(P＜0.001)，粪卵减卵率为59％(P＜0.001)。同样，融合蛋白reSj-TSP-2免疫组与空载蛋白组相比较，成虫减虫率、肝组织减卵率及粪卵减卵率均具有显著性差异，空载蛋白组与PBS组相比不具备任何差异性。在血吸虫动物保护实验中，Sj-TSP-2肽段的免疫原性起绝对的保护作用，且该保护作用高于WHO制定的血吸虫疫苗保护作用达到40％的标准。这些结果表明，该肽段具有作为血吸虫疫苗的开发前景。

实施例5 Sj-TSP-2脂质体复合物的制备

材料：二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和1，2-二油酰-3-三甲铵基丙烷(DOTAP)购于Avantis公司；单磷酰脂A(Monophosphoryl lipid A，MPLA)购于Sigma公司。Sj-TSP-2多肽的制备见实施例2。

Sj-TSP-2脂质体复合物的配方如下：DOPE∶DOTAP＝2∶1(摩尔比)，0.5～1％MPLA(w/w)，Sj-TSP-2蛋白与脂质的摩尔比为1∶20。按处方精确称取DOTAP、DOPE、MPLA置于茄形瓶中，加入氯仿∶甲醇＝1∶1的有机溶剂溶解，30℃真空旋转蒸发得脂质体膜，放入真空干燥箱常温真空干燥过夜，加入超纯水超声水化(200W，10分钟)得空白脂质体溶液。将Sj-TSP-2多肽加入脂质体溶液，在液氮下速冻，4～8℃水浴下孵化1小时，连续冻融4～6次，再使用挤压法经过8～10次0.45μm聚碳酸酯膜，得到本发明Sj-TSP-2脂质体复合物。通过这种方法制备的Sj-TSP-2脂质体复合物的粒径为100nm左右(见图11)，包封率＞70％。

实施例6 Sj-TSP-2脂质体复合物的免疫原性

将实验动物分为五组：Sj-TSP-2脂质体免疫组、Sj-TSP-2加弗氏佐剂免疫组、Trx-Sj-TSP-2融合蛋白加弗氏佐剂免疫组、Sj-TSP-2与空白脂质体混合组和PBS组。免疫方案同实施例4，依然分三次免疫。Sj-TSP-2脂质体免疫组、Sj-TSP-2加弗氏佐剂免疫组和Sj-TSP-2与空白脂质体混合组中Sj-TSP-2多肽剂量为50μg/次，Trx-Sj-TSP-2融合蛋白加弗氏佐剂免疫组中融合蛋白剂量为25μg/次。免疫后2、4、6、8、10、12周分别尾静脉采血，收集血清。

用Sj-TSP-2包板，ELISA检测特异性抗Sj-TSP-2抗体的产生情况。结果如图12所示，Sj-TSP-2加弗氏佐剂免疫组和Sj-TSP-2与空白脂质体混合组在整个免疫过程中产生的抗体滴度很低。这说明单独的Sj-TSP-2的免疫原性较弱，在以“金标准”的弗氏佐剂为免疫佐剂时刺激抗体产生的能力仍然很弱；而脂质体佐剂增强多肽的免疫原性时，必须和多肽以复合物的形式制备，仅在注射前混合是不能提高多肽的免疫效果的。

Sj-TSP-2脂质体免疫组与Trx-Sj-TSP-2融合蛋白免疫组相比较，抗体产生趋势相同，但Sj-TSP-2脂质体免疫组可达到更好的远期免疫效果，初次免疫后2周小鼠开始产生抗Sj-TSP-2抗体，第一次加强免疫后(4周)抗体滴度迅速上升，第二次加强免疫后(6周)抗体滴度与融合蛋白免疫组相同(3.2×10⁵)，8周时超过融合蛋白免疫组(滴度为其2倍)，达到最高水平6.4×10⁵，到检测的第12周仍能维持3.2×10⁴的高水平(为融合蛋白组4倍)。这说明，以我们发明的脂质体配方作为佐剂以及与制备Sj-TSP-2脂质体复合物的工艺相配合可以显著提高Sj-TSP-2的免疫原性，抗体水平达到甚至超过融合蛋白以弗氏佐剂作为免疫佐剂组，表明Sj-TSP-2脂质体是一种更好的疫苗材料，且与弗氏佐剂相比，能应用于人体疫苗的开发研究，具有更广的应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110>四川大学

<120>日本血吸虫TSP蛋白胞外环2编码基因、多肽、融合蛋白及在疫苗制备中的用途

<130>A080118k

<150>200710200606x

<151>2007-05-11

<160>8

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>243

<212>DNA

<213>Schistosoma japonicum

<400>1

gcaataatag aaaagccgaa ggtgaaaaga catgtcacta cagcattaaa agaccttgta     60

ggacaatacg gacacgatag acacttagac aaagttttgg acgaaattca agataaatta    120

caatgttgtg gtgccgaatc gcctgctgat tattctcgag gaccacctcc atcatgtaag    180

aattataatg agggatgcat tggtaaagtc accgatctga ctaaaaagca cctaaatgcc    240

acc                                                                  243

<210>2

<211>243

<212>DNA

<213>Artificial

<223>artificial

<400>2

gcaattattg aaaagccgaa ggtgaaacgt catgtcacta cagcattaaa agaccttgta     60

ggacaatacg gacacgatcg tcacttagac aaagttttgg acgaaattca agataaatta    120

caatgttgtg gtgccgaatc gcctgctgat tattctcgcg gaccacctcc atcatgtaag    180

aattataatg agggatgcat tggtaaagtc accgatctga ctaaaaagca cctgaatgcc    240

acc                                                                  243

<210>3

<211>81

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>artificial

<221>CHAIN

<222>(1)..(81)

<400>3

Ala Ile Ile Glu Lys Pro Lys Val Lys Arg His Val Thr Thr Ala Leu

1               5                   10                  15

Lys Asp Leu Val Gly Gln Tyr Gly His Asp Arg His Leu Asp Lys Val

            20                  25                  30

Leu Asp Glu Ile Gln Asp Lys Leu Gln Cys Cys Gly Ala Glu Ser Pro

        35                  40                  45

Ala Asp Tyr Ser Arg Gly Pro Pro Pro Ser Cys Lys Asn Tyr Asn Glu

    50                  55                  60

Gly Cys Ile Gly Lys Val Thr Asp Leu Thr Lys Lys His Leu Asn Ala

65                  70                  75                  80

Thr

<210>4

<211>714

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>artificial

<400>4

atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg     60

gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc    120

ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac    180

atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg    240

ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg    300

aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat    360

catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa    420

ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctggacgacg acgacaaggc aataatagaa    480

aagccgaagg tgaaaagaca tgtcactaca gcattaaaag accttgtagg acaatacgga    540

cacgatagac acttagacaa agttttggac gaaattcaag ataaattaca atgttgtggt    600

gccgaatcgc ctgctgatta ttctcgagga ccacctccat catgtaagaa ttataatgag    660

ggatgcattg gtaaagtcac cgatctgact aaaaagcacc taaatgccac ctaa          714

<210>5

<211>714

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>artificial

<400>5

atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg     60

gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc    120

ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac    180

atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg    240

ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg    300

aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat    360

catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa    420

ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctggacgacg acgacaaggc aattattgaa    480

aagccgaagg tgaaacgtca tgtcactaca gcattaaaag accttgtagg acaatacgga    540

cacgatcgtc acttagacaa agttttggac gaaattcaag ataaattaca atgttgtggt    600

gccgaatcgc ctgctgatta ttctcgcgga ccacctccat catgtaagaa ttataatgag    660

ggatgcattg gtaaagtcac cgatctgact aaaaagcacc tgaatgccac ctaa          714

<210>6

<211>237

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>artificial

<221>CHAIN

<222>(1)..(237)

<400>6

Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp

1               5                   10                  15

Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp

            20                  25                  30

Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp

        35                  40                  45

Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn

    50                  55                  60

Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu

65                  70                  75                  80

Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser

                85                  90                  95

Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly

            100                 105                 110

Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

        115                 120                 125

Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln

    130                 135                 140

His Met Asp Ser Pro Asp Leu Asp Asp Asp Asp Lys Ala Ile Ile Glu

145                 150                 155                 160

Lys Pro Lys Val Lys Arg His Val Thr Thr Ala Leu Lys Asp Leu Val

                165                 170                 175

Gly Gln Tyr Gly His Asp Arg His Leu Asp Lys Val Leu Asp Glu Ile

            180                 185                 190

Gln Asp Lys Leu Gln Cys Cys Gly Ala Glu Ser Pro Ala Asp Tyr Ser

        195                 200                 205

Arg Gly Pro Pro Pro Ser Cys Lys Asn Tyr Asn Glu Gly Cys Ile Gly

    210                 215                 220

Lys Val Thr Asp Leu Thr Lys Lys His Leu Asn Ala Thr

225                 230                 235

<210>7

<211>53

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>artificial

<400>7

gaagatctgg acgacgacga caaggcaatt attgaaaagc cgaaggtgaa acg    53

<210>8

<211>26

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>artificial

<400>8

ctcaagctta ggtggcattc aggtgc                               26