使用全血的血液成分测定方法及测定试剂盒

摘要

在床边或诊室中迅速测定受到葡萄糖和/或其衍生物干扰的血液成分或者由患者在自己家中对其测定时，需要不使用离心分离机等而可以使用全血作为试样的测定方法。一种血液成分测定方法，用于测定受葡萄糖和/或其衍生物干扰的血液成分，其特征在于，包括将全血与能够将葡萄糖和/或其衍生物转变为不干扰测定的另一种物质的物质接触，并且同时或随后分离血细胞；一种用于该测定方法的装置；和一种包含该装置的试剂盒。

说明书

技术领域

本发明涉及受到葡萄糖和/和其衍生物造成的干扰的血液成分的测定方法，其特征在于使用全血，将全血与将葡萄糖和/或其衍生物转变为不干扰测定的物质的物质相互接触，并且同时或随后分离血细胞；测定使用的装置；以及包括该装置的试剂盒。  

背景技术

血液中电解质、蛋白质、非蛋白氮化合物、糖、脂质、酶等的测定称为临床化学检查，是疾病诊断、治疗及预防的重要检验。在用作试样的血液中除待测的目标物质以外还存在相当多的物质，经常干扰目标物质的测定。因此，采用在测定目标物质之前用试剂处理样本以避免干扰的技术。此时，通常对采集的全血进行离心等以预先得到血浆或血清。这是因为，当使用需要消除或转换干扰测定的成分的全血作为试样进行血液成分分析时，细胞成分如血细胞可能影响测定，由于溶血，血细胞的分离可能变得困难，大量存在于血细胞中的具有过氧化物酶活性的血红蛋白可能干扰测定，等等。

近年来，随着饮食变得更加丰富，糖尿病患者数量也在增加。为了预防糖尿病患者的并发症，血糖水平需要保持在接近健康人的水平，血糖水平自测定装置被广泛使用，使得患者可以在家里监测自己的血糖水平。但是，由于血糖水平随进食而改变，并且测定需要频繁进行，因此患者遭受沉重的负担。对于患者而言，由于知识的缺乏也难以解释测定值。

同时，1，5-脱水葡萄糖醇是不受进食的影响、检查糖尿病患者在过去的一周内血糖控制状态的极佳标记物，开发使用1，5-脱水葡萄糖醇的自测定试剂盒，其在家里只要一周一次测定就能够准确检查血糖控制状态，这对于患者将是极大的优势。另外，这在普查中也是有用的。但是，由于血液中1，5-脱水葡萄糖醇的浓度与血糖水平相比极低，并且血糖，即葡萄糖，干扰1，5-脱水葡萄糖醇的测定，因此，开发自测定试剂盒，包括直接使用痕量全血作为试样的自测定试剂盒，还没有实现。

另外，葡萄糖以高浓度存在于血细胞的细胞内液中，并且与跨细胞膜的细胞外液中的葡萄糖保持平衡。如果将细胞外液中的葡萄糖转变为不干扰测定的物质，则血细胞的细胞内液中的葡萄糖就会通过细胞膜释放并且干扰测定。

需要消除或转换干扰测定的成分的血成分分析例子包括以下公报中记载的那些。在专利文献中1，从全血中分离血细胞，然后通过抗坏血酸氧化酶除去干扰测定的成分抗坏血酸，测定肌酸酐。

在专利文献2、3和4中，使用血清而非全血作为样本来测定专利文献2中的山梨醇、专利文献3中的甘露糖和专利文献4中的肌醇。任何情况下，干扰测定的成分葡萄糖都在预处理中被消除或转变。

当测定1，5-脱水葡萄糖醇时，在专利文献5、6、7、8等中记载了使用血清而非全血作为样本。葡萄糖在专利文献5中被葡萄糖氧化酶氧化或者还被己糖激酶或葡萄糖激酶磷酸化，在专利文献6中被葡萄糖氧化酶或葡萄糖脱氢酶氧化，在专利文献7和8中被己糖激酶、己糖磷酸异构酶、和6-磷酸基果糖激酶或葡萄糖异构酶、果糖激酶和6-磷酸基果糖激酶转变为果糖-1，6-二磷酸，然后测定1，5-脱水葡萄糖醇。注意到在这些公报中，葡萄糖转变为葡萄糖酸-1，5-内酯、葡萄糖-6-磷酸、葡糖酸、果糖-6-磷酸、果糖等。

在这些血液成分的测定中，不直接使用全血作为试样，并且需要使用离心机和大量血液来分离血细胞，处理步骤很多。

另外，在专利文献1中记载了一种通过外部操作而结合构件的装置。

专利文献1：JP-B-07-36756

专利文献2：JP-A-08-298996

专利文献3：JP-A-2001-197900

专利文献4：JP-A-2001-190299

专利文献5：日本专利2983015号

专利文献6：JP-A-2001-78797

专利文献7：日本专利3170320号

专利文献8：日本专利3217180号

发明内容

发明要解决的问题

无论如何，近来，称为即时检验(Point of Care Testing)的在床边或门诊的快速测定以及患者自己在家中的测定已经日益实行。由于在这样的情况下难以使用离心机等，因此希望使用全血本身作为试样的测定方法。特别是患者自己在家里的测定中，使用刺血针装置采集的例如不超过几十μL的痕量血液用作试样。因此，使用离心机获得血清的测定方法不能应用。

解决问题的手段

本发明人为了解决上述问题进行了各种各样的研究。结果，他们发现了受到由葡萄糖和/或其衍生物造成的干扰的血液成分的测定方法，其中，使用全血作为试样并且不使用离心机等分离血细胞，并且完成了本发明。

即，本发明涉及以下各项。

(1)一种测定受到由葡萄糖和/或其衍生物造成的干扰的血液成分的方法，其特征在于，将全血与将葡萄糖和/或其衍生物转变为不干扰测定的物质的物质相互接触，并且同时或随后分离血细胞。

(2)根据上述(1)的血液成分的测定方法，其中，全血的量不超过20μL。

(3)根据上述(1)或(2)的血液成分的测定方法，其特征在于，通过使用血细胞分离过滤材料分离血细胞。

(4)根据上述(3)的血液成分的测定方法，其特征在于，血细胞分离过滤材料为玻璃纤维滤纸、纤维素滤纸、微孔材料、聚合物材料或作为其组合的构件。

(5)根据上述(1)至(4)中任一项的血液成分的测定方法，其中，将葡萄糖和/或其衍生物转变为不干扰测定的物质的物质是用于葡萄糖的酶促氧化或酶促磷酸化的物质。

(6)根据上述(1)至(5)中任一项的血液成分的测定方法，其特征在于，转变葡萄糖和/或其衍生物的物质包含选自由磷酸烯醇丙酮酸、α-酮戊二酸、草酰乙酸、乙酰磷酸、丙酮酸、3-磷酸甘油酸、磷酸肌酸、腺苷-5’-二磷酸、腺苷-5’-三磷酸、氧化或还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、和氧化或还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸组成的化合物组中的一种或多种化合物。

(7)根据(1)至(6)中任一项的血液成分的测定方法，其中，血液成分为1，5-脱水葡萄糖醇。

(8)一种用于根据(1)至(7)中任一项的血液成分测定方法的装置，其特征在于，包含血细胞分离部件和检测部件。

(9)根据(8)的装置，其中，血细胞分离部件和检测部件在测定前不接触，并且将这些部件相互接触以进行检测和定量。

(10)根据(8)的装置，其中，检测部件是使用涂布了试剂的电极的检测部件。

(11)一种测定试剂盒，包含根据(8)至(10)中任一项的装置和用于采集血液的刺血针装置，其中，血液成分为1，5-脱水葡萄糖醇。

发明效果

在受到葡萄糖和/或其衍生物造成的干扰的血液成分的测定方法中，通过将全血与将葡萄糖和/或其衍生物转变为不干扰测定的物质的物质接触并且同时或者随后分离血细胞，测定可以不受细胞成分如全血中的血细胞影响或者不引起干扰测定的溶血进行。另外，由于不使用离心机等，测定变得方便，并且可以简化测定装置或测定试剂盒的结构，从而降低成本。

附图说明

图1是实施例1所用装置的简化图；

图2是实施例2所用装置的简化图。

符号说明

1检测部件

2.检测部件支撑体

3.血细胞分离部件

4.支撑体

具体实施方式

以下，详细地说明本发明。

本发明是测定受到葡萄糖和/或其衍生物造成的干扰的血液成分的测定方法，其特征在于，将全血与将葡萄糖和/或其衍生物转变为不干扰测定的物质的物质相互接触，并且同时或随后分离血细胞。

本发明中使用的全血是处于未从中分离红血球的采集状态的血液，可以含有采血用的采血管中所含的抗凝血剂、糖解抑制剂等，如肝素、氟化钠和一碘乙酸。当使用保存血液时，优选通过含有氟化钠和肝素的采血管采血。

另外，本发明的全血包括不使用采血管等，通过自测血糖使用的刺血针装置等收集的血液。

采血部位没有特别限制，包括指尖以及前臂外侧、腹壁或上臂外侧。

根据本发明的测定方法，甚至可以使用少量的全血测定血液成分。例如，3至50μL、优选3至20μL就足够了。

通过本发明的测定方法测定的全血中的血液成分的例子包括1，5-脱水葡萄糖醇、山梨醇、甘露糖或肌醇，但是不限于这些糖或糖醇，只要在可能被葡萄糖和/或其衍生物干扰的全血的测定中，它们可以被测定即可。

本发明中将葡萄糖和/或其衍生物转变为不干扰测定的物质的物质没有特别限制，只要其不影响目标血液成分的测定即可。

其例子包括专利文献2至8中所述的将葡萄糖和/或其衍生物转变为不干扰测定的物质的上述物质，优选用于葡萄糖的酶促氧化或酶促磷酸化的物质。例如，可以使用下文对于葡萄糖的酶促氧化或酶促磷酸化的说明中所述的物质。本发明中将葡萄糖和/或其衍生物转变为不干扰测定的物质的物质是这样的物质，其通过诸如渗透压的作用使血细胞收缩或凝集，降低血细胞比容(血液粘度)并且因而促进血细胞从全血中分离，从而从较少量的全血中可以得到较大量的血浆和血清。其例子包括含有选自磷酸烯醇丙酮酸、α-酮戊二酸、草酰乙酸、乙酰磷酸、丙酮酸、3-磷酸甘油酸、磷酸肌酸、腺苷-5’-二磷酸(ADP)、腺苷-5’-三磷酸(ATP)、氧化型或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD(H))、和氧化型或还原型的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP(H))组成的化合物组中的一种或多种化合物的物质。

上述葡萄糖的酶促氧化或酶促磷酸化的例子包括：包括葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖的方法；包括在辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的存在下，通过葡萄糖脱氢酶氧化葡萄糖的方法；包含通过己糖激酶或葡萄糖激酶将葡萄糖磷酸化，并且在辅酶NAD⁺或NADP⁺的存在下通过葡萄糖-6-磷酸脱氢酶将得到的葡萄糖-6-磷酸氧化的方法；包括在腺苷-5’-二磷酸或腺苷-5’-三磷酸的存在下，使己糖激酶、磷酸己糖异构酶和6-磷酸果糖激酶起使用而将葡萄糖转变为果糖-1，6-二磷酸的方法；以及包括在二磷酸核苷(NDP)或三磷酸核苷(NTP)的存在下，使葡萄糖异构酶、果糖激酶和6-磷酸果糖激酶起作用而将葡萄糖转变为果糖-1，6-二磷酸的方法。

上述转变中使用的酶没有特别的限制，只要根据IUPAC-IUB命名法它们被分类为葡萄糖氧化酶(EC1.1.3.4)、葡萄糖脱氢酶(EC1.1.1.47，EC1.1.1.118，EC1.1.1.119，EC1.99.10)、己糖激酶(EC2.7.1.1)、葡萄糖激酶(EC2.7.1.2)；作为磷酸己糖异构酶的葡萄糖-6-磷酸酮醇异构酶(EC5.3.1.9)，葡萄糖异构酶(EC5.3.1.18)和果糖激酶(EC2.7.1.4)；和作为磷酸果糖激酶的磷酸己糖激酶(EC2.7.1.11)即可，并且也可以使用市售品。

另外，在包括葡萄糖氧化酶或葡萄糖脱氢酶氧化葡萄糖的方法中，也可以使用葡糖酸内酯酶(EC3.1.1.17)，将产生的葡萄糖酸-1，5-内酯完全转变为葡萄糖酸，如果需要，可以组合使用变旋酶(EC5.1.3.3)。使用NDP依赖性己糖激酶作为己糖激酶没有问题，特别是例如ADP依赖性己糖激酶。

在本发明的测定方法中，葡萄糖的酶促氧化或磷酸化的优选例子包括：包括由己糖激酶将葡萄糖磷酸化的方法，其特别优选的例子是在镁离子、ATP、磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸激酶的存在下，使用己糖激酶的酶循环法。

在本发明的测定方法中，血细胞的分离主要是指红血球的分离，其优选的例子包括适于在床边或门诊的上述快速测定如即时检验(Point of Care Testing)以及患者自已在家中测定、并且使用在极微量的全血测定中特别有效的血细胞分离过滤材料的血液分离方法。血细胞分离过滤材料没有特别限制，只要它们能够分离血细胞即可，可以使用公知的过滤材料。其例子包括玻璃纤维滤纸、纤维素滤纸、多微孔材料、聚合物材料及作为它们的组合的构件。

玻璃纤维滤纸优选密度为约0.02至0.09，保留粒径为约1至5μm。玻璃纤维的表面可以用亲水聚合物、作为糖结合蛋白的卵磷脂、作为两亲性脂质的卵磷脂或磷脂酰胆碱等处理。

纤维素滤纸没有特别限制，其例子包括常用的滤纸。

微孔材料的例子包括微孔膜和微孔载体，并且也能使用具有高度非对称结构的那些材料。微孔膜的例子包括聚砜膜和氟化聚合物膜。微孔载体的例子包括具有纳米/微米粒径的凝胶和微球(例如，珠和胶乳)，其基础材料的粒子包括聚合物如聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚(羟基甲基丙烯酸酯)和聚乙烯醇、和二氧化硅。微孔材料可以通过使其表面进行活性处理如氧等离子体处理而变得亲水。

聚合物材料优选亲水性聚合物材料，其例子包括纤维素衍生物如羧甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、明胶、琼脂糖、聚丙烯酸、马来酸酐的聚合物、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚赖氨酸和聚苯乙烯磺酸。上述玻璃纤维滤纸、纤维素滤纸和微孔材料可以用聚合物材料浸渍，使表面亲水，或者可以使聚合物材料自身象聚离子复合膜一样形成膜。

上述血细胞分离过滤材料可以单独使用或者作为其组合的构件使用。

另外，上述血细胞分离过滤材料可以提供到刺血针装置中，或者作为通过直接施加在下述检测使用的电极等之上或者施加在检测使用的电极的酶层等上而形成的膜状构件。

在本发明中，将葡萄糖和/或其衍生物转变为不干扰测定的物质的物质与全血，可以通过在血细胞分离前将这些物质混合而相互接触，或者通过使血细胞分离过滤材料负载将葡萄糖和/或其衍生物转变为不干扰测定的物质的物质而相互接触。另外，本发明包括这样的情况，其中将葡萄糖和/或其衍生物转变为不干扰测定的物质的物质的一部分被负载，并且葡萄糖和/或其衍生物与施加的试样中所含的物质一起转变为不干扰测定的物质。

在本发明的血液成分测定方法中，血液成分的检测方法没有特别限制，其例子包括通常的临床化学检查中使用的吸光度测定、使用电极等的电化学检测、以及免疫化学检验中使用的化学发光和电化学发光技术。

以下将进一步说明本发明的测定方法测定的血液成分是1，5-脱水葡萄糖醇的情况。1，5-脱水葡糖醇的测定方法包括已知方法，例如，包括在电子受体的存在下，使具有1，5-脱水葡萄糖醇氧化能力的酶起作用，并且测定反应后的耗氧量、还原的电子受体或反应产物的方法；以及包括使用1，5-脱氢葡萄糖醇脱氢酶进行定量的方法，所述1，5-脱氢葡萄糖醇脱氢酶在不存在电子受体的情况下，催化还原性着色材料的直接还原。另外，测定方法可以是这样的方法，其包括由1，5-脱氢葡萄糖醇-6-磷酸化酶将1，5-脱氢葡萄糖醇转变为1，5-脱氢葡糖醇-6-磷酸，在氧化辅酶的存在下由1，5-脱氢葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶将1，5-脱氢葡萄糖醇-6-磷酸脱氢，并且定量该反应中产生的成分或减少的成分。

具有1，5-脱氢葡萄糖醇氧化能力的酶的例子包括根据IUPAC-IUB命名法分类为吡喃糖氧化酶(EC1.1.3.10)和L-山梨糖氧化酶(EC1.1.3.11)的酶。其具体例子包括JP-A-63-185397所述的由钝头多孔菌(Polyporus obtusus)ATCC26733产生的吡喃糖氧化酶和由血红色陀螺孔菌(Trametes sanguinea)IFO4923产生的L-山梨糖氧化酶，JP-A-62-79780所述的由假单孢菌(Pseudomonas sp.)NK-85001产生的氧化酶，JP-A-2-268679所述的由真菌如皮壳正青霉(Eupenicilliumcrustaceum)(IFO-8938)产生的1，5-脱水葡萄糖醇脱氢酶，以及日本专利2872983号所述的由农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)NT1130株产生的1，5-脱水葡萄糖醇脱氢酶，其可以无需电子受体而将1，5-脱水葡萄糖醇脱氢。

另外，作为用于将1，5-脱水葡萄糖醇转变为1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸的方法或酶，可以直接使用为了消除或转变葡萄糖而由上述的己糖激酶或葡萄糖激酶将葡萄糖磷酸化的方法或试剂。具体使用的酶的例子包括己糖激酶、葡萄糖激酶和ADP依赖性己糖激酶。ADP依赖性己糖激酶的例子包括JP-A-2002-186497所述的由高嗜热古细菌(Pyrococcus furiosus)DSM3638株产生的酶。1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶的优选例子包括JP-A-10-191998所述的由大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)DH1(ATCC33849)产生的酶。

另外，可以使用市售的1，5-脱水-D-葡萄糖醇测定用试剂(Lana1，5-AG Auto Liquid：日本化药株式会社)。

另外，定量1，5-脱水葡萄糖醇的测定方法没有特别限制，可以使用吸光光度法、电化学检测法、化学发光技术、电化学发光技术等。

例如，对于吸光度检测使用的氧化发色基质，单独使用的色原例子包括N-羧甲基氨基羰基-4，4’-双(二甲氨基)联苯胺钠盐(DA64)、10-羧甲基氨基羰基-3，7-双(二甲氨基)吩噻嗪钠盐(DA67)、双[3-双(4-氯苯基)-甲基-4-二甲氨基苯基]胺(BCMA)、双[3-双(4-氯苯基)甲基-4-羧乙氨基苯基]胺、10-N-甲基氨基甲酰基-3，7-二甲氨基-10H-吩噻嗪(MCDP)、10-N-羧甲基氨基甲酰基-3，7-二甲氨基-10H-吩噻嗪(CCAP)、3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMBZ)和N，N，N’，N’，N”，N”-六(3-磺基丙基)-4，4’，4”-三氨基三苯基甲烷六钠盐(TPM-PS)。对于偶合色原，偶合体例子包括4-氨基安替比林(4AA)、3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH)和氨基联苯基化合物(NCP)，Trinder试剂的例子包括N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-琥珀酰乙二胺(EMSE)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3-甲氧基苯胺(TOOS)等。另外，对于还原发色底物，色原的例子包括2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑氯化物(INT)、3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑溴化物(MTT)、3，3’-[3，3’-二甲氧基-(1，1’-联苯)-4，4’-二基]-双[2-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑氯化物](NTB)、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑单钠盐(WST-1)、和2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑单钠盐(WST-3)。

电化学检测用的电极例子包括金、铂、碳、钯和银。测定方法的例子包括安培法(电流测定法)、库仑法(电量测定法)、电位扫描法(potential sweep method)和循环伏安法。另外，当然可以使用电子授受媒介的介体，并且氧化介体和还原介体均可以使用。其中，更优选氧化介体，可以使用已知的化合物。优选的例子包括氰铁酸盐、醌化合物、锇(III)络合物和其锇(III)聚合物。

另外，作为本发明的测定方法，也可以使用这样的方法，其中使ADP依赖性己糖激酶在ADP的存在下起作用，将葡萄糖和1，5-脱水葡萄糖醇分别转变为葡萄糖-6-磷酸和1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸；使磷酸葡萄糖异构酶(磷酸己糖异构酶)和6-磷酸果糖激酶起作用，将葡萄糖-6-磷酸转变为果糖-1，6-二磷酸；和使1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶在辅酶NAD⁺或NADP⁺的存在下起作用，测定1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸。

本发明还包括可以用于上述血液成分测定方法的具有血细胞分离部件和检测部件的装置。血细胞分离部件用于进行上述的血细胞分离，而检测部件用于进行上述的血液成分检测。装置中这些部件的布置可以是垂直的或水平的，并且这些部件可以相互接触或者不接触。当这些部件不接触时，其形状和位置没有特别限制，只要部件在检测时能够相互接触即可。例如，当这些部件的整个表面相互不接触时，血细胞分离部件和检测部件可以完全分离或者一端或两端的一部分可以接触。“在检测时能够相互接触”的表述是指在添加试样后，部件可以手动或自动地相互接触，从而可以在葡萄糖和/或其衍生物转变为不干扰测定的物质或血细胞分离所需的时间后，进行检测和定量。在简便的测定中，这些部件优选在添加试样后相互接触数秒至数分钟。血细胞分离部件和检测部件的整个表面或其部分可以相互接触。

另外，当血细胞分离部件和检测部件相互接触时，可以在血细胞分离前，预先使全血与将葡萄糖和/或其衍生物转变为不干扰测定的物质的物质接触。

检测部件没有限制，只要其具有基于上述检测方法如吸光光度法、使用电极等的电化学检测法、化学发光法和电化学发光法的结构即可。

作为本发明装置的例子，图1和图2中示出了简图。

本发明还包括1，5-脱水葡萄糖醇测定试剂盒，其包含上述的装置和采血用的刺血针装置。

刺血针装置没有特别限制，只要其可以收集约数十μL或以下的全血即可，并可以是与血糖水平自测定装置附带的刺血针装置相同的装置。

实施例

参考以下实施例更具体地说明本发明，但是，本发明的范围不限于这些实施例。

实施例1

1)葡萄糖转变试剂

在25.0mM 2-(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基)乙烷磺酸(HEPES)缓冲液(pH7.5)中，将如下各成分以如下组成溶解：7.38mM MgCl₂、49.6mMKCl、24.0mM磷酸烯醇丙酮酸(PEP)、1.0mM ATP、10U/mL丙酮酸激酶(PK)、8U/mL葡萄糖激酶、100mM NaCl、0.1mM亚乙基二氧基四乙酸二钠盐(EDTA·2Na)、0.1％ NaN₃、0.6g/L牛血清白蛋白(BSA)、0.05％非离子表面活性剂HS210(NOF公司)、0.1mM氰铁酸钾和5U/mL辣根过氧化物酶(HRP)，将pH调至7.5，制备成葡萄糖转变试剂。

2)着色剂

8mM NCP-04(N-甲基-N-苯基对苯二胺)和8mM TOOS以该组成溶解于70％(v/w)乙醇，制备成着色试剂。

3)酶试剂

500U/mL 1，5-脱水葡萄糖醇氧化酶和500U/mL HRP以该组成溶解于1.0M磷酸盐缓冲液中，将pH调至7.5，制备成酶试剂。

4)酶发色试验纸

Biodyne A膜(PALL公司)10mm×45mm室温下在上述2)得到的着色试剂中浸渍10分钟，并在50℃干燥20分钟。然后，将膜在上述3)得到的酶试剂中浸渍过夜，并同样地在50℃干燥20分钟。

将膜切成5mm×5mm片，得到酶发色试验纸。

5)装置

如图1所示，将血细胞分离部件3(血细胞分离用的Hemasep L5mm×16mm：PALL公司)粘贴到支撑体4(白色PET 5mm×50mm)的粘合面上，同时把其左端对齐。另外，将上述酶发色试验纸作为检测部件1粘贴到检测部件支撑体2(Arcare 8192透明PET 5mm×40mm：Adhesives Research Inc.)的粘合面上，同时把其左端对齐。最后，将检测部件支撑体2粘贴到支撑体4(白色PET 5mm×50mm)的粘合面上，使得检测部件1的整个表面与血细胞分离部件3的右端重叠。从而制备了装置。

6)校准曲线制作

为了制作1，5-脱水葡萄糖醇的校准曲线，将3个各15μL的已知浓度全血样本(通过后述参考例1的程序得到的试样中1，5-脱水葡萄糖醇的浓度为8.9、18.5和28.5μg/mL)与15μL的葡萄糖转变试剂在Eppendorf管中混合，并静置5分钟。然后，将反应混合物各15μL滴加到图1中血细胞分离部件3的试样施加位置。当血细胞分离后的血浆到达可以接触检测部件1(酶发色试验纸)的血细胞分离部件3的部位时，检测部件1受压，并且60秒后通过使用反射光度计(测色计SUPER COLOR SP-80：东京电色株式会社制)测定吸光度。由吸光度和1，5-脱水葡萄糖醇的浓度制作校准曲线。

7)测定程序

准备测定1，5-脱水葡萄糖醇的6名正常受试者的全血各15μL，与15μL葡萄糖转变试剂在Eppendorf管中混合并静置5分钟。然后，将反应混合物各15μL滴加到图1中血细胞分离部件3的试样施加位置。当血细胞分离后的血浆到达可以接触检测部件1(酶发色试验纸)的血细胞分离部件3的部位时，检测部1受压，并且60秒后通过使用反射光度计测定吸光度。6个全血试样中的1，5-脱水葡萄糖醇量由校准曲线得到。结果如表1所示。

参考例1

将用于实施例1的7)中测定的6名正常志愿者的相同全血样本、在3000rpm下离心5分钟，并通过使用1，5-脱水-D-葡萄糖醇测定试剂(Lana 1，5AG Auto Liquid：日本化药株式会社)和自动分析仪7150(日立株式会社)的通常方法，利用以下参数测定上清液中的1，5-脱水葡萄糖醇。结果如表1所示。

分析方法                       2端点法(2 point ends)

读取点                         24-50

样本体积                       8μL

Lana 1，5AG Auto Liquid的

预处理试剂(R1)                 240μL

Lana 1，5AG Auto Liquid的

发色试剂(R2)                   120μL

温度                           37℃

测定波长                       (副/主)

                               700/546nm

[表1]

1，5-脱水葡萄糖醇浓度(μg/mL)

 参考例1    实施例1全血样本1全血样本2全血样本3全血样本4全血样本5全血样本6 15.1 19.9 25.1 15.4 21.3 17.5    15.7    20.2    26.0    14.7    20.4    17.3

使葡萄糖转变试剂对其起作用而将葡萄糖转变为不干扰测定的物质、从其中分离血细胞、并且其进一步与检测试剂接触的全血中，1，5-脱水葡萄糖醇的测定值与通过已知方法得到的参考例1的测定值非常一致，说明1，5-脱水葡糖醇可以通过本发明测定。

实施例2

1)葡萄糖转变试剂

在10.0mM的2-吗啉代乙磺酸(MES)缓冲剂中，以如下组成溶解各成分：17.6mM MgCl₂、17.6mM KCl、175.7mM磷酸烯醇丙酮酸(PEP)、17.6mM ATP、123U/mL丙酮酸激酶(PK)、97U/mL己糖激酶和20U/mL抗坏血酸氧化酶，将pH调至7.0，得到葡萄糖转变试剂。

2)电极试剂

16mg/mL锇(III)络合物([Os(III)(二吡啶基)₂(咪唑基)₂Cl]Cl₂)和465.2U/mL 1，5-脱水葡萄糖醇氧化酶以该组成溶解于纯水，制备成电极试剂。

3)传感器芯片

碳电极的检测部件1涂敷4μL上述2)得到的电极试剂，并在50℃干燥13分钟，得到传感器芯片。

4)装置

如图2所示，将血细胞分离部件3(血细胞分离用的Hemasep L5mm×15mm：PALL公司)粘贴到传感器芯片的检测部件1上，使得最远端被覆盖。由此，制备了装置。

5)校准曲线制作

为了制作1，5-脱水葡萄糖醇的校准曲线，将3个各20μL的已知浓度全血样本(通过上述参考例1的程序得到的样本中1，5-脱水葡萄糖醇的浓度为9.4、18.6和42.6μg/mL)与10μL的葡萄糖转变试剂在Eppendorf管中混合，并静置5分钟。然后，将反应混合物各20μL滴加到图2中血细胞分离部件3的样本添加位置。80秒后，血细胞分离后的血浆到达检测部件1(电极试剂)，将0.15V的电压施加10秒。5秒后使用电化学检测器(带GPIB RS232C的8-channel multipotentiostat，MODEL PS-08：东方技研)测定电流。由电流值和1，5-脱水葡萄糖醇的浓度制作校准曲线。

6)测定程序

准备测定1，5-脱水葡萄糖醇的4名正常受试者的全血各20μL，与10μL葡萄糖转变试剂在Eppendorf管中混合并静置5分钟。然后，将反应混合物各20μL滴加到图2中血细胞分离部件3的试样添加位置。80秒后，血细胞分离后的血浆到达检测部件1(电极试剂)，将0.15V的电压施加10秒。5秒后通过使用电化学检测器测定电流。4个全血试样中的1，5-脱水葡萄糖醇量由校准曲线得到。结果如表2所示。

参考例2

通过参考例1相同的方法，测定与实施例2的6)中测定的相同全血试样中的1，5-脱水葡萄糖醇。结果如表2所示。

表2

1，5-脱水葡萄糖醇浓度(μg/mL)

    参考例2    实施例2全血样本7全血样本8全血样本9全血样本10    17.5    24.4    28.2    31.5    18.2    24.5    26.8    32.5

使葡萄糖转变试剂对其起作用而将葡萄糖转变为不干扰测定的物质、从其中分离血细胞、并且其进一步与电极试剂反应的全血中，1，5-脱水葡糖醇的测定值与通过已知方法得到的参考例2的测定值非常一致，说明1，5-脱水葡萄糖醇可以通过本发明测定。