一种大片段DNA克隆载体的构建方法

摘要

本发明公开了一种简单快捷构建克隆载体的方法，简称LJY法和用此方法已构建好的4个克隆载体。本发明以pBR322的AmpR基因和ori复制起始点为骨架，通过独特的引物设计方法和平端连接，可简单快速地在新构建的克隆载体质粒中引入所需的限制性内切酶识别位点，并有效地提高载体的外源基因容量和稳定性，避免大片段基因克隆时常出现的目的基因意外突变等问题。

说明书

技术领域

本发明涉及生物克隆技术，尤其涉及一种简单快捷构建大片段DNA克隆载体的方法。

背景技术

在分子生物学中，克隆DNA片段是一项常规工作。自从Cohen等(1973)引入质粒pSC101作克隆载体以来，目前已有大量性能优良的载体质粒被成功构建并实现商业化生产。现在使用的载体除了pBR322，pUC系列，pGEM系列，噬菌体，粘粒外，还有酵母人工染色体，细菌人工染色体等，这些载体虽已被广泛应用，但由于其中的外源基因克隆窗口区域的限制性内切酶识别位点不容易替换，给克隆一些特异DNA片段，尤其是较大的片段，带来很多困难。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的简单快捷构建大片段DNA克隆载体的方法，即LJY法。

本发明的技术方案是提供一种大片段DNA克隆载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)在基准引物VF和VR的5’端添加所需限制性内切酶识别位点并合成扩增引物V1F和V1R；

(2)以pBR322为模板，用所合成的扩增引物V1F、V1R扩增载体骨架；(3)回收载体骨架片段，溶于3.5μl灭菌的超纯水中，加入反应液1.5μl至终浓度为1mM，孵育；

(4)加入5μ LDNA Ligation Kit(Mighty Mix)，进行连接；

(5)取(4)连接产物转化入DH5 α感受态细胞中，涂布Amp⁺的LB平板培养基后，于37℃培养14～16h，挑取单菌落于含有Ampicilline的LB液体培养基中37℃振荡培养5～6h；

(6)以扩增引物V1F和V1R为检测引物，对可疑菌落进行菌落PCR检测，取可疑质粒，人为引入特异性限制性内切酶进行酶切鉴定或测序鉴定，最终得到的阳性重组质粒即为目的载体质粒。

步骤(1)所述的基准引物VF和VR序列分别为：

VF.：5’-cggaacatgtgagcaaaa-3’；

VR：5’-cttcaataatattgaa-3’。

步骤(2)所述载体骨架是以pBR322的Amp^R基因和ori复制起始点为骨架。

步骤(2)所述扩增条件为94℃ 2min；98℃ 15s，50℃ 15s，72℃ 2min，30个循环；72℃10min。

步骤(3)所述反应液为10×T4 Polynucleotide Kinase buffer0.5μL、T4 Polynucleotide Kinase 5U和ATP 0.5μl。

步骤(3)所述孵育是于37℃孵育30min。

步骤(4)所述连接是5’端于25℃反应连接30min或平滑末端于16℃反应连接30min。

本发明具有以下有益效果：

(1)本发明通过独特的引物设计方法和平端连接，可简单快速地在新构建的克隆载体质粒中引入所需的限制性内切酶识别位点，并有效地提高载体的外源基因容量和稳定性，避免大片段基因克隆时常出现的目的基因意外突变等问题。用本发明构建的克隆载体分子量小，拷贝数较高，以大肠杆菌为寄主，转化率高；

(2)多克隆位点的限制性内切酶识别位点可根据需要随意添加，比一般的克隆载体质粒灵活性大；

(3)能插入较大的外源DNA(≥8.2Kb)；

(4)具有容易操作的检测表型(AmpR)；

(5)以pBR322的AmpR基因和ori复制起始点为骨架，使用该方法所构建的DNA克隆载体能够使所插入的外源基因片段较稳定的复制，包括一些对菌体有毒性的基因；

(6)本发明自环-平端连接也可以针对重组DNA质粒上的特定位置设计引物，进行定点突变、短序列的插入或基因的敲除。

附图说明

图1本发明自环-平端连接示意图

具体实施方式

实施例1

一、材料

1.质粒和菌株：pBR322克隆载体(accession No.：J01749)，用于骨架扩增的模板，购自Takara公司。DH5 α感受态细胞由华南农业大学禽病教研室保存。

2.酶和其他试剂：T4 Polynucleotide Kinase、PrimeSTAR^HS DNA Polymerase和DNA Ligation Kit<Mighty Mix>购自Takara公司。Gel Extraction Kit和Plasmid mini Kit(200)购自OMEGA公司。

3.引物：依照pBR322克隆载体序列，设计基准引物(VF，VR)用于扩增含有Amp和ori的2471-4180区域，由Takara公司合成，序列为：

VF：5’-cggaacatgtgagcaaaa-3’

VR：5’-cttcaataatattgaa-3’

具体操作步骤：

见附图1连接示意图，其中A：载体骨架，包括pBR322的AmpR基因和ori复制起始点；B，C：待引入的限制性内切酶识别位点；VF，VR：基准引物。

(1)在基准引物(VF，VR)的5’端添加所需限制性内切酶识别位点并合成扩增引物(V1F，V1R)；

(2)以pBR322为模板，用所合成的扩增引物(V1F，V1R)按照如下程序扩增出载体骨架：94℃ 2min；98℃ 15s，50℃ 15s，72℃2min，30个循环；72℃10min；

(3)回收载体骨架片段，溶于3.5μl灭菌的超纯水中，向其中加入下列反应液：10×T4 Polynucleotide Kinase buffer 0.5μL，T4 Polynucleotide Kinase 5U，ATP0.5μl至终浓度为1mM，37℃孵育30min；

(4)加入等量的(5μL)DNA Ligation Kit(Mighty Mix)，25℃ 30min(若为平滑末端则推荐使用16℃30min的连接条件)；

(5)取连接产物转化入DH5 α感受态细胞中，涂布Amp+的LB平板培养基后，于37℃培养14-16h，挑取单菌落于含有Ampicilline的LB液体培养基中37℃振荡培养5-6h；

(6)以扩增引物(V1F，V1R)为检测引物，对可疑菌落进行菌落PCR检测，取可疑质粒，用特异性(人为引入)限制性内切酶进行酶切鉴定或测序鉴定。最终得到的阳性重组质粒即为目的载体质粒。