首页> 中国专利> 江浙腹蛇蛇毒双链肽、其制备方法及应用

江浙腹蛇蛇毒双链肽、其制备方法及应用

摘要

本发明公开了从江浙腹蛇蛇毒中所分离出具有溶血栓活性的蛋白单体或有效部位,并公开了该蛋白单体的氨基酸序列。本发明还公开了从江浙腹蛇蛇毒中分离出这些具有溶血栓活性的蛋白单体或有效部位的方法。体外以及体内的溶血栓活性试验表明,从江浙腹蛇蛇毒中所分离的蛋白单体和有效部位具有确切的溶血栓活性,能用于溶血栓治疗。

著录项

  • 公开/公告号CN101190943A

    专利类型发明专利

  • 公开/公告日2008-06-04

    原文格式PDF

  • 申请/专利权人 首都医科大学;

    申请/专利号CN200610144241.9

  • 发明设计人 彭师奇;赵明;王超;王宇伟;

    申请日2006-11-30

  • 分类号C07K14/46;A61K38/17;A61P7/02;

  • 代理机构北京科龙寰宇知识产权代理有限责任公司;

  • 代理人孙皓晨

  • 地址 100054 北京市右安门外西头条10条

  • 入库时间 2023-12-17 20:11:07

法律信息

  • 法律状态公告日

    法律状态信息

    法律状态

  • 2015-01-14

    未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C07K14/46 授权公告日:20100609 终止日期:20131130 申请日:20061130

    专利权的终止

  • 2010-06-09

    授权

    授权

  • 2008-07-30

    实质审查的生效

    实质审查的生效

  • 2008-06-04

    公开

    公开

说明书

技术领域

本发明涉及具有溶血栓活性的多肽或有效部位、其分离方法及应用,尤其涉及从江浙腹蛇蛇毒中逐级分离出的具有溶血栓活性的蛋白单体或有效部位,本发明还涉及这些蛋白单体或有效部位的分离方法以及它们作为溶血栓剂的应用,属于生物医药领域。

背景技术

蛇毒作为药物用于疾病治疗已有近2千年历史。在蛇毒治疗的一系列重大疾病中,血栓受到格外的重视。腹蛇蛇毒对血栓的确切作用使得“腹蛇抗栓酶”于1970年代进入临床作为溶血栓剂。“腹蛇抗栓酶”的活性成分是江浙腹蛇蛇毒。与其他蛇毒一样,江浙腹蛇(Agkistrodon halys pallas)蛇毒是诸多蛋白质的混合物。虽然“腹蛇抗栓酶”从1970年代便作为溶血栓剂用于我国临床,但是“腹蛇抗栓酶”的活性成分到底是江浙腹蛇蛇毒中的什么蛋白,以及作为溶血栓剂活性蛋白的代表具有怎样的序列,至今都不清楚。

发明内容

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足,从江浙腹蛇蛇毒中分离得到具有确切溶血栓活性的蛋白单体或有效部位。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的:

具有溶血栓活性的江浙腹蛇蛇毒蛋白(f3-5-2),该蛇毒蛋白是双链蛋白,是SEQID NO:1和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种从腹蛇蛇毒中分离具有确切溶血栓活性的有效成分或部位的方法。

本发明所要解决的另一个技术问题是通过以下技术方案来实现的:

从腹蛇蛇毒(简称f0)中分离具有确切溶血栓活性的蛋白单体或有效部位的方法,包括:

1.用凝胶色谱柱将粗蛇毒干粉(f0)分离,按照保留时间和对应的紫外峰分别收集洗脱液,得到f1、f2 f3和f4共4种组分;

2.将步骤(1)所分离的f3上阴离子交换树脂色谱柱,采用阶段梯度洗脱法,按阶段收集洗脱液,依次得到f3-1、(f3-2、f3-3、f3-4、f3-5、f3-6、f3-7和f3-8共8种组分;

3.将步骤(2)所分离得到的f3-5上阴离子交换疏水色谱柱,按照流出时间和对应的紫外峰,将f3-5分离为f3-5-1、f3-5-2和f3-5-3共3种组分。

优选的,步骤(1)中所述的分离方法如下:样品上Sephadex G-100凝胶色谱柱后,色谱柱用NH4Ac水溶液洗脱,洗脱剂的流速为0.5ml/min,在280nm处监测出峰情况并按下述条件收集f1、f2 f3和f4共4种组分:f1的保留时间为0.8h,对应的紫外峰吸收为1000mAU;f2的保留时间为1h,对应的紫外峰吸收为480mAU;f3的保留时间为1.3h,对应的紫外峰吸收为250mAU;f4的保留时间为2.3h,对应的紫外峰吸收为180mAU。

步骤(2)中将f3分离为f3-1、(f3-2、f3-3、f3-4、f3-5、f3-6、f3-7和f3-8共8种组分的分离方法优选如下:将f3上DEAE Saphrose Fast Flow阴离子交换树脂色谱柱,用Tris-HCl缓冲液作洗脱剂,该缓冲液的pH为8.1;采用阶段梯度洗脱法,阶段梯度为0-0.05-0.08-0.11-0.14-0.17-0.20-0.25M NaCl,各阶段洗两个柱体积,洗脱剂的流速为2.2ml/min;按阶段收集洗脱液,依次得到f3-1、(f3-2、f3-3、f3-4、f3-5、f3-6、f3-7和f3-8共8种组分;

步骤(3)中将f3-5分离为f3-5-1、f3-5-2和f3-5-3共3种组分的分离方法优选如下:将f3-5上疏水色谱柱HiTrap Phenyl FF,用下述3种洗脱剂依次进行梯度洗脱:3ml含2N(NH4)2SO4的50mMTris-HCl缓冲液、1.5ml含2N 2N(NH4)2SO4的50mMTris-HCl Buffer和1.5ml双蒸水的混合溶液、12ml双蒸水;洗脱剂的流速为1.0ml/min;按流出时间和对应的紫外峰将得到的馏份分成f3-5-1 f3-5-2和f3-5-3三种组分,其中,f3-5-1的相对保留时间为3.0min,对应的紫外峰吸收为670mAU;f3-5-2的相对保留时间为6.0min,对应的紫外峰吸收为550mAU f3-5-3的相对保留时间为8.5min,对应的紫外峰吸收为490mAU;对应于高盐的洗脱峰的馏份为f3-5-1,对应于水洗脱峰的馏份为f3-5-2和f3-5-3

本发明首先将从腹蛇蛇毒(简称f0)中分离得到f1、f2 f3和f4共4种组分,采用体外优球蛋白溶解实验和优球蛋白平板实验平板实验测定了所分离的4种组分(f1-4)的溶解血栓活性,经过活性测定,f3被锁定为江浙腹蛇蛇毒溶血栓的活性部

位。在DEAE Saphrose Fast Flow阴离子交换树脂色谱柱上将f3分离为8种组分(简称f3-(1-8)),用体外优球蛋白溶解实验测定f3-(1-8))的活性,f3-5被锁定为江浙腹蛇蛇毒溶血栓活性好的组分。最后,本发明用HiTrap Phenyl FF(high sub)阴离子交换树脂色谱柱,将f3-5分离为3种江浙腹蛇蛇毒组分(简称f3-5-1、f3-5-2和f3-5-3),用体外优球蛋白溶解实验测定了f3-5-1、f3-5-2和f3-5-3的溶血栓活性,f3-5-2被锁定为江浙腹蛇蛇毒溶血栓活性最好的组分。用Applied Biosystems Procise-Procise 491/auto-PE491Protein sequencer序列仪测定f3-5-2N末端的氨基酸序列,确定了f3-5-2的末端序列,通过文献检索确定了f3-5-2的全部氨基酸序列。此外,本发明用大鼠血栓模型测定了f3-5-2的体内溶血栓活性,试验结果表明,f3-5-2具有较强的溶血栓活性。

附图说明

图1  f1-4的SDS-PAGE电泳图。

图2  f3-(1-8)的SDS-PAGE电泳图。

图3  f3-5-2优球蛋白平板试验结果(三个点的直径分别为6mm、6mm和8mm)。

图4  f3-7-2的SDS-PAGE电泳图。

图5  f3-5-2的质谱图。

为了进一步阐述本发明,下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的,它们仅用来对本发明进行具体描述,不应当理解为对本发明的限制。

具体实施方式

实施例1.粗蛇毒干粉(f0)的分离

将0.1g粗蛇毒干粉(f0)(购自广西医学院蛇毒研究所)溶于2ml去离子水配成0.05g/ml的蛇毒水溶液。将得到的水溶液上到SephadexG-100凝胶色谱柱。色谱柱的直径为3.0cm、填料高度为100cm。色谱柱用NH4Ac水溶液(0.005mol/l)洗脱,洗脱剂的流速为0.5ml/min,在280nm处监测出峰情况并收集馏份。将得到的馏份按流出时间(峰1:RT=0.8h、峰2:RT=1h、峰3:RT=1.3h、峰4:RT=2.3h[RT=保留时间])和对应的紫外峰(紫外峰吸收:峰1:1000mAU、峰2:480mAU、峰3:250mAU、峰4:180mAU)分成组份1-4个组分(简称f1-4)。分别按照本发明规定的条件收集f1、f2、f3和f4馏份。即f1的保留时间为0.8h,对应的紫外峰吸收为1000mAU。f2的保留时间为1h,对应的紫外峰吸收为480mAU。f3的保留时间为1.3h,对应的紫外峰吸收为250mAU。f4的保留时间为2.3h,对应的紫外峰吸收为180mAU。上样100mg时的回收率见表1。

f1-4的构成由电泳图1定义(SDS-PAGE,12.5%Polyacrylamide gel;AmershamPharmacia Biotech AB生产的Hoefer mini VE电泳仪;Marker为AmershamPharmacia Biotech AB生产的Low molecular weight calibration kit,从小到大分子质量为14400、20100、30000、45000、66000和97000)。从图1可以看出,f1是大约含有6个条带的混合物,主要组分的分子量大约为60000道尔吨,其余分子量的条带都十分微弱。f2也是大约含有6个条带的混合物,主要组分的分子量也大约为60000道尔吨,只是分子量接近30000的2个条带的量明显比f1小。f3是大约含有5个条带的混合物,3个主要组分的分子量大约为16000、25000和31000道尔吨,其余分子量的条带都比较微弱。F4也是大约含有5个条带的混合物,3个主要组分的分子量大约为17000、20000和31000道尔吨,其余分子量的条带都比较微弱。

表1使用Sephadex G-100色谱分离得到的蛇毒各组份

  收率  f1  f2  f3  f4  mg  20  22  8  11  %  20.0  22.0  8.0  11.3

实施例2.f1-4的体外优球蛋白溶解实验

1、取9份全血与1份3.8%枸橼酸钠溶液混合,立即以3000r/min离心10min,分离出贫血小板的血浆。

2、准备50ml的离心管,每管先加2ml猪血浆,再加36ml超纯水。

3、每管中再加0.4ml1%HAC,充分混合。

4、离心管放入4℃冰箱冷冻10min。

5、看到优球蛋白沉淀后以3000r/min离心5min。

6、离心管倒置,使液体流干,最后用滤纸吸干管内壁,勿使液体残留。

7、每离心管加2ml硼砂(pH=9)缓冲液,用玻璃棒搅匀使溶解,得血浆溶液。合并各管血浆溶液。

8)21个玻璃管事先各加入0.05ml凝血酶,再加0.45ml血浆溶液,记录优球蛋白块的体积。

9、将f1-4用双蒸水溶解,配置终浓度为1mg/ml的f1-4样品溶液。

10、将尿激酶用双蒸水溶解,配置终浓度为6.3U/ml的尿激酶溶液。

11、各测定管加入0.1ml f1-4样品溶液。

11、两个对照管分别加入0.1ml水和0.1ml尿激酶溶液。

12、所有的管都放入35℃的恒温槽中孵化。

13、每隔一小时观察一次,记录读数。结果见表2。

表2 组分f1-4的优球蛋白溶解活性

  组分  优球蛋白体积减量  (X±SDml)  f1  0.18333±0.10408  f2  0.16000±0.01732  f3  0.36667±0.02887  f4  0.106667±0.01155  水  0.005±0.007  尿激酶  0.41000±0.1559

n=5

从表2的数据值可以看出,f3的优球蛋白溶解活性与尿激酶无明显差异,在4种馏份中f3的活性最强。

实施例3 f1-4的优球蛋白平板实验

1)取9份全血与1份枸橼酸钠溶液(3.8%)混合,立即3000r/min离心10min,分离出贫血小板血浆。

2)50ml离心管中每管先加2ml猪血浆,接着加36ml超纯水,再加0.4ml1%HAC。

3)充分混合。

4)离心管放入4℃冰箱冷冻10min。

5)看到优球蛋白沉淀后以3000r/min离心5min。

6)离心管倒置,使液体流干,最后用滤纸吸干管内壁,勿使液体残留。

7)每离心管加2ml硼砂(pH=9)缓冲液,用玻璃棒搅匀使溶解得血浆溶液。合并各管血浆溶液。

8)将f1-4用双蒸水溶解,配置终浓度为0.8mg/ml的f1-4溶液。

9)将优球蛋白的硼砂溶液倒至于平皿中,加入凝血酶,使其凝固,在平皿中形成一层薄的优球蛋白凝固平板。

10)将10μl f1-4溶液滴加入到优球蛋白平板上,每两点之间的间隔大于或等于1.5cm。

11)记录优球蛋白平板上形成的溶解圈的直径。结果见表3。

表3 组分f1-4在优球蛋白平板上形成的溶解圈直径

  组分  溶解圈直径(X±SD mm)  f1  2.64±0.27  f2  2.34±0.22  f3  5.80±0.29  f4  3.55±0.28  水  0.01±0.02  尿激酶  6.14±0.30

n=5

从表3的数据值可以看出,f3的优球蛋白溶解活性与尿激酶无明显差异,在4种馏份中f3的活性最强。

实施例4.f3的分离

将实施例1得到的f3继续进行分离。采用DEAE Sapharose Fast Flow阴离子交换树脂。柱体积:1.6cm×12cm。用Tris-HCl缓冲液作洗脱剂,该缓冲液的pH为8.1。采用阶段梯度洗脱法,阶段梯度为0-0.05-0.08-0.11-0.14-0.17-0.20-0.25M NaCl。各阶段洗两个柱体积。洗脱剂的流速为2.2ml/min。分离到的8个组分的收率见表4。

表4从f3分离得到的8种组份的收率

  组份  f3-1  f3-2  f3-3  f3-4  f3-5  f3-6  f3-7 f3-8  收率(%)  6.7  3.6  10.87  11.7  10.1  5.3  5.2  7.4

f3-(1-8)的构成由电泳图2定义(SDS-PAGE,12.5%Polyacrylamide gel;AmershamPharmacia Biotech AB生产的Hoefer mini VE电泳仪;Marker为AmershamPharmacia Biotech AB生产的Low molecular weight calibration kit,从小到大分子质量为14400、20100、30000、45000、66000和97000。从左到右分别对应于Marker、f3-1、f3-2、f3-3、f3-5、f3-6、f3-7和f3-8。可以看出只有f3-7有比较单一的条带。在NaCl的浓度为0.2M时,分离到的f3-7的保留时间为2.5h。所有组分的蛋白分子量多集中在14k与20.1k、31k附近。

实施例5 f3-(1-8)的体外优球蛋白溶解实验

1)取9份全血与1份3.8%枸橼酸钠溶液混合,立即以3000r/min离心10min,分离出贫血小板的血浆。

2)往50ml的离心管中加2ml猪血浆,接着加36ml超纯水,再加0.4ml HAC(1%)。

3)充分混合。

4)离心管放入4℃冰箱中冷冻10min。

5)可看到优球蛋白的沉淀后3000r/min离心5min。

6)倒置离心管,待液体流干,最后用滤纸吸干管内壁,勿使液体残留。

7)各离心管中加2ml硼砂(ph=9)缓冲液,用玻璃棒搅匀溶解各管合并。

8)21个玻璃管事先各加入0.05ml凝血酶,再加0.45ml血浆溶液,记录优球蛋白块的体积。

9)将f3-(1-8)用双蒸水1∶1溶解,配制终浓度为1mg/ml的样品溶液。

10)各管加入0.1ml样品溶液。

11)用水和尿激酶作对照。

12)放入35℃的恒温槽中孵化7h,记录优球蛋白块的体积。

13)计算优球蛋白块体积的减少量,结果列入表5。

表5 组分f3-(1-8)的优球蛋白溶解活性

  组分  优球蛋白体积减量  (X±SD ml)  f3-1  0.053±0.003  f3-2  0.05±0.002  f3-3  0.022±0.001  f3-4  0.040±0.050  f3-5  0.183±0.001  f3-6  0.107±0.003  f3-7  0.193±0.002  f3-8  0.050±0.001  尿激酶  0.120±0.03

n=5

从表5可以看出在同样的条件下,得到的结果说明f3-5、f3-6、f3-7具有明确的优球蛋白溶解活性。其中f3-5和f3-7的优球蛋白溶解活性与尿激酶无明显差异,在8种馏份中活性最强。由于f3-5在8种馏份中属于比较主要的馏份(见表4的收率)以及与f3-7无交叉的馏份(见图2的电泳),所以作进一步分离。

实施例6 f3-5的分离

采用疏水色谱疏水柱HiTrap Phenyl FF(high sub),1ml,Amersham Biosciences AB分离f3-5。选用含2N(NH4)2SO4的50mMTris-HCl Buffer及双蒸水作梯度洗脱,即3ml含2N(NH4)2O4的50mMTris-HCl Buffer洗脱、1.5ml含2N 2N(NH4)2SO4的50mMTris-HCl Buffer和1.5ml双蒸水的混合溶液洗脱、12ml双蒸水洗脱。洗脱剂的流速为1.0ml/min。其中,f3-5-1的相对保留时间为3.0min,对应的紫外峰吸收为670mAU;f3-5-2的相对保留时间为6.0min,对应的紫外峰吸收为550mAU;f3-5-3的相对保留时间为8.5min,对应的紫外峰吸收为490mAU;对应于高盐的洗脱峰的馏份为f3-5-1,对应于水洗脱峰的馏份为f3-5-2和f3-5-3。其中f3-5-2的收率为5.5%。

实施例7 f3-5-1、f3-5-2和f3-5-3的优球蛋白平板实验

1)取9份全血与1份枸橼酸钠溶液(3.8%)混合,立即3000r/min离心10min,分离出贫血小板血浆。

2)50ml离心管中每管先加2ml猪血浆,接着加36ml超纯水,再加0.4ml1%HAC。

3)充分混合。

4)离心管放入4℃冰箱冷冻10min。

5)看到优球蛋白沉淀后以3000r/min离心5min。

6)离心管倒置,使液体流干,最后用滤纸吸干管内壁,勿使液体残留。

7)每离心管加2ml硼砂(ph=9)缓冲液,用玻璃棒搅匀使溶解得血浆溶液。合并各管血浆溶液。

8)将f3-5-1和f3-5-2用双蒸水溶解,配置终浓度为0.8mg/ml的f3-5-1和f3-5-2溶液。

9)将优球蛋白的硼砂溶液倒至于平皿中,加入凝血酶,使其凝固,在平皿中形成一层薄的优球蛋白凝固平板。

10)将10μl f3-5-1或f3-5-2溶液滴加入到优球蛋白平板上,每两点之间的间隔大于或等于1.5cm。

11)24小时后观察平皿(以生理盐水作为对照),记录优球蛋白平板上形成的溶解圈的直径。在f3-5-1、f3-5-2和f3-5-3中,f3-5-2显示出明确的优球蛋白溶解活性。图3是f3-5-2溶解圈的扫描。

实施例7 f3-5-2的构成

f3-5-2的构成由图4电泳定义(SDS-PAGE,12.5%Polyacrylamide gel;AmershamPharmacia Biotech AB生产的Hoefer mini VE电泳仪;Marker为AmershamPharmacia Biotech AB生产的Low molecular weight calibration kit,从小到大分子质量为14400、20100、30000、45000、66000和97000)。从图4可以看出,f3-5-2为单一条带。RP-HPLC(C-18HPLC,流动相为三氟醋酸/乙腈/水)分析表明f3-5-2的纯度高于95%。

实施例8 f3-5-2的分子量

MALDI-TOF质谱仪测得f3-5-2的分子量为28.7Kda(图5)。

实施例9 f3-5-2的N末端序列测定

按照常规方法,用Applied Biosystems Procise-Procise 491/auto-PE491 Proteinsequencer序列仪测得f3-5-2有两个N端。这两个N端的序列分别为DCPSGWS-SYEGHCYK和DCPSDWSSYEGHCYK。测得的两个N端说明,f3-5-2是双链蛋白。

实施例10 确定f3-5-2的全部序列

在数据库Swiss-Port上搜索,发现这两个末端序列和1995年Hideko Atoda发现的双链IX-bp蛋白的N末端序列相同。IX-bp蛋白由A链和B链两根链构成,A链含129个氨基酸残基,B链含123个氨基酸残基。

A链的全序列为DCPSGWSSYEGHCYKPFKLYKTWDDAERFCTEQAKGGHL-

VSIESAGEADFVAQLVTENIQNTKSYVWIGLRVQGKEKQCSSEWSDGSSVS-

YENWIEAESKTCLGLEKETGFRKWVNIYCGQQNPFVCEA(SEQ ID NO:1)。

B链的全序列为DCPSDWSSYEGHCYKPFSEPKNWADAENFCTQQHAGGHL-

VSFQSSEEADFVVKLAFQTFGHSIFWMGLSNVWNQCNWQWSNAAMLRYK-

AWAEESYCVYFKSTNNKWRSRACRMMAQFVCEFQA(SEQ ID NO:2)。

按照同源性规则,A链和B链两根链也是f3-5-2的两根链,其中A链含129个氨基酸残基,B链含123个氨基酸残基。

实施例11 f3-5-2含有的金属测定

为了确定f3-5-2的两根链的连接方式,参与无机质谱测定了f3-5-2可能含有的金属。结果发现f3-5-2含Zn2+。Zn2+与f3-5-2两根链的摩尔比为1∶1∶1。该结果表明,f3-5-2通过Zn2+将实施例10提到的A链和B链两根链连接成为完整的蛋白。

实施例12.f3-5-2的体内溶血栓活性测定

血栓的制备

往垂直固定的玻璃管(长15mm内径2.5mm外径5.0mm,管底用胶帽密封)中注满大鼠动脉新鲜血液,往管内插入一支针灸针质料的血栓固定螺栓。该血栓固定螺旋用直径为0.2mm的针灸针在4号针头上绕成,螺旋部分长12mm,含15个螺圈,直径1.0mm,托柄与螺旋相连,长7.0mm,成问号状。血液凝固15分钟后,小心取出玻璃管底部的胶帽,用镊子小心将血栓与玻璃管口处粘粘部位轻轻分开,然后用镊子固定血栓固定螺旋的托柄,从玻璃管中小心的去除被血栓包裹的血栓固定螺旋。精确称重。

旁路管道的制备

旁路管道由三段构成,中段为聚乙烯胶管,长60mm,内径3.5mm,两端为相同质料的聚乙烯管,管长100mm内径1.0mm外径2.0mm。该管的一端拉成尖管,外径1.0mm,另一端的外部套一段长7.0mm,外径3.5mm,三段管的内壁均用2%的硅油乙醚溶液硅烷化。将血栓包裹的血栓固定螺旋放入中段聚乙烯胶管内,胶管的两端分别于两根聚乙烯的加粗端相套。用注射器通过尖管端将管中注满肝素生理盐水溶液(50IU/kg,30mg/90ml)。

实验操作方法

Wistar大鼠(雄性,180-320g)按80mg/kg计量腹腔注射戊巴比妥钠溶液进行麻醉。麻醉大鼠仰卧位固定后进行手术:分离气管,分离右颈总动脉,在右颈总动脉的近心端用动脉夹夹住血管,在尽可能远心端小心地剪一斜口,插入一根一端拉成尖管的聚乙烯管(内径1.0mm,外径2.0mm),从管中放出约1ml动脉血后,重新用动脉夹夹住动脉,立即按上述方法制备血栓。在制备血栓的同时,分离左颈总动脉。待血栓做好并按上述方法做好旁路管道后,在暴露的左颈总动脉近心端上小心地剪一斜口,将上面制备好的旁路管道的尖管由斜口插入左颈总动脉开口的近心端,用4号手术缝线与静脉固定,旁路管道中段内血栓固定螺旋的托柄指向静脉端。用注射器通过旁路管道另一端的尖管推入准确量的肝素生理盐水溶液(50IU/kg)后,用动脉夹在近心端夹住静脉,从聚乙烯管的尖部取下注射器,从动脉取下放血管,将聚乙烯管的尖部插入动脉斜口的近心端,用4号手术缝线与动脉固定,打开动脉夹,使血流通过旁路管道从动脉流向静脉,此即大鼠颈动脉旁路溶栓模型。

生理盐水(3ml/Kg)为空白对照、尿激酶(剂量为20000IU/Kg)为阳性对照。f3-5-2(剂量为3.4×10-8mol/Kg)为治疗药物。生理盐水、尿激酶和f3-5-2的给药量均为3ml/Kg。记录每只大鼠旁路管道中血栓固定螺旋给药前后的重量差,统计各组的血栓重量减小值(平均值±SDmg)。结果列入表6。f3-5-2显示明确的溶血栓活性。

表6.组分f3-5-2引起的血栓重量减小值

  样品  生理盐水  尿激酶  f3-5-2  平均值±SD(mg)  0.9±6.12  14.84±5.68a  17.03±3.44a

n=11,a)与生理盐水组比,P<0.001

序列表

<110>首都医科大学

<120>江浙腹蛇蛇毒双链肽、其制备方法及应用

<130>008

<160>2

<170>Patent In version 3.3

<210>1

<211>129

<212>PRT

<213>Agkistrodon halys pallas

<400>1

Asp Cys Pro Ser Gly Trp Ser Ser Tyr Glu Gly His Cys Tyr Lys Pro

15                                  10                   15

Phe Lys Leu Tyr Lys Thr Trp Asp Asp Ala Glu Arg Phe Cys Thr Glu

            20                  25                  30

Gln Ala Lys Gly Gly His Leu Val Ser Ile Glu Ser Ala Gly Glu Ala

        35                  40                  45

Asp Phe Val Ala Gln Leu Val Thr Glu Asn Ile Gln Asn Thr Lys Ser

    50                  55                  60

Tyr Val Trp Ile Gly Leu Arg Val Gln Gly Lys Glu Lys Gln Cys Ser

65                  70                  75                  80

Ser Glu Trp Ser Asp Gly Ser Ser Val Ser Tyr Glu Asn Trp Ile Glu

                85                  90                  95

Ala Glu Ser Lys Thr Cys Leu Gly Leu Glu Lys Glu Thr Gly Phe Arg

            100                 105                 110

Lys Trp Val Asn Ile Tyr Cys Gly Gln Gln Asn Pro Phe Val Cys Glu

        115                 120                 125

Ala

<210>2

<211>123

<212>PRT

<213>Agkistrodon halys pallas

<400>2

Asp Cys Pro Ser Asp Trp Ser Ser Tyr Glu Gly His Cys Tyr Lys Pro

1               5                   10                  15

Phe Ser Glu Pro Lys Asn Trp Ala Asp Ala Glu Asn Phe Cys Thr Glu

            20                  25                   30

Glu His Ala Gly Gly His Leu Val Ser Phe Gln Ser Ser Glu Glu Ala

        35                  40                  45

Asp Phe Val Val Lys Leu Ala Phe Gln Thr Phe Gly His Ser Ile Phe

    50                  55                  60

Trp Met Gly Leu Ser Asn Val Trp Asn Gln Cys Asn Trp Gln Trp Ser

65                  70                  75                  80

Asn Ala Ala Met Leu Arg Tyr Lys Ala Trp Ala Glu Glu Ser Tyr Cys

                85                  90                  95

Val Tyr Phe Lys Ser Thr Asn Asn Lys Trp Arg Ser Arg Ala Cys Arg

            100                 105                 110

Met Met Ala Gln Phe Val Cys Glu Phe Gln Ala

        115                 120

去获取专利,查看全文>

相似文献

  • 专利
  • 中文文献
  • 外文文献
获取专利

客服邮箱:kefu@zhangqiaokeyan.com

京公网安备:11010802029741号 ICP备案号:京ICP备15016152号-6 六维联合信息科技 (北京) 有限公司©版权所有
  • 客服微信

  • 服务号