姜黄素在制备肿瘤多药耐药预防剂中的用途

摘要

本发明提供姜黄素在制备肿瘤多药耐药预防剂中的用途，姜黄素英文名为curcumin，CAS number：458－37－7，分子量：368.37，化学命名：1，7－bis－(4－hydroxy－3－methoxyphenyl)－1，6－heptadiene－3，5－dione，分子式为C21H20O6。本发明制备的姜黄素药物包括制剂允许的药物赋形剂或载体。本发明的重要之处是发现了天然化合物单体－姜黄素具有预防化疗药物诱导引起的肿瘤细胞多药耐药产生的作用；同时姜黄素毒性低，对于人体正常细胞安全、低毒，因此姜黄素具有制备化疗中肿瘤多药耐药预防剂的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属天然植物单体化合物的用途，涉及从植物中提取的姜黄素的新用途，尤其涉及姜黄素在制备肿瘤多药耐药预防剂中的用途。

背景技术

多药耐药(Multidrug Resistance，MDR)是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物出现耐药的同时，对其他结构和作用机理不同的抗肿瘤药物产生交叉耐药性，是导致化疗失败的主要原因。P-糖蛋白(P-gp)是介导肿瘤多药耐药最重要的一种耐药蛋白，是引起化疗中MDR的主要原因。

目前对于抗肿瘤多药耐药的研究，大多数都是基于MDR的发生机制及形成MDR之后，用特定的逆转剂进行逆转，但是由于许多肿瘤细胞形成耐药后，耐药蛋白表达丰度很高，耐药性很强，加之MDR形成后，伴随产生了细胞信号传导通路上许多其他靶点的变化，因此往往逆转困难或逆转效果不佳。如能在肿瘤细胞发生耐药之前就使用药物预防其发生、发展，成为克服MDR新的思路。有研究报道环孢霉素A可预防蒽环类化疗药引起的人白血病细胞mdr1 mRNA与P-gp水平的升高，这是目前国内外关于运用化合物预防MDR的少数报道之一，但由于环孢霉素A的免疫毒性等使其临床实际运用受到了很大限制，因此，寻找高效低毒的MDR预防剂尤显重要。我国的中医药资源是宝贵的文化遗产，其中药库为筛选MDR预防剂提供了丰富的物质基础，由于中药具有的独特优势，从中药中筛选高效、低毒的单体化合物用于MDR的预防已成为当前肿瘤化疗研究的热点，其成果对肿瘤化疗的成败关系重大。

肿瘤治疗强调“三级预防”，抗肿瘤耐药同样需要“预防”，本发明采取“预防为先”的思路，针对肿瘤MDR形成的机制与特定靶点，在肿瘤MDR形成之前即进行干预和预防。

姜黄素(Curcumin，Cur)是从姜科姜黄属(Curcuma L.)植物姜黄、莪术、郁金等的根茎中提取的一种天然有效成分，其化学结构如下：

姜黄素属于天然酚类抗氧化剂，是常用的调料及食用色素，其主要药理作用有抗炎、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、抗脂质过氧化、抗病毒等。

目前已有研究报道，姜黄素可在人耐药肿瘤细胞中逆转P-gp介导的肿瘤MDR，但尚无文献报道其可以在人敏感肿瘤细胞中预防化疗药物诱导引起的耐药性产生。我们通过研究发现姜黄素能抑制化疗药物诱导引起的敏感肿瘤细胞耐药性产生，提高细胞内化疗药物浓度，从而提高化疗疗效，其作用与环孢霉素A接近，但更低毒、安全。

发明内容

本发明的目的是提供姜黄素在制备肿瘤多药耐药预防剂中的用途，姜黄素英文名为curcumin，CAS number：458-37-7，分子量：368.37，化学命名：1，7-bis-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1，6-heptadiene-3，5-dione，分子式为C₂₁H₂₀O₆，对人体毒性小。

本发明提供姜黄素在制备敏感肿瘤细胞多药耐药预防剂中的用途。由于可诱导引起P-gp表达水平升高的化疗药物种类很多，包括蒽环类、植物碱类、拓扑异构酶抑制剂等(具体药物种类参见权利要求书中所列)，因此姜黄素可预防多种化疗药物诱导引起的肿瘤多药耐药。同时化疗药物引起的肿瘤多药耐药常由多种耐药蛋白引起，包括P-gp，BCRP，MRP，LRP。这些耐药机制往往同时存在，但以一种为主。

化疗药物包括：抗肿瘤抗生素类药，包括柔红霉素，去甲氧柔红霉素，阿霉素，表阿霉素，平阳霉素，博来霉素，吡喃阿霉素，放线菌素D，阿克拉霉素，丝裂霉素；抗肿瘤植物类药，包括足叶乙甙，替尼泊甙，高三尖酯碱，羟基喜树碱，拓泊替康，紫衫醇，多烯紫衫醇，长春新碱，长春花碱，长春地辛，长春瑞宾，香菇多糖；抗肿瘤激素类药，包括三苯氧胺，福美司坦，依西美坦，阿那曲唑，来曲唑，托瑞米芬，氟他胺，比卡鲁胺；抗代谢类药，包括5-氟尿嘧啶，阿糖胞苷，替加氟，氟铁龙，氟尿苷，巯嘌呤，甲氨喋呤，吉西他滨，卡培他滨；烷化剂，包括环磷酰胺，异环磷酰胺，白消安，美法仑，苯丁酸氮芥，司莫司汀，雌莫司汀，美司钠；铂类，包括顺铂，卡铂，奥沙利铂；其他种类瘤药，包括氮烯咪胺，门冬酰胺酶，氯甲双膦酸二钠，帕米膦酸二钠，依替膦酸二钠，伊班膦酸盐，贺赛汀，易瑞莎，米托蒽醌，羟基脲，甲基斑蝥胺，去甲斑蝥素，华蟾素，乌苯美司，三氧化二砷，艾迪，氨磷汀，苦参碱，伊马替尼，甘氨双唑钠，卫康醇，丙卡巴肼。

本发明所述的姜黄素与制剂允许的药物赋形剂或载体组合制备预防剂，其制剂形式主要包括液体制剂、颗粒剂、片剂、冲剂、胶丸、胶囊、缓释剂、滴丸剂、口崩制剂或注射剂。

本发明的有益效果有：(1)提出了姜黄素的新用途；(2)姜黄素能抑制化疗药物诱导引起的敏感肿瘤细胞耐药性产生，提高细胞内化疗药物浓度，从而提高化疗疗效；(3)姜黄素对人体正常细胞安全、低毒，是一种潜在的高效低毒的肿瘤多药耐药预防剂。

附图说明

图1为经过姜黄素预处理后，对于预防阿霉素诱导K562细胞mdr1 mRNA表达升高的作用。

图2为经过姜黄素预处理后，对于预防阿霉素诱导K562细胞P-gp表达升高的作用。

图3为经过不同浓度姜黄素预处理后，对于K562细胞内阿霉素积聚水平的作用。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步的说明。

实施例1：姜黄素预防阿霉素诱导引起的人K562敏感细胞mdr1 mRNA表达升高的作用

1.实验材料：

细胞系：本实验中所用人红白血病细胞系K562来源于美国American TypeCulture Collection(ATCC)公司；RPMI-1640培养液及小牛血清购自美国GIBCO公司；姜黄素标准品购自中国药品与生物制品鉴定所；注射用盐酸阿霉素购自浙江海正药业股份有限公司；Trizol试剂购自美国Life Technologies公司；RT-PCR试剂盒购自美国Promega公司；mdr1上下游引物及荧光标记探针购自上海生物工程公司。

仪器：5％CO₂恒温细胞培养箱(Heraeus公司，German)；细胞培养超净工作台(上海力申科学仪器有限公司)；Real-time荧光定量PCR仪(ABI Prism7700，USA)；低温超速离心机(Heraeus公司，德国)。

2.实验方法：

2.1细胞处理

K562细胞以0.5×10⁵个细胞每孔的密度接种于24孔板。实验组细胞加入姜黄素预处理24hrs，预处理后加入浓度为40ng/ml的阿霉素继续培养48hrs；单用阿霉素处理组细胞仅加入40ng/ml的阿霉素培养48hrs；空白对照组为仅加入新鲜培养液的细胞孔；阳性对照为经CsA预处理后再加入阿霉素的细胞孔。

2.2细胞收集

细胞处理结束后，4℃离心收集细胞，冰PBS洗2次以充分除去药物残留。

2.3细胞总RNA的提取及逆转录方法

参照Reagent试剂操作说明书及RT-PCR试剂盒操作说明书进行。

2.4Real-time荧光定量PCR检测mdr1表达水平

mdr1上游引物：5′AGAAAGCGAAGCAGTGGTTCA 3′

mdr1下游引物：5′CGAACTGTAGACAAACGATGAGCTA 3′

mdr1探针：5′FAM-TGGTCCGACCTTTTCTGGCCTTATCCA-TAMRA 3′

PCR反应体系配制：

cDNA                  5μl

mdr1上游引物(10μM)   1μl

mdr1下游引物(10μM)   1μl

mdr1探针(1μM)        3μl

2.5mM dNTPs           4μl

10×PCR buffer        5μl

25mM MgCl₂            4μl

Taq DNA polymerase    1μl(5U)

ddH₂O                 26μl

                                          

Total volume          50μl

Real-time PCR扩增条件：50℃ 2min

                       95℃ 10min

                       95℃ 15s×40 cycles

                       60℃ 60s×40 cycles

Real-time PCR扩增在ABI Prism 7700型PCR仪上进行。每个样本扩增时的荧光信号由PCR仪上的Squence Detector软件收集并记录，扩增结束后根据设定的阈值(Threshold)给出每条荧光扩增曲线的C_T值。每个样本均扩增3次。

2.5Real-time荧光定量PCR检测内参照基因GAPDH表达水平

PCR反应体系配制：

cDNA                     5μl

20×GAPDH master mix^*    2.5μl

2.5mM dNTPs              4μl

10×PCR buffer           5μl

25mM MgCl₂               4μl

Taq DNA polymerase       1μl(5U)

ddH₂O                    28.5μl

                                               

Total volume             50μl

^*：20×GAPDH master mix购自ABI Prism公司。

Real-time PCR扩增条件：50℃ 2min

                       95℃ 10min

                       95℃ 15s×40 cycles

                       60℃ 60s×40 cycles

Real-time PCR扩增在ABI Prism 7700型PCR仪上进行。每个样本扩增时的荧光信号由PCR仪上的Squence Detector软件收集并记录，扩增结束后根据设定的阈值(Threshold)给出每条荧光扩增曲线的C_T值。每个样本均扩增3次。

2.6计算mdr1 mRNA相对表达量

待测样本mdr1 mRNA相对表达量的计算采用以下公式：

ΔC_T＝(待测样本mdr1 mRNA C_T值)-(该样本GAPDHmRNA C_T值)

待测样本mdr1 mRNA相对表达量＝2^-ΔCT

3.实验结果：

我们采用Real-time荧光定量PCR的方法检测细胞mdr1 mRNA的表达水平，结果参见图1，图中：K562为空白对照；ADM为阿霉素；Cur为姜黄素；CsA为环孢菌素A。对于人K562敏感细胞加用姜黄素(Cur)预处理后，经阿霉素(ADM)诱导几乎不产生mdr1 mRNA水平的升高，mdr1 mRNA水平与未加入任何药物处理的空白对照孔K562相近。通过与阳性对照环孢菌素A(CsA)处理孔比较，2μg/ml(约5μM)姜黄素抑制mdr1 mRNA水平升高的作用与等摩尔质量的5μM CsA相当。

实施例2：姜黄素预防阿霉素诱导的人K562敏感细胞P-gp表达升高的作用

1.实验材料：

细胞系：本实验中所用人红白血病细胞系K562来源于美国American TypeCulture Collection(ATCC)公司；RPMI-1640培养液及小牛血清购自美国GIBCO公司；姜黄素标准品购自中国药品与生物制品鉴定所；注射用盐酸阿霉素购自浙江海正药业股份有限公司；R-PE标记P-gp单克隆抗体(R-PE-17F9)购自美国BD公司。

仪器：5％CO₂恒温细胞培养箱(Heraeus公司，German)；细胞培养超净工作台(上海力申科学仪器有限公司)；流式细胞仪(Becton Dickson FACScan，，USA)；低温超速离心机(Heraeus公司，德国)。

2.实验方法：

2.1细胞处理

K562细胞以1.5×10⁵个细胞每孔的密度接种于6孔板。实验组细胞加入姜黄素预处理24hrs，预处理后加入浓度为40ng/ml的阿霉素继续培养48hrs；单用阿霉素处理组细胞仅加入40ng/ml的阿霉素培养48hrs；空白对照组为仅加入新鲜培养液的细胞孔。

2.2细胞收集

细胞处理结束后，4℃离心收集细胞，冰PBS洗2次以充分除去药物残留。

2.3抗体孵育

将细胞混悬于500μl冰PBS中，往细胞悬液中加入R-PE标记的鼠抗人P-gp单克隆抗体(1∶500稀释)，4℃避光孵育30min，用含1％小牛血清的PBS洗3次，4℃避光反应20min，PBS洗2次，最后用PBS制成细胞悬液。

2.4流式细胞仪检测P-gp表达

取制成的细胞悬液上流式细胞仪检测。激发波长488nm，发射波长530nm，计数P-gp阳性细胞表面的相对荧光强度，每组计数10000个细胞。

3.实验结果

我们采用流式细胞术检测K562细胞P-gp表达水平的变化。结果参见图2，图中：K562为空白对照；ADM为阿霉素；Cur为姜黄素；^*：P＜0.05，与单用阿霉素诱导组相比。经姜黄素预处理后，可明显抑制阿霉素诱导引起的K562细胞P-gp表达水平上调，与无预处理的单用阿霉素诱导组细胞相比，差异有显著性(P＜0.05)。

实施例3：姜黄素可增加K562细胞内阿霉素积聚水平

1.实验材料：

细胞系：本实验中所用人红白血病细胞系K562来源于美国American TypeCulture Collection(ATCC)公司；RPMI-1640培养液及小牛血清购自美国GIBCO公司；姜黄素标准品购自中国药品与生物制品鉴定所；注射用盐酸阿霉素购自浙江海正药业股份有限公司。

仪器：5％CO₂恒温细胞培养箱(Heraeus公司，German)；细胞培养超净工作台(上海力申科学仪器有限公司)；流式细胞仪(Becton Dickson FACScan，，USA)；低温超速离心机(Heraeus公司，德国)。

2.实验方法：

2.1细胞处理

K562细胞以1.5×10⁵个细胞每孔的密度接种于6孔板。然后分别加入0.5μg/ml与2μg/ml姜黄素预处理细胞24hrs，预处理后加入浓度为40ng/ml的阿霉素继续培养48hrs；无预处理组待细胞接种后仅加入新鲜培养液培养24hrs，随后加入浓度为40ng/ml的阿霉素继续培养48hrs；空白对照为仅加入新鲜培养液的细胞孔。

2.2细胞收集

细胞处理结束后，4℃离心收集细胞，冰PBS洗2次以充分除去药物残留。

2.3流式细胞仪检测细胞内阿霉素积聚水平

取制成的细胞悬液上流式细胞仪(Becton Dickson FACScan，，USA)检测。激发波长488nm，发射波长530nm，计数细胞内阿霉素发出的荧光强度，每组计数10000个细胞。

3.实验结果

化疗药物阿霉素作为耐药蛋白P-gp的特异性底物，可受P-gp药泵的转运，因而细胞内阿霉素积聚的水平可反映出当时细胞P-gp的表达水平或功能状态。阿霉素于细胞内积聚时发出的荧光可通过流式细胞仪检测。检测结果参见图3，图中K562为空白对照；ADM为阿霉素；Cur为姜黄素；^*：P＜0.05，与单用阿霉素诱导组相比。运用姜黄素进行预处理后加阿霉素诱导，与单用阿霉素进行诱导的无预处理组相比，能显著提高人K562细胞内阿霉素积聚的水平。且随着姜黄素预处理浓度的加大，这一作用更为明显：2μg/ml的姜黄素进行预处理后加阿霉素诱导，K562细胞内阿霉素积聚的水平可基本恢复至空白对照组K562细胞水平。