公开/公告号CN1852742A
专利类型发明专利
公开/公告日2006-10-25
原文格式PDF
申请/专利权人 加利福尼亚大学董事会;
申请/专利号CN200480026944.0
申请日2004-08-20
分类号A61K51/00(20060101);
代理机构中国国际贸易促进委员会专利商标事务所;
代理人程泳
地址 美国加利福尼亚
入库时间 2023-12-17 17:51:11
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2009-04-08
授权
授权
2006-12-20
实质审查的生效
实质审查的生效
2006-10-25
公开
公开
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119，本公开书要求2003年8月20日提交的临时申请流水号60/496,942的优先权，该申请在此引用作为参考。
关于联邦资助研究的声明
本发明得到了(美国)国家卫生研究所(NIH)授予的基金号DK15410的部分资助。政府可以对本发明具有某些权利。
技术领域
本发明涉及促生长素抑制素类似物，更具体的说就是与某些促生长素抑制素受体亚型发生特异性相互作用的促生长素抑制素类似物。
背景
促生长素抑制素(SS)既是担当激素、神经递质、和神经调质的内源肽，又是邻近细胞的旁分泌调节物。它存在两种形式，SS-14和SS-28，分别是十四肽和二十八肽，它们源自蛋白质前促生长素抑制素原(preprosomatostatin)，而且在神经内分泌及中枢和周围神经系统的组织中差异分布。促生长素抑制素受体存在五种亚型，都是具有高度序列同源性的G蛋白偶联受体。
不顾奥曲肽(octreotide)、兰瑞肽(lanreotide)、和伐普肽(vapreotide)的商业效用，大量的促生长素抑制素类似物已被建议作为成像剂和/或治疗剂用于检测和/或治疗癌症和其它促生长素抑制素响应性疾病状态。希望得到对促生长素抑制素受体(SST)和SST亚型特别是SST2和SST5具有较高亲和力的类似物，使得施用较低剂量的促生长素抑制素类似物就可以获得临床反应。
概述
本发明提供了环状肽模拟物促生长素抑制素类似物，它设计用于满足对有效的且有选择性的SST2和SST5配体的需要。官能化芳香族氨基酸的存在为额外官能化和更广应用打开了通向新“把手”的道路。
本发明的类似物是有益的抗肿瘤试剂。它们可以用于治疗肢端肥大症和糖尿病，以及在放射性标记后用于闪烁显像目的。另外，可以将类似物进行放射性标记和/或连接能够引起细胞死亡(如肿瘤细胞死亡)的胞毒剂(cytotoxic agent)。
本发明的组合物(即SS类似物)是设计用于在体外和在体内与细胞上的某些SST亚型(如SST2和SST5)发生相互作用的有用配体。
本发明提供了促生长素抑制素(SS)类似物，其中所述类似物选自SEQ ID NO：1-10之任一。在本发明的一个方面，可以将SS类似物连接放射性元素。
本发明还提供了在受试者中显现恶性细胞的方法，包括对受试者施用本发明的SS类似物。
本发明还提供了在受试者中治疗多种增殖性疾病的方法，包括对受试者施用本发明的SS类似物。在本发明的一个方面，增殖性疾病包括肿瘤、肢端肥大症、和/或糖尿病。
本发明还提供了设计用于与SS受体2(SST2)和/或SST5而非其它SS受体发生选择性结合的促生长素抑制素(SS)类似物，其中所述SS类似物具有选自下组的结构：
4-氨基-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Asp-NH2(SEQ IDNO：1)；
4-氨基-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2(SEQ IDNO：2)；
4-氨基-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-D-Asp-NH2(SEQID NO：3)；
4-氨基-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-D-Thr-NH2(SEQID NO：4)；
4-氨基-D-Phe-c[Cys-(3-碘代)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2(SEQ ID NO：5)；
4-氨基-3-碘代-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2(SEQ ID NO：6)；
4-氨基-3-碘代-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Asp-NH2(SEQ ID NO：7)；
4-氨基-3-碘代-D-Phe-c[Cys-(3-碘代)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2(SEQ ID NO：8)；
4-氨基-3-碘代-D-Phe-c[Cys-(3-碘代)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Asp-NH2(SEQ ID NO：9)；和
D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Asp-NH2以及含有二或多碘化芳香族残基的化合物。
本发明还提供了包含本发明的SS类似物和至少一种制药学可接受载体的混合物的药物组合物。
下文说明书详细阐明了本发明的一个或多个实施方案。根据说明书和权利要求书，本发明的其它特色、目的、和优势将是显而易见的。
详述
促生长素抑制素抑制胰腺释放胰岛素和胰高血糖素，抑制垂体释放生长激素，并减少胃分泌。天然促生长素抑制素的血浆半衰期小于3分钟。它被肽酶快速降解。因而，目前正在寻找具有改进的生物利用度和受体特异性的促生长素抑制素类似物。促生长素抑制素及其类似物有可能牵涉多种疾病的治疗。SS类似物尤其是受体特异的肽模拟物配体和非肽配体的诊断性和治疗性用途的数目和种类发生激增。
人体中的多种组织表达促生长素抑制素受体，包括但不限于：(1)胃肠道、(2)周围神经系统、(3)内分泌系统、(4)血管系统、和(5)淋巴组织，在那里受体位于生发中心。在所有这些情况中，有生物活性的促生长素抑制素类似物的促生长素抑制素结合具有高度亲和力和特异性。配体与促生长素抑制素受体结合后，激动剂-受体复合物被细胞内化。这种特性在实践中是重要的，并且构成定位和治疗过度表达促生长素抑制素受体的肿瘤的基础。
促生长素抑制素受体还在病理学状态中表达，特别是胃肠道神经内分泌肿瘤。源自促生长素抑制素靶组织的大多数人类肿瘤保留了它们的促生长素抑制素受体。首先在生长激素生成性腺瘤和TSH生成性腺瘤中观察到这种现象；大约半数内分泌停止的腺瘤展示促生长素抑制素受体。90％的类癌和多数胰岛细胞癌，包括它们的转移，常常具有高密度的促生长素抑制素受体。然而，10％的结肠直肠癌和所有外分泌胰腺癌不含促生长素抑制素受体。可以使用体外结合法或者使用体内成像技术来鉴定肿瘤中的促生长素抑制素受体；后者容许对受试者体内的肿瘤及其转移做出精确定位。因为胃肠胰腺肿瘤中的促生长素抑制素受体是有功能的，所以它们的鉴定可用于评估类似物在受试者中抑制过量激素释放的治疗性功效。
环十四肽促生长素抑制素-14(SS-14)最初是由下丘脑分离的，并且鉴定为来自垂体前叶的生长激素释放的抑制物(参阅例如美国专利号3,904,594，收入本文作为参考)。这种十四肽在第3和14位的两个半胱氨酰氨基酸残基的巯基之间具有桥键或环键。SS-14调控胰腺的胰岛素、胰高血糖素、和淀粉酶分泌以及胃的胃酸释放。例如，SS-14抑制五肽促胃泌素和组胺对胃粘膜的作用。SS-14还在大脑的下丘脑内区域表达，并且在调控运动活力和认知功能中发挥作用。SS-14存在于整个中枢神经系统中，并且担当神经递质。在中枢神经系统中，SS-14已经显示以积极和消极两个方面调节神经元激动，影响其它神经递质的释放，并调控运动行为和认知过程。
SS-14影响多种细胞过程。研究显示SS-14是不同组织中腺苷酰环化酶的抑制性调节物。SS-14还调节离子通道的电导，包括钾和钙两种通道。SS-14的这些作用是由百日咳毒素敏感性鸟嘌呤核苷酸结合蛋白介导的。SS-14还通过百日咳毒素不敏感性机制调节酪氨酸磷酸酶的活性和细胞增殖。
SS-14通过与结构相似的膜结合受体家族的相互作用来诱发它的生物学作用。已经克隆了五种SS-14受体，称为SST 1-5。人SST1、小鼠SST2、和小鼠SST3描述于Raynor等，Molecular Pharmacology 43：838-844，1993。现在可以获取所有五种人SS受体用于研究目的。人SST1、2、和3还公开于美国专利号5,436,155。另外的SS-14受体公开于美国专利号5,668,006和5,929,209。所有五种受体以高亲和力结合SS-14和SS-28。已经鉴定了SST2和SST5的选择性激动剂，并且用于揭示这些受体的不同功能。认为这两种受体是周围组织中的优势亚型。认为SST2介导对生长激素、胰高血糖素、和胃酸分泌的抑制。相反，SST5似乎主要参与对胰岛素和淀粉酶释放的控制。SST3是在皮层组织、垂体、和腺瘤组织中发现的；认为它通过SS-14的结合而介导对胃平滑肌收缩的抑制。这些发现指示不同受体亚型介导SS-14在体内的不同功能。
促生长素抑制素以较高亲和力结合五种不同受体(SST)亚型的每一种亚型。激动剂与不同SST亚型的结合与如下病症和/或疾病的治疗有关。第2和5型的激活与生长激素抑制有关，更具体的说就是GH分泌性腺瘤(肢端肥大症)和TSH分泌性腺瘤。第2型而非第5型的激活与治疗催乳素分泌性腺瘤有关。与促生长素抑制素亚型激活有关的其它适应症有再狭窄、胰岛素和/或胰高血糖素抑制、更具体的说就是糖尿病、高脂血症、胰岛素不敏感、X综合征、血管病、增殖性视网膜病、黎明现象、和肾病；胃酸分泌抑制，更具体的说就是消化性溃疡、肠皮肤和胰腺皮肤瘘管(enterocutaneous and pancreaticocutanieousfistula)、肠应激综合征、倾倒综合征、水泻综合征、AIDS相关腹泻、化疗诱发的腹泻、急性或慢性胰腺炎、和胃肠激素分泌性肿瘤；癌症诸如肝癌的治疗；血管发生的抑制、炎性疾病诸如关节炎的治疗；慢性同种异体移植排斥；血管成形术；预防移植血管和胃肠出血。促生长素抑制素激动剂还可用于在患者中降低体重。
促生长素抑制素-28(SS-28)是由猪上部小肠分离的(L.Pradayrol等，FEBS Letters 109：55-58，1980)。SS-28是SS-14的N端延伸形式，添加了额外14个氨基酸残基，并且在体内施用时显示一些升高的效力。
称为SMS-201-995(奥曲肽)的环SS-14类似物，即D-Phe-c[Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Thr-ol，正在临床上用于抑制某些肿瘤生长。这种类似物显示改进了受治疗受试者的生活质量，而且存在控制肿瘤生长和降低死亡率的有力证据。还开发了两种类似的八肽类似物，即兰瑞肽(D-β-Nal-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2)和伐普肽(D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Trp-NH2)，参阅Smith-Jones等，Endocrinology 140：5136-5148，1999。已经开发了这些促生长素抑制素类似物，用于放射性成像或者在放射性核素疗法中用作放射性药物。为了放射性成像，可以如英国专利申请8927255.3中所公开的和Bakker等，J.Nucl.Med.32：1184-1189，1991中所述使用123I标记。通常，通过使用螯合剂来放射性标记蛋白质，而且存在用99Tc、99Y、或111In与促生长素抑制素类似物复合的多个实例，参阅美国专利号5,620,675和5,716,596。例如，奥曲肽闪烁显像法是以奥曲肽结合受体的显像为基础的。出于这些目的，使用奥曲肽的放射性标记形式，诸如[123I-Tyr3]-奥曲肽。这种以及开发的其它类似物(兰瑞肽(D-Nal-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2)；伐普肽c(D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Trp-NH2)；AN-238，即与胞毒剂相连的RC-121(D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2))是当前可用于抗癌战场的军火库的一部分。
还揭示了促生长素抑制素激动剂可用于抑制幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的繁殖。
奥曲肽和其它临床使用的SS-14类似物与三种受体亚型即SST2、SST3、和SST5发生重要的相互作用。已经报导了SST2和SST5介导SS-14对肿瘤细胞生长的抗增殖作用；因此，它们可能介导奥曲肽在人体中的临床效果。例如，化合物RC-121不如天然SS-14和善得定有效，但是展示对受体SST2和SST5的选择性结合的优势(见例如表1)。
表1：SS-14、善得定、和RC-121的结合亲和力
本发明提供了与SST2和/或SST5发生选择性相互作用的方法和组合物。认为对生长激素释放的抑制是通过配体与SST2受体的相互作用介导的，或者SST2和SST5二者都参与其中。还认为与SST5的相互作用负责胰岛素释放抑制活性。由此，对这两种受体或其中之一具有选择性的类似物将可用于治疗癌症和糖尿病等用途。
本发明提供了用酸性和碱性残基和/或肽模拟模块(buildingblock)修饰末端残基以改进效力、选择性、和生物利用度的SS类似物。
本发明的SS-14类似物是在亲本化合物RC-121(D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2)(SEQ ID NO：11)的基础上由于此亲本化合物的结合特性而开发的。亲本化合物具有针对SST2和SST5的选择性(见例如表1)，但是从效力、生物结构域的稳定性、以及对SST2和SST5的效力比率的立场看，它的特性还可以改进。
本发明的SS-14类似物提供了数项诱人的特色，包括：(1)类似物易于由商业性模块快速合成；(2)设计用于提高生物利用度的肽模拟修饰(例如对-氨基-D-苯丙氨酸，(2-氨基-3-(4-氨基苯基)-丙酸)和3-碘代-酪氨酸，(2-氨基-3-(4-羟基-3-碘代苯基)-丙酸))；(3)设计用于比奥曲肽更加有效的在体外抑制生长激素的有力的且有选择性的化合物(4-氨基-3-碘代)-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2，奥曲肽在本文中用作参考化合物；和(4)类似物部分基于碘代芳基衍生物，使得这些化合物的放射性标记易于使用放射性碘来实现。这些分子有可能在恶性细胞的成像和根除中具有应用。
本发明提供了包含二硫键连接的八肽且掺入非天然氨基酸模块的SS-14类似物。本发明提供了符合如下通式I的SS-14类似物：X-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Y-NH2，其中X选自D-Phe、(4-氨基)-D-Phe、和(4-氨基-3-碘代)-D-Phe，Y选自L-或D-Thr和L-或D-Asp，且位于第3位的Tyr可以单或多碘化。表2提供了符合通式I的例示性肽结构。
表2
用于定义肽的命名法如M Goodman、A Felix、L Moroder、和CToniolo编，Synthesis of Peptides and Peptidomimetics，2003中所述，其中与传统表述一致，氨基位于左边而羧基位于右边。当氨基酸残基具有同分异构形式时，用于鉴别α-氨基酸残基的标准3字母缩写指L型氨基酸，除非另有明确指示，例如Ser＝L-丝氨酸。D，L指特定α-氨基酸的D-和L-异构体的混合物。
在另一个方面，本发明提供了包含有效量的通式(I)化合物或其制药学可接受盐和制药学可接受载体的药物组合物。
在还有一个方面，本发明提供了在有所需要的受试者中引发促生长素抑制素受体激动剂效应的方法，包括对所述哺乳动物施用有效量的通式(I)化合物或其制药学可接受盐。
在另一个方面，本发明提供了在有所需要的受试者中治疗催乳素分泌性腺瘤、再狭窄、糖尿病、高脂血症、胰岛素不敏感、X综合征、血管病、增殖性视网膜病、黎明现象、肾病、胃酸分泌、消化性溃疡、肠皮肤和胰腺皮肤瘘管、肠应激综合征、倾倒综合征、水泻综合征、AIDS相关腹泻、化疗诱发的腹泻、急性或慢性胰腺炎、胃肠激素分泌性瘤、癌、肝癌、血管发生、炎性疾病、关节炎、慢性同种异体移植排斥、血管成形术、移植血管出血、或胃肠出血的方法，包括对受试者施用通式(I)化合物或其制药学可接受盐。
在另一个方面，本发明提供了在有所需要的受试者中抑制幽门螺杆菌繁殖的方法，包括对受试者施用通式(I)化合物或其制药学可接受盐。
治疗有效量的本发明肽和制药学可接受载体物质一起形成治疗性组合物(例如丸剂、片剂、胶囊、或液体)，用于对需要所述肽的受试者进行施用(例如通过口、静脉内、玻璃体内、经皮、肺、阴道、皮下、鼻、离子电渗、或气管内)。可以用能够在受试者的胃中保护组合物免于胃酸或肠酶作用达一段时间而足以容许组合物未经消化就进入受试者小肠的物质包被丸剂、片剂、或胶囊。治疗性组合物还可以采用用于皮下或肌肉内施用的生物可降解或非生物可降解缓释制剂的形式。还可以使用用于施用治疗性组合物的可植入或外部泵来获得连续施用。
本发明肽或治疗性组合物用于治疗上文所述疾病或紊乱的剂量随着施用方式、受试者的年龄和体重、以及待治疗受试者的状况而变化，而且最终将由主治医师或兽医来决定。由主治医师或兽医决定的肽或治疗性组合物的这种数量在本文中称为“治疗有效量”。
本发明的类似物肽与SST2和/或SST5的结合选择性可以通过测试它们与克隆的五种不同人SS-14受体的相互作用来证明。本文描述了关于类似物结合多种促生长素抑制素受体亚型的能力的体外测定法，而且在本领域是知道的(参阅例如美国专利号6,602,849和美国专利号6,001,801，将其公开书收入本文作为参考)。一般而言，如本领域所知道的，在合适缓冲液中清洗表达受体的重组细胞并匀浆，以制备粗制蛋白质匀浆。在一个代表性测定法中，将来自细胞匀浆的一定量蛋白质置于小体积的合适pH的合适测定缓冲液中。向混合液中添加合适浓度的候选物质，诸如本发明的类似物，并且监测候选物质(例如本发明的类似物)与受体多肽之间的相互作用。本发明的肽设计成以高亲和力充分结合某些SST亚型，诸如SST2和/或SST5。
可以在克隆的SS-14受体上进行受体结合测定法。可以使用这些测定法得到KD值，它指示占据选定数量的受体等的半数(50％)结合位点所必需的配体浓度，或者可以使用竞争性测定法得到IC50值，它指示在50％的结合位点取代所测量目标配体的饱和浓度所必需的竞争性配体的浓度。
尽管奥曲肽的一种类似物已经通过使用正电子放射X线断层摄影术用于检测具有SS-14高表达的人体肿瘤，现有的SS-14类似物不能区分SST2、SST3、和SST5。比较而言，本发明的放射性标记SS-14类似物可用于类似目的，而且认为它们在鉴定表达SST2和/或SST5的肿瘤中特别有用，这些肿瘤随后成为用胞毒剂和/或放射剂标记的本发明选择性类似物进行治疗的治疗靶。
本发明的SS-14类似物(例如SEQ ID NO：1-10)设计用于与SST2和/或SST5发生选择性相互作用，而且可用于抗击表达SST2和/或SST5的癌。它们还可用于闪烁显像法，以测定大脑中以及内分泌和外分泌系统中表达SST2和/或SST5受体的细胞和组织的分布，而且还可用于鉴定这种受体在体内的选择性功能。它们还可用于治疗与表达SST2和/或SST5的组织有关的非肿瘤性疾病。
本发明还包括本发明的肽类似物(例如SEQ ID NO：1-10)与胞毒药物诸如紫杉醇或任何其它胞毒部分的组合。胞毒药物可以通过共价键或物理封装与类似物相连。
一般而言，SS-14类似物(例如SEQ ID NO：1-10)是在固相肽合成仪上使用Fmoc化学合成的。意欲投递至靶细胞的期望化合物，诸如抗癌药物紫杉醇、多柔比星、或喜树碱等等，与间隔物(通常具有末端羧基)发生反应而形成共价键，得到药物-间隔物复合物。然后将这种复合物与树脂上的SS-14类似物肽的N末端偶联而形成终产物，即药物-间隔物-肽复合物。
可以以放射性标记或未标记形式使用本发明的化合物(例如包含SEQ ID NO：1-10的肽类似物)，用于任何促生长素抑制素响应性疾病状态的诊断或治疗。本发明的化合物对于肿瘤性紊乱和肿瘤诸如例如神经内分泌肿瘤、垂体腺瘤、嗜铬细胞瘤、副神经节瘤、甲状腺髓样癌、小细胞和非小细胞肺癌、星形细胞瘤、黑素瘤、脑脊膜瘤、乳房肿瘤、恶性淋巴瘤、肾细胞癌、前列腺肿瘤等等的诊断和/或治疗特别有用。本发明的SS-14类似物还可用于诊断或治疗其中出现血管发生并伴随SST上调的病症。这些病症包括例如动脉硬化症和侵入性流程诸如血管成形术后动脉中发生的细胞增殖。
放射性标记的本发明SS-14类似物可用于这些诊断和治疗。本发明类似物的放射性标记实施方案可用于放射性同位素指导的手术，如WO93/18797和Woltering等，Surgery 116：1139-1147，1994中所述。在一个实施方案中，将放射γ的放射性核素与本发明类似物的复合物用于诊断表达SST的肿瘤，随后将放射β的放射性核素诸如188Re或186Re与本发明类似物的复合物用于治疗肿瘤。其它治疗性放射性核素标记物包括胞毒性放射性同位素，诸如钪-47、铜-67、镓-72、钇-90、碘-125、碘-131、钐-153、钆-159、镝-165、钬-166、镱-175、镥-177、铼-186、铼-188、砹-211、和铋-212。
出于诊断性目的，施用诊断有效量的放射性标记的本发明类似物，通常通过静脉内施用。诊断有效量定义为使用常规方法学诸如磁共振、计算机化X线断层摄影术、伽马闪烁扫描法、SPECT、PET等等在体内实现标记物的定位和检测所必需的放射性标记类似物的数量。
在使用闪烁扫描成像进行诊断时，通常以一个单位的可注射剂量施用放射性标记的本发明类似物。可以在用于静脉内注射的任何常规介质诸如盐水介质或血浆介质中静脉内施用由本发明提供的经标记的类似物。一般而言，将施用的单位剂量含有约0.01mCi-约100mCi的放射性，通常是1mCi-50mCi。将以单位剂量注射的溶液是约0.01m1-10ml。静脉内施用后，可以在几分钟内取得体内成像。然而，如果需要，可以在将放射性标记化合物注射到受试者体内后数小时甚至更长时间进行成像。在大多数情况中，在约0.1小时内在待成像区域中将积累足够数量的施用剂量，从而容许获得闪烁照片。可以依照本发明利用用于诊断目的的闪烁扫描成像的任何常规方法。
在将放射性标记的本发明化合物用于治疗目的时，将它们用治疗有效量的胞毒性放射性同位素进行放射性标记，通常是188Re。依照本发明，治疗有效量的胞毒性放射性同位素指药物组合物或方法的每一种活性成分的总量足以显示对受试者有意义的益处，例如归咎于促生长素抑制素响应性疾病状态之症状的发生频率或严重程度与预期作为可比组的未接受本发明放射性治疗性试剂的受试者相比降低。在将活性成分单独应用于个体时，该术语单独指该成分。在联合应用时，该术语指活性成分产生治疗效果的联合量，无论是联合、连续、或同时施用。出于本发明的目的，放疗涵盖任何治疗性效果，包括由疼痛减轻至肿瘤消退或与所治疗的特定促生长素抑制素响应性疾病有关的症状消除。
在用于放疗时，将本发明SS-14类似物与胞毒性放射性同位素的复合物施用于需要治疗促生长素抑制素响应性疾病或紊乱的受试者，通常是哺乳动物，包括人。在本发明的放疗方法中，可以通过任何合适的临床路径施用数量为约5mCi-约200mCi的胞毒性放射性同位素，通常是静脉内注射或肿瘤内注射。本发明的放疗复合物可以任选联合化疗药物进行施用，诸如它莫西芬、顺铂、紫杉醇、抗血管发生化合物等等。
在将未标记化合物用于促生长素抑制素响应性疾病或紊乱的治疗时，SS-14类似物的施用通常是肠胃外，更常用的是静脉内。为了治疗促生长素抑制素响应性疾病或紊乱而施用的未标记SS-14类似物的数量将取决于所治疗病症的本质和严重程度以及受试者先前接受的治疗的本质。最终，主治医师将决定治疗每一位受试者个体的SS-14类似物的数量。首先，主治医师将施用低剂量的SS-14类似物，并观察受试者的反应。可以施用更大剂量的SS-14类似物，直至对受试者得到最佳治疗效果，此时不再增加剂量。预期在本发明治疗性方法中施用未标记SS-14类似物的剂量应当在约0.1μg-约100μg化合物/kg体重的范围内。更常见的是，在本发明的治疗性方法中施用未标记SS-14类似物的剂量在约0.1μg-约100μg SS-14类似物/kg体重的范围内。本发明的未标记SS-14类似物还可以任选联合化疗药物进行施用。
治疗的持续时间将根据所治疗疾病的严重程度以及每一位受试者个体的状况和特异反应而变化，无论是包含本发明SS-14类似物的放射性药物还是未标记的本发明SS-14类似物。预期每次施用本发明放射性药物的持续时间将在连续静脉内施用约1-约120分钟的范围内。预期每次施用未标记的本发明SS-14类似物的持续时间将在连续静脉内施用约1-约120分钟的范围内。最终，主治医师将决定使用经标记或未标记的本发明化合物进行静脉内治疗的合适持续时间，无论是单独施用还是联合其它药物。
依照本发明的一个方面，与制药学可接受载体一起提供包含一种或多种本发明SS-14类似物(例如SEQ ID NO：1-10)的制剂。该制剂在约10μg/kg体重-约60μg/kg体重的范围内提供了本发明SS-14类似物的活性剂量；通常是约10μg/kg体重-约20μg/kg体重。
表述“制药学可接受的”意图包括这样的成分，它既与本发明SS-14类似物相容，对接受制剂的受试者例如人而言又是生理学可接受的，不产生令人不快的生理学效果，诸如恶心、头晕、胃部不适等等。依照本发明使用的组合物可以包含一种或多种下文所列载体、赋形剂、和/或稀释剂。
依照本发明的一个方面，提供了在用于治疗、预防、或处理肿瘤细胞相关疾病的药物中包含一种或多种本发明SS-14类似物的配方。
依照本发明的一个方面，提供了用于治疗患有肿瘤细胞相关疾病的人或非人动物的方法，包括施用包含本发明SS-14类似物(例如包含SEQ ID NO：1-9和/或10的类似物)的制剂的步骤。肿瘤细胞相关制剂可以是例如结肠直肠癌、胃癌、前列腺癌、胰腺中的癌。
可以治疗的非人动物通常包括哺乳动物，特别是牲畜和家畜，诸如狗、猫、兔、豚鼠、仓鼠、小鼠、大鼠、马、山羊、绵羊、猪、和牛。
根据施用的模式，可以使用多种形式的组合物。由此，可以使用易于获得的成分以常规方式配制药物组合物。可以掺入包含肽类似物SEQ ID NO：1-10的活性成分，任选连同其它活性物质，以及一种或多种常规载体、稀释剂、和/或赋形剂，以生成常规制剂，诸如片剂、丸剂、粉剂、锭剂、小药囊、糯米纸包剂、酏剂、悬浮液、乳状液、溶液、糖浆剂、气雾剂(作为固体或在液体介质中)、油膏、软的和硬的明胶胶囊、栓剂、无菌注射液、无菌包装粉剂等等。
合适载体、赋形剂、和稀释剂的实例是乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、黄芪胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、water syrup、水、水/乙醇、水/二元醇、水/聚乙二醇、丙二醇、甲基纤维素、羟基安息香酸甲酯、羟基安息香酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油、或脂肪物质诸如硬脂或其合适混合物。组合物可以额外包含润滑剂、湿润剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂、甜味剂、芳香剂等等。通过采用本领域众所周知的流程，可以将本发明的组合物配制成在施用于患者后提供活性成分的快速、持续、或延迟释放。组合物可以是合适的剂量形式，例如乳剂或是在脂质体、niosome、微球体、纳米微粒等等中。
可以通过任何常规路径进行组合物在本发明用途中的施用，例如吸入、口服、直肠、或肠胃外，诸如肌肉内、皮下、关节内、颅内、皮内、眼内、腹膜内、鞘内、静脉内注射，尽管这取决于待治疗的病症。甚至可以直接对患病部位进行注射(例如通过立体定位注射)。还可以进行局部施用，例如在患病部位，例如通过使用导管或注射器。对于合适的病症而言，通过对皮肤局部应用组合物例如油膏来进行治疗也是可能的。任选的是，可以以一定间隔进行施用，例如2次或更多次应用，例如以小时、天、周、或月为间隔的2-4次应用，例如每天、或每3-5天、或以两周、月、或季为间隔的几次。
组合物中存在的本发明SS-14类似物以重量计占制剂的约0.01％-约99％，通常是约0.1-约50％，例如10％。组合物可以配制成单位剂量形式，例如每个剂量含有约0.01mg-约1g活性成分，例如对人而言是0.05mg-0.5g，例如1-100mg。待施用的活性化合物的精确剂量和疗程的长度当然将取决于许多因素，包括例如受试者的年龄和体重、需要治疗的具体病症及其严重程度、以及施用的路径。然而，一般而言，根据待治疗的受试者和剂量形式，作为单一剂量的有效剂量可能在约10μg/kg体重-约60μg/kg体重的本发明SS-14类似物的范围内，通常是约10μg/kg-约20μg/kg每天。由此，例如，对于成年人的合适每日剂量可能是每天0.5mg-2g，例如每天1.0-500mg本发明SS-14类似物。
可以使用任何多种本领域已知技术来生产本发明的肽。可以通过合适方法来合成肽，诸如完全固相技术，部分固相技术，通过片段缩合，或通过经典的溶液加成。例如，许多教科书中阐述了完全固态合成的技术，包括例如Solid-Phase Peptide Synthesis，Stewart和Young，Freeman &Co.，旧金山，1969。合成的片段缩合法例示于美国专利号3,972,859(1976年8月3日)。其它可用的合成方法例示于美国专利号3,842,067(1974年10月15日)和美国专利号3,862,925(1975年1月28日)。
偶联型合成中共同的是用合适的保护基团保护多种氨基酸部分中不稳定的侧链基团，这将预防该位点发生化学反应直至最终除去所述基团。通常，共同的还有在将氨基酸或片段的羧基基团进行反应时保护该实体的α-氨基基团，随后选择性除去α-氨基保护基团以容许该位置进行后续反应。因此，共同的是，作为合成的一个步骤，生成了中间化合物，其肽链中每一氨基酸按其所需的顺序排列，并且这些残基中的多个与副反应保护基团相连。
典型的保护基团、偶联剂、试剂、和溶剂，诸如但不限于下文所列，在用于本文和权利要求书时具有如下缩写。本领域技术人员理解每一组中所列化合物可以互换使用。另外，本领域技术人员知道其它可能的保护基团、偶联剂、和试剂/溶剂；这些也意欲包括在本发明的范围之内。
缩写名称 保护基团
Ada 金刚烷乙酰基
Alloc 烯丙基氧羰基
Allyl 烯丙酯
Boc 叔丁基氧羰基
Bzl 苄基
Fmoc 芴甲氧羰基
OBzl 苄酯
OEt 乙酯
OMe 甲酯
Tos(Tosyl) 对甲苯磺酰
Trt 三苯甲基
Z 苄基氧羰基
缩写名称 偶联剂
BOP 苯并三唑-1-基-氧三-
(二甲基-氨基)
六氟磷酸盐
DIC 二异丙基碳二亚胺
HBTU 2-(1H-苯并三唑-1基)-
1，1，3，3-四甲基脲阳离子
(tetramethyluronium)
六氟磷酸盐
PyBrOP 溴三吡咯烷六氟磷酸盐
PyBOP 苯并三唑-1-基-氧-三-
吡咯烷六氟磷酸盐
TBTU O-(1，2-二氢-2-氧-1-吡啶基)-
N，N，N′，N′-四甲基脲阳离子
四氟硼酸盐
缩写名称 试剂和溶剂
ACN 乙腈
Ac2OH 乙酸
Ac2O 乙酸酐
AdacOH 金刚烷乙酸
Alloc-Cl 烯丙基氧羰基氯
Boc2O 二叔丁基碳酸氢盐
DMA 二甲基乙酰胺
DMF N，N-二甲基甲酰胺
DIEA 二异丙基乙胺
Et3N 三乙胺
EtOAc 乙酸乙酯
FmocOSu 9-芴甲氧羰基N-羟基琥珀酰亚胺酯
HOBT 1-羟基苯并三唑
HF 氢氟酸
MeOH 甲醇
Mes(Mesyl) 甲磺酰
NMP 1-甲基-2-吡咯烷酮
nin. 茚三酮
i-PrOH 异丙醇
Pip 哌啶
PP 4-吡咯烷吡啶
Pyr 吡啶
SRIF 生长激素释放抑制因子
SST 促生长素抑制素受体
TEA 三乙胺
TFA 三氟乙酸
THF 四氢呋喃
Triflate(Trf) 三氟甲磺酰
Trf2O 三氟甲磺酸酐
本文所述化合物可以具有不对称中心。本发明包括所有手性的、非对映异构的、和外消旋的形式。本文所述化合物中还可以存在烯烃等的许多几何学异构体，而且本发明涵盖所有这些稳定的异构体。
通过固相技术使用Rink-酰胺MBHA树脂作为固相支持物合成了几种八肽。一般而言，通过Fmoc策略装配线性肽序列，并且采用HBTU/HOBt/DIEA或PyBOP/HOBt/DIEA作为偶联剂。环化是用过量的碘在DMF中进行的。然后使用由TFA、水、和苯甲醚组成的切割混合物由树脂上切下肽，同时将侧链脱保护。可以通过任何常规技术纯化肽，包括例如RP-HPLC，并通过分析性HPLC和MALDI-FTMS进行鉴定。
可以通过经典的溶液合成法来合成本发明的SS-14类似物，但是通常通过固相技术来合成。可以使用氯甲基化树脂或羟甲基化树脂。例如，通常如1989年3月28日发布的美国专利号4,816,438(将其公开书收入本文作为参考)中所传授的合成含有C末端游离羧基的这些肽。固相合成是以从C末端开始逐步添加链中氨基酸的方式进行的。本领域众所周知的侧链保护基团包括在内，作为具有特定反应性侧链的任何氨基酸的一部分，而且任选可以用于其它情况，诸如Trp，此时将这些氨基酸偶联到树脂上正在构建的链上。这种合成法提供了完全受保护的中间产物肽树脂。通常使用基于Rink酰胺的树脂。Rink酰胺AM树脂和Rink酰胺MBHA树脂是用于通过Fmoc化学合成肽酰胺的最受欢迎的树脂。可以使用固相肽合成法的相同方案实现第一个Fmoc氨基酸与树脂的偶联。可以以单一步骤通过95％TFA和合适清除剂的处理来实现肽酰胺与这些支持物的分离。由此，可以在体外化学合成本发明的促生长素抑制素类似物。另外，可以合成本发明的SS-14类似物，其中使用本领域技术人员众所周知的技术在体外化学合成过程中将放射性标记-结合部分与肽共价相连。在合成过程中与放射性标记-结合基团共价相连的这些肽是有利的，因为限定了共价连接的特定位点。
上文已经描述了本发明，提供下文具体实施方案是为了进一步阐明本发明。下文具体实施例并非意图限制本发明的范围。
实施例
肽的合成
合成下列肽(经过修饰的残基以粗体显示)：
1.(4-氨基)-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2
2.(4-氨基)-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Asp-NH2
3.(4-氨基)-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-D-Thr-NH2
4.(4-氨基)-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-D-Asp-NH2
5.(4-氨基)-D-Phe-c[Cys-(3-iodo)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2
6.(4-氨基-3-碘代)-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2
7.(4-氨基-3-碘代)-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Asp-NH2
8.(4-氨基-3-碘代)-D-Phe-c[Cys-(3-iodo)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2
9.(4-氨基-3-碘代)-D-Phe-c[Cys-(3-iodo)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Asp-NH2
10.D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Asp-NH2
使用了如下符号：“(4-氨基)-D-Phe”指(4-氨基苯基)-D-苯丙氨酸，即2-氨基-3-(4-氨基苯基)-丙酸；“(3-碘代)-Tyr”指(4-羟基-3-碘代苯基)-L-酪氨酸，即2-氨基-3-(4-羟基-3-碘代苯基)-丙酸；和“(4-氨基-3-碘代)-D-Phe”指(4-氨基-3-碘代苯基)-D-苯丙氨酸，即2-氨基-3-(4-氨基-3-碘代苯基)-丙酸。
使用了如下受到保护的氨基酸：Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-AsD(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、和Boc-D-Phe-OH可以由Merck(达姆施塔特，德国)的Calbiochem-Novabiochem部门获得。有些试剂(偶联剂HBTU和DIC、H-(3-碘代)-Tyr-OH、Boc-(4-氨基)-D-Phe-OH)购自Chem-ImpexInternational(伍德戴尔，伊利诺斯州)，只是Boc-(4-氨基-Fmoc)-D-Phe-OH购自Bachem(托兰斯，加利福尼亚州)。DMF购自FisherScientific，并用购自Sigma的硅酸铝钠分子筛(孔径标称4)和强酸性的Amberlite IR120(plus)阳离子交换树脂进行处理。由钙氢化物蒸馏二氯甲烷(DCM)。Rink酰胺MBHA树脂和PyBOP购自Calbiochem-Novabiochem(Merck，达姆施塔特，德国)。通过在包被在铝片(0.2mm厚，60F254)上的EM Science Merck硅胶上进行的薄层层析(TLC)监测反应，使用紫外线(254nm)作为显色剂，并将10％溶于乙醇的茚三酮、溶于乙醇的溴甲酚绿、或7％溶于乙醇的磷钼酸以及加热作为显影剂。将购自EM Science的硅胶60(230-400目)用于柱层析。
使用Kaiser测试作为固相反应过程中是否存在游离氨基基团的定性测定法。
使用取代水平0.54mmol/g的Rink酰胺MBHA树脂，通过手工固相合成法构建肽。所用激活/偶联剂是PyBOP∶HOBt∶DIEA(4∶4∶8eq)或HBTU∶HOBt∶DIEA(4∶4∶8eq)。所有偶联和脱保护在DMF中进行。通常，为了偶联第一个氨基酸，使用5个当量，并反应过夜完成偶联。此后，使用4个当量的商业性受保护氨基酸，而偶联反应的时间是4-8小时，氨基酸之间容许反应性差异。为了偶联半胱氨酸，选择不涉及使用碱基的激活/偶联方法，即溶于DCM/DMF 1/1(体积)混合物的DIC∶HOBt1∶1(mmol)，从而将差向异构降至最低。反应时间是约2小时。
首先将树脂在DCM中膨胀至少30分钟。树脂上Fmoc基团的脱保护和整个合成是在20％溶于DMF的哌啶中完成的。脱保护后，将肽-树脂用DMF清洗2次，每次1分钟；然后用DCM清洗2次，每次1分钟；再然后再次用DMF清洗2次，每次1分钟。偶联后，用DMF清洗4次，随后用DCM清洗2次，然后是用MeOH清洗2次，用DCM清洗2次，和再次用DMF清洗4次。有时要重复进行清洗过程。
环化是通过在过量的溶于DMF(20ml)的I2(10eq)中反应3小时实现的。然后将肽-树脂用DMF清洗10次或更多，直至由反应容器流出的溶剂变得清澈。为了彻底清除痕量的碘，在THF清洗后，进行0.5MNa2S2O3漂洗，随后是DCM、MeOH、DCM、THF、和DMF清洗。最后，将肽-树脂用DCM漂洗2次，并在干燥器中在高度真空下干燥，以通过升华彻底清除任何痕量的碘。
为了最后的脱保护及同时由树脂上切下最后的肽，使用由9.5mlTFA、0.25ml H2O、和0.25ml苯甲醚组成的混合液。水和苯甲醚是清除叔丁基阳离子的合适清除剂，否则叔丁基阳离子会攻击芳香族残基。在冰中分别冷却“清除混合液”和肽-树脂，然后将溶液加到树脂上，并将容器于室温摇动恰好1小时。通过过滤除去液相，并将树脂用纯的TFA清洗5次。将收集的含有目标肽之TFA盐形式的滤出液弄干，并通过3次与甲苯的共沸蒸馏来清除痕量的TFA。将粗制的肽在冰浴中冷却，并添加冷的乙醚。形成白色沉淀，用乙醚清洗，通过离心分离，溶于水，并将水溶液冻干过夜。所有粗制的肽通过HPLC显示一个主峰。
氨基酸模块的合成
Boc-(4-氨基)-D-Phe-OH可以通过商业途径获得。
肽模拟的氨基酸H-(3-碘代)-酪氨酸(10)可以通过商业途径获得。将它转变成Fmoc-(3-碘代)-酪氨酸(11，方案1)。反应在存在10％NaHCO3时进行过夜。
方案1：Fmoc-(3-T)-Tyr-OH(11)的合成
Fmoc-(3-碘代)-酪氨酸(11)向H-(3-碘代)-Tyr-OH(1.00g，3.26mmol)中添加7ml DMF和10ml丙酮，并将悬浮液在冰浴中冷却至0℃。10分钟后，逐滴添加10％NaHCO3(w/v)(7ml，8.15mmol)，随后是FmocOsu(1.32g，3.91mmol)。再添加25ml DMF，并将乳状悬浮液于室温剧烈搅动过夜。(注意：起始材料不溶于水、DMF、THF、二烷、乙腈、丙酮、CHCl3、和DCM)。在低压下除去溶剂，并添加25ml水。将水用EtOAc(5ml)抽提一次，以除去不溶于水的杂质。在冰浴中冷却水层，用2N NaHSO4酸化至pH约1，并用EtOAc(5×5ml)抽提5次。然后将EtOAc层用饱和NaCl清洗两次，在Na2SO4上干燥，过滤，并浓缩，产生清澈的油。将它在真空歧管上干燥过夜，变成白色泡沫固体。添加氯仿(50ml)，形成白色沉淀。将沉淀(产物)在布氏漏斗上过滤，并干燥过夜，得到1.41g(82％)。
1H NMR(DMF，400MHz)：δ(ppm)7.87(d，J＝8Hz，2H)，7.63(t，J＝8Hz，2H)，7.57(s，1H)，7.39(m，2H)，7.33(m，2H)，7.06(d，J＝8Hz，1H)，6.77(d，J＝8Hz，1H)，4.18(m，3H)，4.02(m，1H)，2.94(dd，J1＝16Hz，J2＝4Hz，1H)，2.72(dd，J1＝16Hz，J2＝12Hz，1H)
MS：ESI(m/z)：为C24H20NO5I计算[MH]+，预期530，实测530；[M+Na]+，预期552，实测552；[M-H]-，预期528，实测528。
[α]D25＝+9.04°(c＝0.88，MeOH)
TLC(CHCl3∶MeOH∶AcOH 90∶10∶1，溴甲酚绿)，Rf＝0.33
为了制备受保护的单碘化氨基酸Boc-(4-氨基-3-碘代)-D-Phe-OH(12，方案2)，使用“经典的”碘化剂氯化碘ICl，执行一个简单流程。
方案2：Boc-(4-氨基-3-碘代)-D-Phe-OH(12)的合成
Boc-(4-氨基-3-碘代)-D-Phe-OH(12)向100ml圆底烧瓶中加入Boc-(4-氨基)-D-Phe-OH(300mg，1.070mmol)和5ml冰乙酸。用铝箔包裹烧瓶。搅拌中，逐滴加入ICl(174mg，1.070mmol)，并立即将烧瓶封盖。将反应混合液搅动10分钟。添加过量的0.5NNa2S2O3终止反应，并淬灭剩余未反应的碘(溶液由褐色变成浅黄色)。添加乙酸乙酯和水，并分层。将水层用乙酸乙酯反萃取两次。再用0.5NNa2S2O3(3×5ml)和饱和NaCl(3×5ml)清洗合并的有机层，在Na2SO4上干燥，并过滤。浓缩滤出液，并将残余物在真空歧管上干燥。通过柱层析纯化粗品，使用EtOAc∶己烷∶AcOH 5∶5∶0.1(ml)作为洗脱液，得到118.4mg产品(27％)。将一部分产品通过HPLC进一步纯化并冻干，得到作为分析的样品(略带黄色的固体)。
1H NMR(DMSO，400MHz)：δ7.46(s，1H)，7.03(d，J＝8.0Hz，2H)，6.99(d，J＝8Hz，1H)，6.73(d，J＝8Hz，1H)，3.96(m，1H)，2.83(dd，J1＝16Hz，J2＝4Hz，1H)，2.63(dd，J1＝16Hz，J2＝12Hz，1H)，1.33(s，9H)
13C NMR(DMSO，400MHz)：δ173.4，155.1，146.6，138.5，129.6，127.3，113.9，82.9(C-I)，77.9，55.4，34.9，28.2
MS：ESI(m/z)为C14H19N2O4I计算[MH]+，预期407，实测407；[M+Na]+，预期429，实测429；[M-H]-，预期405，实测405。MALDI-FTMS：[M+Na]+，预期429.0282，实测429.0290。
m.p.68-80℃(有分解)
[α]D25＝-27.5°(c＝1，MeOH)(起始材料[α]D25＝-26.9°，c＝1，MeOH)
TLC(EtOAc∶己烷∶AcOH 5∶5∶0.1ml，茚三酮)Rf＝0.36
分析性HPLC：样品浓度1mg/ml，注射量10μl，10-90％B(A：含0.1％TFAv/v的H2O；B：含0.1％TFAv/v的AcCN)，流速1ml/min，时间30min，λ＝220nm，Rt＝18.81min。起始材料在相同条件下展示Rt＝12.16min。
Boc保护基团在所述反应条件下继续存在。得到二碘化Boc-(4-氨基-3，5-二碘代)-D-Phe-OH作为次要产物(在进行反应的一次实例中，单碘化∶二碘化的比例是大约2∶1)。通过柱层析分离混合物(单碘化化合物的产量是50％)。然后将模块掺入具有无保护芳香族胺的肽结构，因为这种胺对酰胺键形成反应的反应性低得多。
肽的合成
依照Fmoc方案，通过固相肽合成法(SPPS)合成肽酰氨。使用Rink酰胺MBHA树脂作为固相支持物。可以通过单一步骤的95％TFA处理，实现由该树脂上切下酰胺，提供较高的产量和纯度。
Rink酰胺MBHA树脂的结构
使用了如下受到保护的氨基酸：Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Boc-D-Phe-OH、和Boc-(4-氨基-Fmoc)-D-Phe-OH，以及如本文所述制备的不常用的碘化氨基酸Fmoc-(3-碘代)-Tyr-OH和Boc-(4-氨基-3-碘代)-D-Phe-OH。
所用偶联剂包括PyBOP或HBTU连同HOBt和DIEA。当侧链受保护肽在树脂上时，通过与DMF中过量碘的反应而形成二硫键。在这种情况中，碘行使除去Acm保护基团的功能，并氧化游离-SH基团而形成二硫键。
方案3、4、5、和6展示了少数例示性实施例，而且本文给出了详细流程。
方案3详述了肽2的合成。将受Fmoc保护树脂在DCM中膨胀，并使用20％哌啶/DMF使Fmoc基团脱保护。使用氨基酸与HBTU、HOBt、和DIEA(4∶4∶2∶8eq，相对于理论树脂负载0.54mmol/g)的预活化(2分钟)混合物来偶联第一个氨基酸Fmoc-Asp(OtBu)-OH。使用Fmoc方案来添加剩余氨基酸。使用溶于DMF的DIC∶HOBt(1∶1mmol)来导入最后一个氨基酸Boc-(4-氨基-Fmoc)-D-Phe-OH。然后将线性的受保护肽在树脂上用过量的碘(5eq)环化3小时。用20％溶于DMF的哌啶除去侧链Fmoc。通过TFA∶H2O∶苯甲醚(95∶2.5∶2.5％)处理，由树脂上切下环肽，伴随着清除剩余保护基团Boc和叔丁基。通过RP-HPLC纯化肽。
方案3：肽2即(4-氨基)-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Asp-NH2的固相合成
方案4图解了肽5的合成。由树脂上除去原有的Fmoc保护基团后，使用溶于DMF的PyBOP/HOBt/DIEA(4∶2∶8eq，相对于理论最大负载)将第一个氨基酸Fmoc-Thr(tBu)-OH(4eq)偶联到树脂上。使用相同偶联混合液偶联Fmoc-(3-I)-Tyr-OH过夜。如上所述使用DIC/HOBt偶联最后一个氨基酸Boc-(4-氨基-Fmoc)-D-Phe-OH。用碘实现环化。如上所述进行剩余步骤。
方案4：肽5即(4-氨基)-D-Phe-c[Cys-(3-碘代)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2的固相合成
方案5图解了肽6的合成。如上所述偶联第一个氨基酸Fmoc-Thr(tBu)-OH。使用溶于DMF的DIC∶HOBt(1∶1eq)将最后一个氨基酸Boc-(4-氨基-3-碘代)-D-Phe-OH(12)偶联到肽链上10小时。将肽用碘环化，彻底清洗，并由树脂上切下，伴随着清除保护基团。
方案5：肽6即(4-氨基-3-碘代)-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2的合成
方案6图解了肽8的合成。如上所述偶联第一个氨基酸Fmoc-Thr(tBu)-OH。如上所述还导入了Fmoc-(3-I)-Tyr-OH。使用溶于DMF的DIC∶HOBt(1∶1eq)将制备的具有游离侧链胺的最后一个氨基酸Boc-(4-氨基-3-碘代)-D-Phe-OH(12)偶联到肽链上9小时。将肽用碘环化，彻底清洗，并由树脂上切下，伴随着清除保护基团。
方案6：肽8即(4-氨基-3-碘代)-D-Phe-c[Cys-(3-碘代)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2的固相合成
(4-氨基)-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2(1)是如上所述通过手工SPPS在Rink酰胺树脂(s.1.0.54mmol/g)上合成的，0.2mmol规模，228mg粗品产量。将一部分产品纯化，使用25％B，于λ280nmUV检测，产生16.9mg纯的肽。分析条件如下：梯度10-90％B，Rt＝14.33min；等度26％B，Rt＝11.13min。MALDI-FTMS(m/z)：为C50H68N12O10S2计算[MH]+，预期1061.4695，实测1061.4733。
(4-氨基)-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Asp-NH2(2)是如上所述通过手工SPPS在Rink酰胺树脂(0.54mmol/g)上合成的，0.37g，0.2mmol规模，粗品产量143.8mg(67％)。将一部分肽(40mg)纯化，使用25％B等度，于λ280nm检测UV，产生13.3mg纯的肽。分析条件如下：梯度10-90％B，30min，Rt＝17.12min；等度26％B，Rt＝8.72min。MALDI-FTMS(m/z)：为C50H66N12O11S2计算[MH]+，预期1075.4488，实测1075.4448。
(4-氨基)-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-D-Thr-NH2(3)是如上所述合成的，0.1mmol规模，得到115mg粗品。使用等度条件23％B进行一部分物质的纯化，于λ220nmUV检测，得到了5mg纯的产品。分析条件如下：梯度10-90％B，30min，Rt＝13.58min；等度20％B，Rt＝11.59min。MALDI-FTMS(m/z)：为C50H68N12O10S2计算的[MH]+，预期1061.4695，实测1061.4650。
(4-氨基)-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-D-Asp-NH2(4)是如上所述在Rink酰胺MBHA树脂(0.54mmol/g)上手工合成的，0.19g，0.1mmol规模，得到了88.9mg(82％)。使用等度条件20％B纯化一部分肽，于λ220nmUV检测，得到了6.16mg纯的肽。分析性HPLC条件如下：梯度10-90％B，30min，Rt＝13.59min；等度20％，Rt＝11.26min。MALDI-FTMS(m/z)：为C50H66N12O11S2计算[MH]+，预期1075.4488，实测1075.4492。
(4-氨基)-D-Phe-c[Cys-(3-碘代)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2(5)是通过手工SPPS合成的，0.2mmol规模，0.37g树脂。将Fmoc-(3-I)-Tyr-OH(11)(0.26g，0.5mmol，2.5eq)、PyBOP(0.26g，0.5mmol，2.5eq)、HOBt(0.07g，0.5mmol，2.5eq)、和DIEA(0.17ml，1.0mmol，5eq)在DMF(20ml)中混合，并加到脱保护肽-树脂上。由此得到的混合液是乳白色的，因为氨基酸并非完全可溶。尽管存在这个问题，然而这种模块的偶联是成功的。将树脂由反应容器转移到闪烁瓶中，并将偶联进行过夜。由闪烁瓶中取出树脂，在布氏漏斗上用DMF和DCM清洗数次，然后转移回到反应容器中用于后续偶联。使用Kaiser测试来评估反应的完成情况，并用DMF(4×20ml)和DCM(2×20ml)和DMF(4×20ml)再次清洗树脂。照常继续肽链的构建。添加的最后一个氨基酸是在存在PyBOP(0.42g，0.5mmol，2.5eq)、HOBt(0.12g，0.5mmol，2.5eq)、和DIEA(0.21ml，0.5mmol，5eq)时在20ml DMF中预活化的Boc-(4-氨基-Fmoc)-D-Phe-OH(0.25g，0.5mmol，2.5eq)。这个残基偶联18小时。为了环化，只使用5eq碘(0.25g，1.0mmol)达3小时，以预防芳香族残基的碘化。然后如一般流程和注意一节中所述彻底清洗肽-树脂，并在干燥器中在高度真空下干燥2小时以消除最小痕量的碘。使用20％溶于DMF的哌啶除去侧链Fmoc保护基团达1小时。彻底清洗肽-树脂，并在干燥器中干燥过夜，为最后的脱保护/切除树脂做准备。TFA/H2O/苯甲醚(9.5/2.5/2.5ml)的最后处理和常规工作产生237.7mg粗制肽(定量的)。使用等度条件25％B纯化一部分(23mg)粗制产品，于λ210nm和220nmUV检测，产生了8.1mg纯的产品。分析条件如下：梯度10-90％B，30min，Rt＝18.04min；等度26％B，Rt＝16.45min。MALDI-FTMS(m/z)：为C50H67IN12O10S2计算[MH]+，预期1187.3662，实测1187.378；计算[M+Na]+，预期1209.3481，实测1209.3533。
(4-氨基-3-碘代)-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2(6)是如上所述构建的，0.2mmol规模，但是只使用90mg肽-树脂来偶联最后一个氨基酸。偶联混合液在10ml DMF中含有Boc-(4-氨基-3-碘代)-D-Phe-OH(12)(0.044g，0.11mmol，1.5eq)、DIC(0.017ml，0.11mmol，1.5eq)、和HOBt(0.017g，0.11mmol，1.5eq)，并容许反应进行10小时。用碘(0.16g，2.0mmol，10eq)进行环化达3小时，如上文关于5所述小心清洗并干燥肽-树脂。在1小时中完成最后的脱保护/切割流程，并且在冻干后得到30.6mg(53％)粗制的肽。以等度模式用24％B完成纯化。产量是9.9mg(13％，根据树脂的理论负载水平)。分析性HPLC：梯度10-90％B，于λ220nmUV检测，Rt＝18.9min；等度25％B，Rt＝9.32min。MALDI-FTMS(m/z)：为C50H67IN12O10S2计算[MH]+，预期1187.3662，实测1187.3689；[M+Na]+，预期1209.3481，实测1209.3470。
(4-氨基-3-碘代)-D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Asp-NH2(7)是以与化合物6相同的方式合成的。将一部分(90mg)肽-树脂用于偶联最后一个模块，得到19.4mg(37％)粗制的肽。用24％B纯化肽，于λ220nmUV检测。产量是4.1mg(7％)。分析性HPLC：梯度10-90％B，30min，Rt＝18.74min；等度22％B，Rt＝10.65min。MALDI-FTMS(m/z)：为C50H65IN12O11S2计算[MH]+，预期1201.3454，实测1201.3542；[M+Na]+，预期1223.3274，实测1223.3296。
(4-氨基-3-碘代)-D-Phe-c[Cys-(3-碘代)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2(8)是如上所述合成的，使用90mg肽-树脂。如上所述进行非常用模块的偶联。粗品的产量是41mg(64％)。用30分钟的25-50％B进行纯化，于λ220nmUV检测。产量是4.1mg(7.4％)。分析条件如下：梯度10-90％B，30min，Rt＝20.4min；等度25％，Rt＝16.77min。MALDI-FTMS(m/z)：为C50H66I2N12O10S2计算[MH]+，预期1313.2628，实测1313.2644；[M+Na]+，预期1335.2448，实测1335.2471。
(4-氨基-3-碘代)-D-Phe-c[Cys-(3-碘代)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Asp-NH2(9)是如上所述通过手工SPPS合成的，得到了38.7mg(60％)粗品。纯化条件如下：25-40％B，30min，于λ220nmUV检测。产量是5mg(7.8％)。分析条件如下：梯度10-90％B，40min，Rt＝17.62min；等度25％B，Rt＝10.41min。MALDI-FTMS(m/z)：为C50H64I2N12O11S2计算[MH]+，预期1327.2421，实测1327.2423；[M+Na]+，预期1349.224，实测1349.2274。
使用Vydac Protein Peptide C18柱通过RP-HPLC纯化和分析目标分子。分析用柱的尺寸是4.5×250mm(90硅石，5μm)，而制备性HPLC是22×250mm(90硅石，10μm)。检测220nm(在有些情况中是280nm)的UV吸光度。整个过程使用水(A)和乙腈(B)的二元系统，二者都含有0.1％TFA。在两台不同仪器上进行制备性HPLC，流速10ml/min。一台仪器是由两个Waters 510泵和一台双波长UV吸光度检测仪组成的系统。如下文所述还用于分析目的的另一台仪器是Waters Millenium2010系统，由两个Waters 510泵、一个715Ultra WISP样品注射器、和一台996光电二极管阵列检测仪(PDA)组成，由NecStar PC兼容计算机运作。在Waters Millenium PDA系统上得到纯化合物的两份分析性HPLC图谱，其中使用常用的30分钟的溶于水(A)的10-90％乙腈(B)线性梯度和流速1ml/min的等度洗脱。
在Varian HG-400(400MHz)和Bruker AMX 500(500MHz)分光计上得到NMR光谱。化学位移(δ)表述成相对于作为内部参考的残余不合氘溶剂的每百万份数(ppm)。使用如下缩写来解释峰裂数：s＝单峰，d＝双峰，t＝三峰，q＝四峰，dd＝双重双峰，m＝多峰，b＝宽。
在Perkin-Elmer 241旋光计上记录旋光度。
在Nicolet-Magna-IR 550Series II分光计上记录IR光谱。质谱分析(ESI，MALDI-FTMS)是由Scripps研究院(拉霍亚，加利福尼亚州)的Scripps Center for Mass Spectrometry进行的。
构象分析-NMR和分子建模研究。通过DMSO中500MHz的1D和2D1HNMR确认了所有化合物的结构。
NMR光谱学。将样品溶于DMSO-d6。在以500MHz运行的Bruker AMX500分光计上得到NMR光谱，并使用FELIX2000(Biosym/MSI公司)进行加工。
表3和4(化学位移)、表5和6(相关主链NOE)、以及表7和8(偶联常数JNH-CαH、计算的φ角、偶联常数JCαH-CβH1/JCαH-CβHh、计算的侧链群、和温度系数)列出了1H NMR数据。注意如下符号：CαH和Hα可互换使用，指与αC原子相连的质子。Hα3指与残基3的αC原子相连的质子。下标1和h分别指低场和高场共振。
表3：化合物1、3、5、8、10的化学位移
表4：化合物2、4、6、7、9的化学位移
表5：化合物1、2、3、4、和5的观测到的主链NOEa
a与距离≤2.5对应的NOE归类为强(s)；与距离＞2.5且≤3.5对应的NOE归类为中(m)；与距离＞3.5且≤4.5对应的NOE归类为弱(w)。
表6：化合物6、7、8、9、和10的观测到的主链NOE
a与距离≤2.5对应的NOE归类为强(s)；与距离＞2.5且≤3.5对应的NOE归类为中(m)；与距离＞3.5且≤4.5对应的NOE归类为弱(w)。
表7：化合物1、2-5中酰胺质子b的偶联常数JNH-CαH、计算的φ值a、偶联常数JCαH-CβH、侧链群a、和温度系数(-ppb/K)
a见NMR光谱学实验部分。
b在DMSO溶液中，认为温度系数(-δppb/K)在0-2.0-ppb/K范围内的酰胺质子参与分子内氢键或是溶剂屏蔽的。认为大于4.0-ppb/K的数值是完全暴露于溶剂的。
表8：化合物6-10中酰胺质子b的偶联常数JNH-CαH、计算的φ值a、偶联常数JCαH-CβH、侧链群a、和温度系数(-ppb/K)
a，b与表7相同
表7和8显示了使用三态旋转异构体模型根据测量得到的JCH-CH偶联常数计算得出的χ1旋转异构体群。与促生长素抑制素样结合活性有关的侧链构象是D-Phe1、D-Trp4、和Lys5的那些。对于化合物1、2、3、6、7、8、9、和10中的第1位残基而言，最占优的χ1旋转异构体一致地是反式的。这种构象容许D-Phe1的芳香族侧链位于二硫键区域附近。这些类似物在D-Phe1芳香族侧链相对于二硫键的取向方面存在一些微小差异。在大多数类似物中，该侧链采取反式取向，导致二硫键与芳香环在空间上密切接近。这种取向还报导于Sandostatin。在位置8中Cα处具有D构型的类似物中，侧链偏爱g+取向，导致位置1的芳香环远离二硫键。
至于D-Trp4和Lys5的侧链，生物活性化合物中的χ1旋转异构体分别是反式和g-，如表7和8中所示。这些旋转异构体容许D-Trp4和Lys5的侧链密切接近，这得到了对Lys5的CγH共振观测到的由D-Trp4芳香环电流引起的高磁场位移的确认。这些构象偏爱性与在亲本化合物Sandostatin中发现的非常相似。
这些研究证明所有类似物采取彼此非常相似的构象。另外，这些化合物的构象与Sandostatin及其活性类似物所采取的构象非常相似。主链构象可以描述成含有一个D-Trp位于i+1位置的II′型β-转角的反向平行β-折叠，而且大多数结构在Phe 3和Val6附近折叠。
在含有碘的分子中，似乎存在对芳香族侧链自己彼此接近的偏爱。这种趋势可能产生大块疏水区域，它可能与受体上的特定疏水区结合。或者，大个疏水碘的存在可能诱导有利于结合受体hsst2和hsst5而非hsst3的构象。
构象分析数据显示所研究的类似物彼此及与Sandostatin相比具有极大相似性。Val6与Lys5的NH质子之间的中等强度NOE及Lys5与D-Trp4的NH质子之间的NOE缺失说明这些化合物具有D-Trp位于i+1位置的II′型β-转角。这与Val6NH质子的低温度系数以及Lys5NH与D-Trp4Hα之间的强顺序NOE、Val6NH与Lys5Hα之间的中等强度NOE、和Lys5NH与Lys5Hα之间的中等强度NOE是一致的。
对主链其它部分发现的β-折叠样构象与对NH4和NH7共振测量的JNH-CαH偶联常数以及高温度系数一致(表7和8)。这些温度系数完全吻合对反向平行β-折叠结构中NH4和NH7质子预期的溶剂暴露。β-折叠样构象还得到了强顺序CαH-NH NOE(见H2α-NH3、Hα3-NH4、Hα6-NH7、和Hα7-NH8NOE)和Hα2-Hα7 NOE(表5和6)的支持。Hα2-Hα7 NOE还指示二硫键很好的模拟了β-VI转角，因为观察到这种典型的H-H NOE。
Sandostatin的构象分析说明该分子采取多种构象，诸如β-折叠结构和在C端部分中含有螺旋折叠的构象。所研究的所有类似物显示与β-折叠结构一致的NH6-NH3NOE，只有位置8为Asp的类似物显示特征为该区域部分螺旋折叠的NH7-NH8 NOE。这些NOE指示部分螺旋结构在含有Asp残基的化合物中比在位置8为Thr的化合物更加占优。
NMR光谱学。使用1H NMR、TOCSY(整体相关性光谱学)、和ROESY(旋转结构核Overhauser)实验进行共振赋值。TOCSY实验用于评估旋转系统，而ROESY实验容许根据观测到的顺序NOE连同性dCαH-HN或dHN-HN或可能是dCβH-HN给氨基酸旋转系统顺序赋值。
由1D光谱和DQF-COSY光谱的交叉峰部分得到JNH-CαH和JCαH-CβH偶联常数。测量得到的NH-CαH和CαH-CβH偶联常数容许我们估算φ和χ1扭转角的范围。邻近偶联常数JNH-CαH与扭转角φ(它表示围绕骨架单键NH-CαH的旋转状态)通过Karplus型方程式相关：
JNH-CαH＝Acos2|φ±60°|-Bcos|φ±60°|+C
其中：
(+)用于D构型而(-)用于L构型，系数是：A＝8.6，B＝1.0，和C＝0.4。
偶联常数JNH-CαH的数值和相应的估算φ角值列于表7和8。
可以使用如下常规表达式来估算各个构象异构体f1(χ1)的分数：
(a)针对L残基
f(g-)＝(JHα-Hβ1-JG)/(JT-JG)，用于邻位交叉(-)构象
f(t)＝(JHα-Hβ2-JG)/(JT-JG)，用于反式构象
f(g+)＝1-[f(g-)+f(t)]，用于邻位交叉(+)构象
(b)针对D残基：
f(t)＝(JHα-Hβ2-JG)/(JT-JG)，用于反式构象
f(g+)＝(JHα-Hβ1-JG)/(JT-JG)，用于邻位交叉(+)构象
f(g-)＝1-[(f(g-)+f(t))，用于邻位交叉(-)构象
使用反式和旁式的偶联数值JT＝13.56Hz和JG＝2.60Hz来计算非芳香族残基的旋转异构体群，而使用数值JT＝13.85Hz和JG＝3.55Hz来计算芳香族残基。
来自ROESY光谱的酰胺-β质子NOE和α-β质子NOE的不同强度容许给非对映的β质子赋值。一旦给非对映的亚甲基β质子赋值，可以使用上文方程式计算旋转异构体群f(t)、f(g+)、f(g-)。然而，在有些情况中，由于β质子的重叠或重要NOE的缺失，因而不能进行非对映异构体赋值。在这些情况中，不可能辨别两种可能的旋转异构体群。
分子建模。在SGI IRIX 6.5工作站和Challenge计算机(SiliconGraphics)上进行计算机模拟。将InsightII和DISCOVER程序用于分子机制、动力学计算、和图形显现。
首先，使用DGII/InsightII生成200个结构，然后用CVFF91力场和Newton-Ralphson VA09A算法进行约束最小化，其中收敛判据设为0.001Kcal/mol。所有计算在真空中进行，并且使用距离依赖性介电常数来考虑溶剂效应。在模拟中，肽键维持反式构象。
将这些结构的扭转角、NOE距离、和氢键样式与衍生自NMR测量的数值进行比较。使用Karplus型方程式计算与测量得到的JNH-CH偶联常数一致的扭转角，并且容忍±30°的误差。在根据氢键进行选择的情况中，保留其中认为温度系数大于2.0-ppb/K的NH质子参与氢键的结构。放弃与这些实验约束不一致的结构。使用超过最低能量构象异构体10Kcal/mol的截止值来分拣出剩余结构中能量高得不切实际的构象。
如下进行聚簇分析：首先由调查的所有构象中取出能量最低的构象异构体。使用这些构象异构体作为“种子”扩大成簇，只要选择的扭转在30°间隔内。然后重复搜索下一个高能量簇直至找到最高族。在每一次分子动力学模拟前，用3ps初始化动力学平衡系统。在进行彻底搜索可接近构象空间的尝试中，对簇中能量最低的构象进行1000K的500ps受限分子动力学，步长1fs。将与实验数据一致的构象异构体如上所述进行相同聚簇分析。最后，选择每个簇中能量最低的结构作为促生长素抑制素类似物在溶液中的优选构象。
为了调查这些优选构象之间的平衡，进行300K的无限制分子动力学模拟，其中距离依赖性介电常数为1。首先将选择的构象异构体进行3ps平衡，然后是步长1fs的5ns模拟。每10ps采集结构。在此过程中，观测构象相互交换。
生物学活性
可以在来自经单个人促生长素抑制素受体亚型转染的CC531细胞(hsst2)和CHO-K1细胞(hsst1、3、和5)的膜上执行结合测定法。可以用分散的大鼠垂体细胞执行抑制生长激素和催乳素分泌的功能测定法。
在人工照明室(08:30-20:30)中饲养体重180-200g的雌性Wistar大鼠(Harlan，荷兰)，随意供应食物和水。在09:00-10:00之间通过断头术处死动物。处死后5分钟内切除垂体腺，丢弃神经-中间体叶(neuro-intermediate lobe)，并采集前叶，置于补充了1％胎牛血清(FCS)、青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml)、两性霉素B(0.5μg/ml)、和碳酸钠(0.4μg/L终浓度)的钙镁-Hank氏平衡盐溶液(HBSS)中。
用分散酶分离雌性垂体前叶细胞(参阅例如Oosterom等，J.Endocrinol.100(3)：353-60，1984)。将散开的细胞以0.5-1×105个细胞/孔的密度接种多孔板。培养基是含Earle氏盐的Eagle氏极限必需培养基，补充1倍过量的非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、2mML-谷氨酰胺、青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml)、两性霉素B(0.25μg/ml)、和10％胎牛血清(Invitrogen，布莱达，荷兰)。培养基和补充物购自Gibco Bio-Cult Europe(Invitrogen，布莱达，荷兰)。容许细胞附着至少3天。然后，更换培养基，在含有或不含生长激素释放抑制因子(SRIF)类似物的条件下保温4小时，并在1ml完全培养基中加入10nMGH释放激素(GHRH)，每个处理组使用约四个培养皿。每个实验的结果表述成激素释放相对于对照未处理培养皿的变化百分数。通过商业性大鼠GH和PRL测定法(Amersham，英国)来测定大鼠GH和PRL的浓度。
至于促生长素抑制素受体亚型sst2和sst1、3、5分别在大鼠结肠癌(CC531)细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)-K1细胞中的表达，由pBluescript(pBS)切除pBS中的人sst1、sst2、sst3、或sst5cDNA，并插入逆转录病毒表达载体pCi-neo的Nhe-1/Sali克隆位点。通过遗传霉素抗性基因(G418)进行选择。将此载体用于稳定转染(使用DOTAP)CC531和CHO-K1细胞。选择得到稳定转染的CC531和CHO-K1细胞，并分别在补充了青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml)、两性霉素(0.25μg/ml)、和10％FCS+遗传霉素(0.5mg/ml)的RPMI 1640培养基或营养混合物F12(HAM)培养基中进行培养。
使用由表达各自人促生长素抑制素受体亚型的CC531(sst2)和CHO-K1(sst1、3、5)细胞制备的膜进行竞争性结合实验(参阅例如Reubi，Life Sci.36(19)：1829-36，1985)。将培养细胞的膜制品(对应于约25-50μg蛋白质)在总体积100μl中于室温保温45分钟，其中含有40.000cpm125I标记的[Tyr11]-促生长素抑制素-14(2000Ci/mmol)和数量渐增的未标记类似物。保温结束时，添加1ml冰冷的Hepes缓冲液(10mMHepes、5mM MgCl2、和0.02g/L杆菌肽pH7.6)，并通过在Eppendorf微离心机中以14,000rpm离心2分钟将膜结合的放射性与未结合的分开。在冰冷的Hepes缓冲液中清洗剩余的沉淀，并在γ计数器中对最后的沉淀计数。特异结合定义为结合的放射性配体的总量减去存在1μM未标记类似物时结合的放射性配体。
关于生物学测定法的进一步描述请参阅：Hofland和Lamberts，Front Horm Res.32：235-52，2004；Hofland等，J.Clin.Endocr inol.Metab.89(4)：1577-85，2004；Ferone等，Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.283(5)：E1056-66，2002；以及Hofland等，Endocrinology 136(9)：3698-706，1995。
这些实验研究RC-121的特性，并使用这些信息来改进对hsst2和hsst5受体的效力和选择性特性以及对酶促降解的抵抗力。这些工作导致了对位置1和8的残基通过与位于跨膜螺旋VI与VII之间的胞外环III(ECLIII)相互作用来控制受体选择性的作用的兴趣增加。
由此，如上所述合成了RC-121的一系列类似物，并如本文所述进行了表征。例如，[D-Phe1-Asp8](3)的生物学结果将展示对受体hsst2和hsst5的选择性。
类似物的残基8保持为Thr或Asp，D和L异构体二者皆可，并且修饰位置1的D-Phe。选择Asp作为残基8的修饰。为了修饰位置1，制备了具有疏水性和碱性二者特征的非天然氨基酸(4-氨基甲基)-苯丙氨酸。认为在位置1具有芳香族侧链的弱碱性氨基酸残基，诸如氨基酸模块(4-氨基)-D-Phe-OH，可能增强类似物的效力。因此，在RC-121即D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2 SEQ ID NO：1中用(4-氨基)-D-Phe-OH取代残基1即H-D-Phe-OH。据此测定了这组目标结构的结合亲和力和功能测定法结果。
位置1具有(4-氨基)-D-Phe-OH的化合物预期展示对受体hsst2和hsst5的有力和选择性结合。化合物[(4-氨基)-D-Phe1-Thr8](2)预期对hsst2受体的选择性比hsst5受体高一个数量级。这些化合物可以担当GH和PRL释放的抑制物。
为了研究类似物的结合亲和力，可以进行碘化测定法。放射性碘化是测定促生长素抑制素受体的组织分布和将有毒水平的放射性投递至促生长素抑制素受体阳性肿瘤的有用工具，因为数种类型的癌症表达高密度的促生长素抑制素受体。碘已经广泛用于肽和蛋白质的放射性标记或化学修饰。激素的放射性碘化类似物被用于置换研究的结合测定法(竞争性结合测定法)。
本发明的肽具有两个芳香族残基，即Tyr和(4-氨基)-D-Phe-OH。下一修饰聚焦于含芳香族侧链的残基的碘化。使用单碘化模块11和12，合成并鉴定了数种碘化肽模拟物。
合成了酪氨酸上有碘的化合物[(4-氨基)-D-phe1-(3-碘代)Tyr3-Thr8](6)和4-氨基-D-苯丙氨酸上有碘的化合物[(4-氨基-3-碘代)-D-Phe1-Thr8](7)。另外，还可以检验在分子中添加两个单碘化残基的效果。由此，制备了化合物[(4-氨基-3-碘代)-D-Phe1-(3-碘代)-Tyr3-Thr8](9)和(4-氨基-3-碘代)-D-Phe1-(3-碘代)-Tyr3-Asp8](10)，前者位置8是Thr，后者位置8是Asp。比较了含有或不含碘的目标分子的活性，并将它们的活性与构象联系起来。
肽[(4-氨基-3-碘代)-D-phe1-Thr8](7)和[(4-氨基-3-碘代)-D-Phe1-(3-碘代)-Tyr3-Thr8](9)预期展示对hsst2和hsst5受体的有力和选择性结合，以及抑制GH和PRL二者的能力提高。
本发明的促生长素抑制素类似物具有对受体hsst2和hsst5的选择性，且对GH和PRL的抑制活性与促生长素抑制素相当。
对映选择性合成了Trp的β-甲基化类似物，并掺入环六肽类似物L-363，301。测定了c[Pro-Phe-(2R，3S)-β-MeTrp-Lys-Thr-Phe]和c[Pro-Phe-(2R，3R)-β-MeTrp-Lys-Thr-Phe]对促生长素抑制素受体hsst1-5的结合效力和选择性以进一步检验结果。在那些研究中，(2R，3S)类似物比亲本肽更有效力，而(2R，3R)类似物的活性低得多。两种化合物都在纳摩尔范围内结合受体hsst2。证明该类似物对hsst2具有高度选择性，这与标准化合物L-363，301相反，后者与两种受体hsst2和hsst5的结合都很好。
含有(2R，3s)-β-MeTrp非对映异构体的肽拥有容许它与hsst2很好结合的“正确”特色组合。这一发现导致后来hsst2选择性促生长素抑制素类似物的设计。
统计学分析。使用单向方差分析(ANOVA)测定了平均值之间差异的统计学显著性。当通过这种方法观测到显著的整体效果时，使用Newman-Keuls多重比较测试进行比较。数据表述成平均值±sem。小于0.05的P值认为是显著的。使用GraphPad Prism(圣迭戈，加利福尼亚州)计算机程序，进行125I-标记[Tyr11]-促生长素抑制素-14取代的IC50值计算。
已经描述了本发明的许多实施方案。然而，应当理解，可以做出多种修改而不违背本发明的精神和范围。因此，其它实施方案也属于下文权利要求的范围之内。
机译： 生长激素抑制素类似物九肽：α-肼基酸-抑制生长激素和胰高血糖素的分泌，而不影响胰岛素和胃液的分泌，并具有更长的活性
机译： 生长激素抑制素类似物的周期性周期，具有激素发育抑制活性
机译： 生长抑素类似物具有抑制生长激素释放的活性
