应用争论产碱菌制备水产养殖饲料添加剂及其制备工艺和菌株的培养基

摘要

本发明涉及争论产碱菌在制备水产养殖饲料之生物添加剂中的应用。制备步骤是：试管斜面菌种培养，三角瓶振荡培养，种子罐发酵培养，大罐发酵培养，将大罐灭活培养液进行浓缩、干燥、粉碎，即为成品。制备所用菌株培养基主要成份按重量比为：白糖5－12份，KH2PO40.1－0.3份，MgSO4 0.06－0.15份，Nacl 0.1－0.3份，CaCO3 2－6份，水1000份。所制备的添加剂用于水产养殖，能提高肌体免疫力、抗不良环境、提高成活率；增重显著；提高鱼肉品质。

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域，特别与争论产碱菌在制备水产养殖饲料之生物添加剂中的应用及其制备工艺和制备时所用菌株的培养基成份有关。

背景技术

随着人们生活水平的提高，对水产品的需求日益增加，水产人工养殖蓬勃发展，但在人工养殖的环境下鱼类缺乏天然生物饵料的摄食，因此人工养殖存在不少问题：鱼体免疫力差，病害严重，死亡率高，有的鱼种生长慢，鱼肉品质普遍下降等等；尤其是甲鱼苗死亡率较高，大黄鱼长速慢，死亡率也高。由于人工养殖病害多，鱼农为减少鱼的死亡经常随意用药(如致癌的孔雀绿也用上)，造成鱼体毒物质积累，品质下降。为加快鱼的长速，鱼农寻找能加快长速的添加剂(激素类物质如喹乙醇等)，虽然能加快生长，但会导致鱼的应激能力变差，在拉网、运输过程中很容易死亡，鱼肉品质也下降。为了改善上述状况，近年来国内鱼类营养研究工作者正试图努力寻找生物饵料来改善人工养殖的不足之处，已报道的光合细菌(可起净化水质作用)、螺旋藻、三角褐指藻、海蒿苣、卤虫等等仅是在试验及示范中，尚未大面积推广应用。同时上述的生物饵料主要作为鱼池水质净化及蛋白质类开发，寻找能提高鱼类自身免疫力和促进鱼体生产的水产饲料添加剂已成为鱼类研究工作者的一个科研方向。

本专利的发明者在菇料中分离获得争论产碱菌(Alcaligenesparadoxus，中国科学院微生物研究所鉴定的)，该添加剂内容物含争产碱菌细胞及其代谢产物，经菌性、营养成份分析，发酵条件等试验研究，得出该菌株发酵产物含丰富多糖蛋白(390mg/100ml)、氨基酸(380mg/100ml)、胡萝卜素、不饱和脂肪酸(油酸、亚油酸、r-亚麻酸)和多种矿物元素，发酵成功率较高，粉剂淡紫色或浅褐色。利用微生物发酵，获得多糖类物质，作为水产养殖添加剂国内外未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种适用于水产养殖饲料的生物(争产碱菌(Alcaligenes paradoxus)经中国科学院微生物研究所鉴定的)添加剂。该添加剂不仅能提供水产品生产的营养物质、还可提高鱼体的免疫力、提高成活率、改善鱼肉品质、获得增产增收。

本发明是这样实现的，争论产碱菌的用途，即利用培养基制备水产养殖饲料之生物添加剂。

争论产碱菌制备水产养殖饲料之生物添加剂所用菌株的培养基，其主要成份按重量比为：

白糖             5-12份，

KH₂PO₄        0.1-0.3份，

MgSO₄          0.06-0.15份，

Nacl            0.1-0.3份，

CaCO₃          2-6份，

水              1000份；

上述培养基进一步包含CaSO₄0.05-0.08份。

上述培养基进一步包含绿豆粉15-36份。

争论产碱菌利用培养基制备水产养殖饲料生物添加剂的工艺，其步骤是：

1)斜面菌种培养：将培养基加琼脂，加热溶解，装试管，经压力1.2-1.5kg/m²灭菌30分钟，放斜面，接入争论产碱菌于30℃培养箱培养，3-4天备用；

2)三角瓶振荡培养：将培养基溶化后装入三角瓶中，经灭菌后接种，一支试管斜面可接6-10瓶，于摇床上，室温28-30℃振荡培养3-4天，即为种子液；

3)种子罐发酵培养：种子罐内装入培养基，在压力0.10-0.2Mpa灭菌30分钟，将以上备好的种子液按2-3％左右接菌量接入种子罐，罐温28-30℃，通气量1∶1，培养1天备用；

4)大罐发酵培养：采用大罐装入培养基，加3％绿豆粉，在压力0.15-0.2Mpa灭菌30分钟，待罐温降到35℃，将种子罐的发酵液移接入大罐中，罐温30℃，通气量1∶1，发酵培养44-48小时，至pH值为中性，达到规定的粘稠度9×10¹⁰个/ml菌以上，即终止发酵，灭活；

5)将大罐灭活培养液进行浓缩、干燥、粉碎，即为成品。

本发明将争论产碱菌应用于制备水产养殖饲料之生物添加剂，制得的添加剂，主要是多糖，粗品水溶性多糖占10％左右，经提取精多糖含糖量为94.68％，由鼠李糖、甘露醇、葡萄糖、半乳糖、赤藓醇等单糖组成。糖基连接键以β1-4为主，还有β1-3连接键，粗蛋白质含量20±1％。

17种氨基酸为18.777％，其中鱼类所需氨基酸占91％，包括天门冬氨酸2.291％，苏氨酸0.662％，丝氨酸0.869％，谷氨酸3.397％，甘氨酸0.754％，丙氨酸0.726％，胱氨酸0.109％，缬草氨酸0.932％，甲硫(蛋)氨酸0.224％，异亮氨酸0.833％，亮氨酸1.580％，酪氨酸0.551％，苯丙氨酸1.122％，赖氨酸2.793％，组氨酸0.480％，精氨酸1.199％，脯氨酸0.255％。

还有矿物元素，包括钙1.60×10⁸ug/g、镁43.1ug/g、锌2.07ug/g、铜0.08ug/g、钾310mg/L、钠116mg/L及不饱和脂肪酸(油酸C_18:137.6％粉剂、亚油酸C_18:234.9％粉剂、r-亚麻酸C_18:32.2％粉剂)及维生素等。

此添加剂以饲料0.3-0.5％添加喂养，能提高鱼体免疫力(抗病、抗不良环境)、增强活力，即提高成活率，增重显著：在试验的7种鱼中，不同鱼种、不同季节、试验期长短而异，最低增产12.3％(大黄鱼)，高达32％(鳖)，一般在16-26％，提高鱼品质，鱼肉水份下降1.97-2.97％，脂肪下降6.99-18.86％，而氨基酸提高0.91-15.45％；鳗鱼色泽及皮表光亮度都比对照组好；鳖苗期添加此添加剂后未出现三类苗(僵鳖)，而对照组尚存在5.29％的三类苗；现场验收罗非鱼、白鲳鱼测产解剖鱼，肥满度及内脏比，经t测验差异不显著。

具体实施方式

具体制备：

一、试管斜面菌种的制备

1、培养基配比

培养基主要成份按重量比为：

白糖                5g，

KH₂PO₄           0.3g，

MgSO₄             0.06g，

Nacl                0.3g，

CaCO₃              2g，

水                  1000ml。

2、培养基的制作

将培养基加琼脂20g，加热溶解，经压力1.2-1.5kg/m²灭菌30分钟，放斜面，接入争论产碱菌于30℃培养箱培养，3-4天备用；

二、种子液的制备

1、将与试管斜面菌种制备相同的培养基，加热溶解，装入500ml三角瓶，每瓶装200ml，经压力1.2-1.5kg/m²灭菌30分钟；

2、接种和培养

将试管斜面分割成6-8段用接种铲将表面菌丝带有薄层培养基，铲一块接入瓶中，放进培养室培养，温度为28-30℃，摇床转速为每分钟180转，连续培养72小时，检查菌种达到要求，倒入5000ml的种子瓶备用；

三、种子罐的发酵培养

1、培养基配方

白糖                 3.6kg，

KH₂PO₄            30g，

MgSO₄              45g，

Nacl                30g，

CaCO₃              1.8kg，

水                  300kg，

CaSO₄              15g，

2、消毒及培养

种子罐内装上述培养基，在压力0.10-0.2Mpa灭菌30分钟，将以上备好的种子液按2-3％左右接菌量接入种子罐，罐温28-30℃，通气量1∶1，培养1天备用，PH值达6.5-7。

四、发酵罐的发酵培养

1、培养基配方

白糖                 27kg，

KH₂PO₄            450g，

MgSO₄              240g，

Nacl                600g，

CaCO₃              12kg，

水                  3000kg，

CaSO₄              24g，

绿豆粉              90kg，

2、消毒及发酵培养

采用五吨大罐装入上述培养基，在压力0.15-0.2Mpa灭菌30分钟，待罐温降到35℃，将种子罐的发酵液移接入大罐中，罐温30℃，通气量1∶1，发酵培养44-48小时，至pH值为中性，达到规定的粘稠度9×10¹⁰个/ml菌以上，即终止发酵，灭活压力0.15-0.2Mpa，时间30分钟。

3、制粉包装：

将大罐灭活培养液，倒入浅盘，于70℃鼓风干燥、粉碎、过80目筛，包装，每袋装150g、300g，即为成品。

本发明是利用争论产碱菌制备一种营养型的添加剂，其主要成份：多糖；其他成份：蛋白质、氨基酸、矿物元素等。

产品用途：用于水产养殖，能提高肌体免疫力、抗不良环境、提高成活率、增重显著、提高鱼肉品质。

适用范围：用于淡水养殖；鳖、鳗鱼、罗非鱼、白鲳鱼等；海水养殖：大黄鱼、鲈鱼、红鳍东方豚等。根据试验，对上述养殖对象都有抗病促长增重效果。尤其在季节水温不适鱼生长时，效果更好。

使用方法：本发明所制备的添加剂是一种营养型添加剂，含丰富多糖类物质，因此不宜与饲料混合后堆放，必须即拌即喂。根据饲料量，称取所需的添加剂量按常规拌料即可。

添加量：一般网箱或池塘有饲料台的，在饲料中添加0.3％即可。如果是饲料与添加剂混合拌后撒于水中适当提高些，添加0.4-0.5％即可。

养殖试验在7种鱼(罗非鱼、白鲳鱼、鳗鱼、甲鱼、大黄鱼、鲈鱼、东方豚)上的养殖效果。在罗非鱼、白鲳、鳗鱼上的增产指标为10％-20％，在甲鱼、大黄鱼上的增产指标为5％-10％。结果：争论产碱菌制备的添加剂，以清池计罗非鱼和白鲳鱼混养(61天，大池)试验组比对照组分别增产22.4％和26.18％，单养清池计(42天，大池)罗非鱼增产12.5％，白鲳鱼增产24.12％和29.1％(三个月，小池)；鳗鱼饲料效率提高2.1％-2.5％(一个月，液剂)和4.1％(两个月，粉剂)；添加剂(粉剂)掺于饵料中堆放后喂养鳗鱼无效；添加剂(粉剂)作鳗鱼饲料添加剂增产16％(试验期4个月，延至7个多月才测产，试验受影响)，色泽、体表光亮度比对照好；添加剂(粉剂)以0.3％添加于甲鱼苗期效果较好，试验组比对照组增重32.6％，存活率提高13.96％-31.7％；小鳖5个点不管使用哪种添加量，增重17.78％-32.6％，存活率提高4.1％-31.7％，投产比达1∶5-6；大黄鱼苗种以饲料0.5％粉剂添加网箱试验107天，增重13％，体增长7.4％，鲈鱼以饵料0.5％粉剂添加试验46天，日增长率提高17.9％，日增重率提高22.8％；东方豚以饵料0.5％粉剂添加试验41天，日增长率提高31％，日增重率提高18.5％；7个鱼种试验均达到或超出增产指标，故，本发明确有推广运用的必要。

具体的实验数据：

一、添加剂提高肌体免疫力(抗病、抗不良环境)即提高了成活率，增重显著。

1、鳖苗期添加争论产碱菌制备的水产养殖饲料之生物添加剂喂养的效果：

(1)某处设三个处理试验中途遇上病害，试验期132天分池(没称重)。结果见表一。

            表一鳖场添加剂不同添加量对鳖苗期效果

从表一看出对照组平均成活率为65.35％，而添加0.3％添加剂的为86.1％，添加0.5％的为85.55％，试验组成活率分别较对照组提高31.75％和30.91％。该试验经方差分析，试验组与对照组差异达极显著水平。

(2)某处鳖场，重复上一试验，设三个处理，试验2个处理即添加0.6％、0.3％添加剂各设2个重复，对照仅设一个，因同等规格鳖池不够。该场管理较好，试验期120天分池，称重、数尾，见表二。

                                                                                                  表二

  处理  池  号  初始  结束  总耗料  (kg)  饲料系数  (％)  平均饲  料系数  净增重  较对  照平  均增  重  (％)  总死亡  数(尾)  成活  率  平均  成活  率  (％)  规  格  (克  /  尾)  尾数  重量  kg/  池  规格  克/尾  尾数  尾/  池  重量  kg/池  对  照  不加  添加  剂  6  3  1500  4.5  67.4  1247  84.45  378.05  4.749  4.749  79.55  253  83.1  83.1  试  验  组  加0.3％  添加剂  7  3  1500  4.5  81.5  1408  114.7  378.05  3.431  3.589  110.25  326  92  93.9  94.7  8  3  1500  4.5  73.7  1431  105.4  378.05  3.747  100.96  69  95.4  加0.6％添  加剂  9  3  1500  4.5  68.5  1267  86.9  378.05  4.588  4.094  82.4  17.8  233  84.5  86.8  1  0  3  1500  4.5  81.9  1337  109.5  378.05  3.600  105  163  89.1

                            测产后大、中、小鳖的比例(％)

处理  大  (＞150g)  中  (100~150g)  小  (＜100g)  特小  (三类苗)  (＜20g)  不管哪一种添加量，测产  结果添加组大、中鳖所占  比例均较对照组多，小鳖  比例较少，没有僵鳖，而  对照组僵鳖比例占  5.29％，说明添加剂可以  促进鳖生物，增强肌体活  力。对照(不加添加剂)  1.76  20.46  72.49  5.29加0.3％添加剂  3.48  30.28  66.24  /加0.6％添加剂 2.45  32.04  65.51  /

从表二看出：试验组平均分别较对照组增重32.6％和17.8％；成活率平均分别较对照组提高13.96％和4.4％(主要在水池温度低于27℃以下时，对照死的多一些)。

(3)本课题组实验室，采用玻璃水簇缸放养，缸体积60×40×50cm³，内设饲料台，每个缸放养一头，对照组和试验组各4个重复，两个处理雌雄搭配，大小基本一样，每天投饵一次，基础饲料为一般鳖饲料，试验组添加0.3％添加剂，对照组中途死一头，试验结果见表三。

                            表三添加剂对鳖体重的影响

  处理  始重  (g)  终重  (g)  增减  平均  增减  备注  对照组  360  360  0  -3.3  ①对照重复4，中途死  (原370g)  ②玻璃水簇缸体积：  60×40×50m³  ③试验期：63天  315  320  +5  435  420  -15  试验组添加  添加剂  305  330  +25  +73  355  360  +5  510  650  +140  295  420  +125

从表三看出试验组平均每头增重73克，而对照组不仅不增重，平均每头还减重3.3克(因室内鳖没晒背，水有漂白粉，环境恶劣)。

2、添加添加剂养鳗效果

某鳗场试验期2个月见表四。

                            表四

从表四看出在水温下降又未搭温棚时，添加添加剂不影响其摄食。在919m²鳗池里，饵料效率比对照组提高4.1％，除多吃饲料应长的鳗重扣除掉，实增重60.7kg。同时可见鳗鱼体色比对照组好，体表更光亮。

养鳗饲料添加试验效果，添加剂以饵料20％添加共做了3批，一个月分池饵料效率，试验组较对照组分别提高了2.1％、2.43％、2.5％。

3、大黄鱼添加添加剂试验效果

大黄鱼苗期添加添加剂，试验期107天。于网箱3×3×4m³，试验组饵料添加0.5％添加剂，设5个重复，对照组设3个重复。随机各取2个网箱，每个网箱随机取10尾测产平均值，见表五。

                                                         表五大黄鱼苗期添加添加剂养殖效果

  处理  初始  结束  增重  (克  /尾)  较对照  增重  (％)  增长  (cm/  尾)  较对  照增  重(％)  饲料  系数  (％)  较对照  饲料系  数降低  (％)  体长  (cm  )  尾  数  规格  (克  /尾)  体长  (cm)  尾  数  规格  (克  /尾)  对照  7.6  534  3.6  15.4  427  43.5  39.9  /  7.8  /  3.56  /  加0.5％添  加剂  7.6  600  3.6  16.2  480  49.2  45.6  14.29  8.6  10.26  3.01  15.45

从表五看出添加组较对照组鱼体长平均增长10.26％，平均增重14.29％。

4、红鳍东方豚及鲈鱼添加添加剂效果

该试验分别历时41天对红鳍东方豚和历时46天对鲈鱼进行添加0.5％添加剂饵料与常规饵料对比，见表六。

                                                              表六添加剂对鲈鱼、东方豚的试验结果

  鱼种  项目  体长  日增  长率  添加组较  对照组日  增长率提  高(％)  体重  日增重  率(％)  添加组  较对照  组日增  重率提  高(％)  成活  率  饲料  系数  添加组  较对照  组饲料  系统降  低(％)  试验前  试验后  试验  前平  均体  重  试验  后平  均体  重  鲈鱼  对照组  15.5  18.7  0.39  /  72.8  105.3  0.79  /  90.0  5.87  6.3  添加剂组  15.5  19.2  0.46  17.9  73.3  115.5  0.97  22.8％  93.3  5.50  东方豚  对照组  15.8  16.9  0.16  /  142.3  159.0  0.27  /  80.0  /  /  添加剂组  15.7  17.1  0.21  31％  139.5  159.1  0.32  18.50％  80.0  /

本试验水槽为0.5立方米，黑色圆形，设添加剂组和对照组各两水槽，精选体态正常的试验鱼各15尾，用电子天平逐尾称重和直尺测量体长后分别放入水槽中，流水饲养，换水量6-9倍/日，每槽设一个充气头。

饲料配料方法：常规饲料分别以红鳍东方豚和鲈鱼的配合饲料的预混料与等重的新鲜玉筋鱼混合，经过低温螺旋挤压成型的湿性饲料；添加剂按5‰的比例添加；每日投喂量按2.5-5％分2-3次投喂，视鱼的摄食情况，适当增减；定期清除残饲和粪便；每20天测试一次。

计算方法：日增长率(％)＝2(Lt-Lo)/T(Lt+Lo)×100％

日增重率(％)＝2(Wt-wo)/T(Wt+Wo)×100％

饲料系数＝G/(Wt-Wo)Nt

成活率＝(Nt-No)/No×100％

其中Wt，Lt，Nt和Wo，Lo，No为试验结束和开始时试验鱼的体重，体长和数量；G为遇到摄食量；T为试验天数。

试验结果：

1)、红鳍东方豚试验组：

试验时间：历时41天；

水温范围：18.5-22.7℃

比重1.020-1.022

开始试验平均体长：15.7-15.8厘米；

平均体重：142.3-139.5克；

结束试验平均体长：16.9-17.1厘米；

平均体重：159.0-159.1克(见列表)

2)、鲈鱼组试验组：

试验时间：历时46天；

试验水温：23.8-26.5℃

比重：1.020-1.022

开始试验平均体长：15.5厘米；

平均体重：72.8-73.3克；

结束试验平均体长：18.7-19.2厘米；

平均体重：105.3-115.5克

从表六看出红鳍东方豚试验组与对照组比较平均体长和平均体重存在着差别，日增长率和日增重率差异显著，添加组比对照组分别提高31％和18.5％；成活率没差别(主要由于使用的试验个体较大，适应期较短)。鲈鱼试验组与对照组比较平均体长和平均体重等各项指标均存在显著差异。试验组较对照组日增长率和日增重率分别提高17.9％和22.8％，成活率提高3.3％。

二、添加剂对鱼体肥满度，内脏是否有影响

采用大池试验42天的罗非鱼及白鲳鱼。

1、试验组和对照组分别随机取样50尾，测体长、体重，求肥满度。

2、试验组及对照组分别随机取样15尾，解剖内脏、称重，求内脏比，

3、对试组及对照组的肥满度，内脏比进行t测验比较。

                 添加剂对鱼体肥满度及内脏比的影响

经t测验分析比较，两种鱼的试验组与对照组的肥满度及内脏比差异不显著(p＞0.1)，说明添加剂在提高鱼产量的同时，并不影响鱼体型及肉质。

三、提高鱼体品质

1、添加添加剂养鳗，鱼色泽、皮表光亮度比对照组好。

2、三种鱼(罗非鱼、白鲳鱼、鳗鱼)品质分析结果一致：水份，试验组比对照组分别下隆1.74％～2.97％；粗脂肪含量试验组比对照组分别下降6.99％～18.86％；而总氨基酸含量试验组比对照组提高达0.91～15.45％，人体必需氨基酸也同样提高了，这对人体，特别是对儿童的生长发育很有帮助。

3、鳖苗期添加添加剂无出现三类苗(抑长的僵鳖全部转化成正常幼鳖)，而对照组尚存在5.29％的三类苗。