TPO/FL基因转导骨髓间充质干细胞的方法

摘要

本发明提供TPO/FL基因转导骨髓间充质干细胞的方法：(1)从人胎肝分离TPO和FL的mRNA，通过RT－PCR技术合成两种cDNA并克隆到pBluescript载体上，构建FL－IRES－TPO重组片段，再将重组片段转移到反转录病毒载体pLXIN上，构建成pfl30表达载体；(2)对人骨髓间充质干细胞进行pfl30表达载体转导，构建高效表达外源TPO和FL的人骨髓间充质干细胞。本发明达到了一次性基因转导而获得人骨髓间充质干细胞同时高效表达TPO和FL两种外源性基因的效果；本发明方法构建的外源性表达TPO和FL的人骨髓间充质干细胞在组成造血干/祖细胞体外扩增培养体系中，降低了造血干/祖细胞体外扩增培养的成本，并同时有效提高了造血干细胞的体外自我更新、扩增和分化能力。

说明书

技术领域

本发明属生物技术，涉及一种外源性表达血小板生成素(TPO)和fms样酪氨酸激酶-3配体(FL)的骨髓间充质干细胞构建的新生物技术。这种技术能使骨髓间充质干细胞高效表达TPO和FL两种细胞因子，由此提高支持造血干/祖细胞体外扩增的能力。

背景技术

已有的造血干/祖细胞体外扩增技术方法大致可归为两类：第一类方法是在培养体系中外加不同组合的重组细胞生长因子，目的是利用细胞生长因子对造血干/祖细胞增殖和分化进行适当的调控。这类技术方法能在一定程度上提高造血干/组细胞的扩增倍数。但如果组合中的细胞因子种类太少，就难以达到理想的扩增效果，而太多的话则会因为费用昂贵而难以在临床移植中应用。同时，不管如何组合重组细胞因子，也难以模拟体内支持造血干/祖细胞生长和分化的环境，在一定程度上限制了造血干/祖细胞的体外扩增效率。第二类是近几年来发展起来的方法，即用骨髓基质细胞(包括骨髓间充质干细胞)来模拟体内造血干/祖细胞生长和分化的环境，以促进其快速扩增和功能的激活。但在该方法中，由于骨髓基质细胞中某些细胞因子(如TPO和FL)表达甚微，所以在扩增培养体系中仍需添加外源的细胞因子予以辅助。

发明内容

本发明的目的是为了通过转基因技术，对人骨髓间充质干细胞转导TPO和FL两种高效表达的基因，提高人骨髓间充质干细胞中这两种蛋白的表达水平，并应用该转导的人骨髓间充质干细胞支持造血干/祖细胞的体外扩增，达到既有效提高造血干/祖细胞体外扩增效率，又节省造血干/祖细胞体外扩增培养成本的目的。

本发明的第一个目的是构建成pfl30表达载体，通过以下方案实现：

从人胎肝细胞分离TPO(GenBank，GI 914225)和FL(GenBank，GI 38455415)的mRNA，并通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术合成相应的cDNA。FL的cDNA片段克隆到pBluescript载体(Stratagene，La Jolla，CA)的EcoRV(TaKaRa公司)酶切位点上，TPO的cDNA与内核糖体进入位点(IRES)序列连接形成IRES-TPO片段后再克隆到pBluescript载体中FL片段之后，构建成FL-IRES-TPO重组片段。然后，FL-IRES-TPO重组片段再从pBluescript载体通过XhoI(TaKaRa公司)和BamHI(华美生物工程公司)酶切位点转移到反转录病毒载体pLXIN(Clontech，Palo Alto，CA)上，构建成pfl30表达载体。

本发明对分离和扩增的TPO和FL基因片段通过酶切和连接酶(TaKaRa公司)连接，重组FL-IRES-TPO片段，第一步行重组片段构建。

本发明所用的FL-IRES-TPO重组片段构建载体是采用pBluescript载体，获得含有FL-IRES-TPO重组片段的pBluescript载体。

本发明对FL-IRES-TPO重组片段进行人反转录病毒载体转移，第二步行表达载体构建。

本发明所用的人反转录病毒载体是采用pLXIN，获得高效表达TPO和FL的pfl30.表达载体。

本发明的第二个目的是构建高效表达外源TPO和FL基因的人骨髓间充质干细胞，通过以下方案实现：

依据LipofectAMINE转导试剂盒(Life Technologies，Grand Island，NY)指导说明书，通过兼噬性包装细胞系PA317(ATCC，Rockefeller，MA)制备pLXIN重组病毒表达载体悬浮液后，在1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(Polybrene，Sigma，St.Louis，MO)辅助下对人骨髓间充质干细胞(邱丽燕等，2004)进行8个小时的pLXIN表达载体转导。转导细胞采用G418(Merck，Germany)筛选48小时。由此构建高效表达外源TPO和FL基因的人骨髓间充质干细胞。

本发明的第三个目的是以转导TPO/FL基因的人骨髓间充质干细胞为培养基质细胞，支持造血干/祖细胞的体外扩增能力。

本发明的有益效果是：

(1)本发明提供的技术中采用TPO和FL两种基因的联合转导，达到了一次性基因转导而获得人骨髓间充质干细胞同时高效表达两种外源性基因的效果。

(2)本发明技术构建的外源性表达TPO和FL的人骨髓间充质干细胞在组成造血干/祖细胞体外扩增培养体系中，省去了培养体系中对外加这两种细胞因子的需要，降低了造血干/祖细胞体外扩增培养的成本。

(3)本发明技术产生的造血干/祖细胞体外扩增培养体系与传统的外源细胞因子组合培养方法以及未转导外源基因的骨髓间充质干细胞共培养方法比较，有效提高了造血干/祖细胞的体外自我更新、扩增和分化能力。

附图说明

图1为pfl30表达载体构建图。

图2为体外转GFP基因的长期维持。

图3为转导细胞与非转导细胞中TPO和FLmRNA表达水平的比较。

图4为转导细胞与非转导细胞中TPO和FL蛋白表达水平的比较。

图5为不同扩增培养体系下造血细胞的总细胞量、CD34⁺细胞量、细胞集落形成(CFU-Cs和CFU-GEMM)能力比较。

图6为不同扩增培养体系下造血干细胞扩增后CD34阳性和CD38阴性细胞的流式细胞仪分析图。

图7为不同培养体系下扩增的造血细胞移植NOD/SCID小鼠后，小鼠骨髓和外周血中人CD45⁺细胞动态分析。

图8为转导细胞支持扩增的造血细胞移植NOD/SCID小鼠后，人繁殖细胞(SRCs)的细胞表面抗原标记分析。

具体实施方式

本发明结合具体实施例作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。

实施例1

本发明技术采用Trizol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)分离提取人胎肝总RNA，然后采用cDNA第一链合成试剂盒(Fermentas公司)进行cDNA第一链合成，再以cDNA第一链为PCR扩增模板，分别扩增TPO和FL基因序列。TPO基因扩增引物：5’-GGG CGT TAACAT GGA GCT GAC TGA ATT GC-3’和5’-TAT GGG ATC CTT ACC CTT CCT GAG ACA G-3’。TPO基因PCR反应的总体积为25μl，95℃5分钟预变性后30个循环，每个循环包括94℃60秒，55℃45秒，72℃60秒。TPO基因扩增产物约1100bp。FL基因扩增引物：5’-GGGCGT TAA CAT GAC AGT GCT GGC GCC AGC CT-3’和5’-ATT AGG ATC CTT ACG GGGCTG TCG GGG CT-3’。FL基因PCR反应的总体积为25μl，95℃4分钟预变性后30个循环，每个循环包括94℃60秒，55℃50秒，72℃60秒。FL基因扩增产物约546bp。

FL基因序列通过EcoRV(TaKaRa公司)酶切位点用连接酶(TaKaRa公司)连接到pBluescript载体(Stratagene，La Jolla，CA)上。TPO基因序列首先与内核糖体进入位点序列(IRES)用连接酶连接形成TPO-IRES片段，TPO-IRES片段再用连接酶连接到pBluescript载体的FL基因序列之后，形成含有FL-IRES-TPO片段的pBluescript重组载体。然后，通过XhoI(TaKaRa公司)和BamHI(华美生物工程公司)酶切位点将FL-IRES-TPO片段从pBluescript载体转移到反转录病毒载体pLXIN(Clontech，Palo Alto，CA)，构建成高效表达TPO和FL的表达载体pfl30如图1。

图1中：MuLVLTR为鼠白血病病毒长末端重复序列，MusVLTR为鼠肉瘤病毒长末端重复序列，Ψ⁺为延伸的病毒包装信号，IRES为内核糖体进入位点序列，neo为新霉素磷酸转移酶基因序列。

实施例2

本发明技术采用LipofectAMINE转导试剂盒(Life Technologies，Grand Ialand，NY)进行重组病毒载体悬浮液的制备和对人骨髓间充质干细胞的转导。按照试剂盒说明书，采用兼噬性包装细胞系PA317(ATCC，Rockefeller，MA)制备重组病毒载体悬浮液，并用1mg/mL的G418(Merck，Germany)筛选重组病毒载体4天。在8μg/mL的1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(Polybrene；Sigma，St.Louis，MO)辅助下，于10-cm的培养皿(Nunc公司)中对2.0×10⁵个人骨髓间充质干细胞(邱丽燕等，2004)进行8个小时的重组病毒载体转导。然后用磷酸缓冲液(PBS)洗涤细胞，并用1mg/mL的G418筛选48小时。细胞转导效率采用增强绿色荧光蛋白(GFP)荧光流式细胞术进行分析(如图2)，其结果表明转导基因能在人骨髓间充质干细胞内长期表达。

图2中：passage-2、6、12分别为增强绿色荧光蛋白(GFP)基因转导后第2、6和12代，GFP⁺为GFP阳性，M为GFP荧光检测的平均荧光值。

实施例3

本发明技术采用免疫印渍法和RT-PCR方法检测转导的人骨髓间充质干细胞中TPO和FL基因的表达水平。

免疫印渍法：细胞在含有50mM Tris-HCl(tris(hydroxymethyl)aminomethane-HCl，pH7.4)(AMRESCO，上海生物工程有限公司)、1％Nonidet P40(NP40；Sigma)、150mM NaCl(上海生物工程有限公司)和蛋白酶抑制剂(Sigma)的缓冲液中裂解后，取50μg裂解液于12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶(上海生物工程有限公司)上电泳，电泳后采用半干转移仪(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)转移至硝化纤维素膜(Millipore公司)上，以抗-TPO抗体(R&D Systems，Minneapolis，MN)和抗-FL抗体(BIODESIGN International，Saco，ME)为初抗，以辣根过氧化酶结合抗体(Amersham Pharmacia Biotech，HongKong，China)为二抗进行免疫印渍检测。

RT-PCR法：细胞采用Trizol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)进行匀浆和分离总RNA，并在260nm OD下进行定量分析。然后采用cDNA第一链合成试剂盒(Fermentas公司)进行cDNA第一链合成，再以cDNA第一链为PCR扩增模板进行PCR反应：反应总体积为25μl，30个循环，每个循环包括94℃45秒，60℃45秒，72℃90秒。β-actin引物是5’-GACTCG ACA CCG TGT CAC CTAC-3’和5’-CAA ACA TGA TCT GGG TCA TCT TCT C-3’；TPO引物是5’-GGG CGT TAA CAT GGA GCT GAC TGA ATT GC-3’和5’-TAT GGG ATCCTT ACC CTT CCT GAG ACA G-3’；FL引物是5’-GGG CGT TAA CAT GAC AGT GCT GGCGCC AGC CT-3’和5’-ATT AGG ATC CTT ACG GGG CTG TCG GGG CT-3’。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶(SERVA，Heidelberg，NY)分离和检测。

通过Western免疫印渍分析确定了转导的人骨髓间充质干细胞中TPO和FL两种基因的强表达(图3)。结果表明TPO和FL双基因已被成功地转入人骨髓间充质干细胞并得到有效表达。

图3中：图A为免疫印渍分析，其中泳道1为未转导的人骨髓间充质干细胞(Primary)，泳道2为转导TPO/FL基因的人骨髓间充质干细胞(TPO/FL)，Anti-TPO为抗-TPO抗体，Anti-FL为抗-FL抗体，Anti-β-actin为抗-β-肌动蛋白抗体。图B为RT-PCR分析，其中泳道1为未转导的人骨髓间充质干细胞(Primary)，泳道2为转导TPO/FL基因的人骨髓间充质干细胞(TPO/FL)，TPO primer为TPO基因引物扩增产物，FL primer为FL基因引物扩增产物，β-actin primer为β-肌动蛋白基因引物扩增产物。

实施例4

本发明技术采用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法检测转导的人骨髓间充质干细胞中TPO和FL蛋白的表达。

细胞用含有10％(v/v)胎牛血清(FBS；GibcoBRL)的α-培养基(Minimal essential mediumα(MEM-α)；HyClone，Logan，UT)在37℃/5％CO₂条件下培养至铺层90％后，将5.0×10⁶个细胞转移到含有12mL培养基的75-cm²培养瓶(Nunc公司)中培养24小时，然后收集1mL培养液进行ELISA分析。ELISA分析采用TPO和FL的ELISA试剂盒(BioSourceInternational，Camarillo，CA)，TPO和FL水平以内源性表达的IL-6水平(采用IL-6 ELISA试剂盒(BioSource International))进行校正。

参见图4，转导的人骨髓间充质干细胞中的TPO基因表达水平为175±85ng/10⁵个细胞/24h，而未转基因的人骨髓间充质干细胞中TPO基因表达水平为25±11ng/10⁵个细胞/24h(图4A)；转导的人骨髓间充质干细胞中的FL基因表达水平为190±99ng/10⁵个细胞/24h，而未转基因的人骨髓间充质干细胞中FL基因表达水平为31±12ng/10⁵个细胞/24h(图4B)。

图4中：a为未转导的人骨髓间充质干细胞，b为转导TPO/FL基因的人骨髓间充质干细胞。Passage 2、4、6、8分别为转导后人骨髓间充质干细胞的第2、4、6、8代，数字(箭头所指)表明TPO、FL和IL-6的平均绝对值(ng/100,000个细胞/24h)。

实施例5

本发明技术采用转导TPO/FL基因的人骨髓间充质干细胞作为基质细胞支持造血干细胞的体外扩增培养。

在25-cm²培养瓶(Nunc公司)中种植2×10⁵个转导TPO/FL基因的人骨髓间充质干细胞，用5ml α-培养基(Minimal essential medium α(MEM-α)+10％(v/v)胎牛血清(FBS；GibcoBRL))培养至90％铺层。弃去培养液后用PBS洗涤细胞5次，然后在贴壁的人骨髓间充质干细胞层表面铺上一层聚乙烯泌孔膜(Polyethylene terephthalate track-etchedmembrane；Becton Dickinson Labware，Franklin Lakes，NJ)，再种植来自于脐血的1×10⁴个CD34⁺细胞，用5mL的IMDM(Iscove’s modified Dulbecco’s medium；Hyclone，Logan，UT)完全培养基(含50ng/mL的人干细胞因子(SCF；Amgen Biologicals，Thousand Oaks，CA)、10ng/mL的人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF；Peprotech，London，UK)、20ng/mL的人白细胞介素-3(IL-3；RELIATech GmbH，Braunschweig，Germany)、12.5％的马血清(HS；HyClone)、12.5％FBS、10^-4M的2-巯基乙醇(2-mercaptoethanol；Sigma)、2mM的L-谷氨酰胺(L-glutamine；Sigma)和10^-6M的氢化可的松(hydrocortisone；Sigma))于37℃/5％CO₂下培养1周，然后补充5mL新鲜完全培养基后继续培养1周。收集悬浮的造血细胞，进行细胞扩增总量、集落形成和流式细胞术分析。以未转导的人骨髓间充质干细胞作基质细胞以及没有基质细胞的培养体系(其他培养条件与以转导TPO/FL基因的人骨髓间充质干细胞作基质细胞的培养体系相同)作对照。

结果表明，当用转导TPO/FL基因的人骨髓间充质干细胞来支持脐血CD34⁺细胞体外扩增时，其总有核细胞数(Total cells)、CD34⁺细胞数(CD34⁺cells)、成集落细胞(CFU-Cs)总数及成红系、髓系和巨核集落细胞(CFU-GEMM)总数扩增幅度比两个对照体系都要大(表1)。

            表1不同培养体系下造血细胞扩增的倍数

  hMSCs free  Primary hMSCs  TPO/FL hMSCs  Total cells  CD34⁺cells  CFU-Cs  CFU-GEMM  55±7  7±2  5±1  4±0  320±40^*  67±12^*  52±10^*  32±6^*  910±120^*  121±15^*  62±15^*  90±12^*

Total cells为总有核细胞数，CD34+cells为CD34阳性细胞数，CFU-Cs为成集落细胞总数，CFU-GEMM为成红系、髓系和巨核集落细胞总数，hMSCs free为无人骨髓间充质赶细胞培养体系，PrimaryhMSCs为由未转导的人骨髓间充质干细胞作基质细胞的培养体系，TPO/FLhMSCs为由转导TPO/FL基因的人骨髓间充质干细胞作基质细胞的培养体系。^*为具有显著性差异(Primary hMSCs与hMSCs free比较，TPO/FL hMSCs与Primary hMSCs比较)

参见图5，三个培养体系中无人骨髓间充质干细胞作基质细胞的培养体系扩增量最低，其次是用未转导TPO/FL基因的人骨髓间充质干系报作基质细胞的培养体系，而用转导TPO/FL基因的人骨髓间充质干细胞作基质细胞的培养体系中，有核细胞总量和CFU-GEMM集落数为前者的3倍，CD34⁺细胞为前者的2倍。

图5中：图A为总有核细胞数(Total cells)，图B为CD34⁺细胞数(CD34⁺cells)，图C为成集落细胞总数(CFU-Cs)，图D为CFU-GEMM细胞总数。□为由未转导的人骨髓间充质干细胞作基质细胞培养的造血细胞，■为由转导TPO/FL基因的人骨髓间充质干细胞作基质细胞培养的造血细胞。^*表示具有显著性差异。

同时对扩增的造血细胞进行CD34和CD38的流式细胞术分析(图6)，表明TPO/FL转导的人骨髓间充质干细胞培养体系中CD34⁺CD38-细胞的比例明显大于两种对照培养体系。结果表明转导TPO/FL基因的人骨髓间充质干细胞更为有效地支持造血干细胞的扩增。

图6中：Negative control为阴性对照(非特异性荧光本底)，hMSCs free为无基质细胞培养体系扩增的造血细胞，Primary为未转导TPO/FL基因的人骨髓间充质干系报作基质细胞培养体系扩增的造血细胞，TPO/FL为转导TPO/FL基因的人骨髓间充质干细胞作基质细胞培养体系扩增的造血细胞。

实施例6

本发明技术采用NOD/SCID小鼠移植方法(SRC分析法)证实以转导TPO/FL基因的人骨髓间充质干细胞作基质细胞的培养体系扩增的造血细胞对体内造血恢复的显著作用。

如实施例5扩增培养造血细胞。造血细胞收获后以尾静脉注射方式将扩增的造血细胞移植于经350cGy半致死剂量辐照的8周龄NOD/SCID小鼠(上海生命科学院实验动物中心)。

7周后取移植小鼠骨髓和外周血单个核细胞进行流式细胞术分析。分离单个核细胞后，将细胞与鼠IgG(InterCell Techmologies，Hopewell，NJ)在4℃下共孵育10min。然后在4℃下将细胞与结合异硫氰酸荧光素(FITC)和藻红素(PE)的单克隆抗体反应15min。洗涤未结合的抗体后，细胞在FACsort流式细胞仪(Becton-Dickinson公司)进行双色流式细胞术分析。使用抗体为：结合FITC的CD14，CD15，CD19，CD33，CD34和CD41抗体，结合PE的CD38和CD45抗体(Becton-Dickinson公司)。

采用PCR扩增移植小鼠骨髓中人Alu重复序列基因以检测扩增的造血细胞在小鼠体内的植入。从移植小鼠骨髓中分离基因组DNA，以引物5’-GTG GGC GAC AGA ACG AGATTC TAT-3’和5’-CTC ACT ACT TGG AGA CAG GTT CA-3’扩增人Alu重复序列。扩增程序为94℃下变性5min，然后进行30次循环：94℃下变性1min、55℃下退火45sec、72℃下延伸1min。扩增产物进行为300-bp，在琼脂糖凝胶上进行分离检测。

被移植NOD/SCID小鼠骨髓和外周血中细胞的流式细胞术分析和人Alu基因PCR分析结果参见图7。尤其是用转导TPO/FL基因的人骨髓间充质干细胞共培养4周后的扩增细胞移植的小鼠中，其人CD45⁺细胞的比例明显大于其他体系培养的细胞(图7A，B和D)。结果表明用转导TPO/FL基因的人骨髓间充质干细胞支持扩增的造血细胞在小鼠体内的扩增能力大于其他培养体系培养扩增的细胞。

图7中：图A为小鼠骨髓中Alu序列PCR扩增和人CD45比例：泳道1-2为移植辅助细胞(Accessory cells)，泳道3-5为移植未经扩增的CD34⁺细胞(Pre-coculture)，泳道6为DNAmarker(M，100-bp DNALadder)，泳道7为阳性对照(PC，人外周血单个核细胞)，泳道8为阴性对照(NC，未移植的小鼠细胞)，hCD45(％)为人CD45阳性细胞百分比。图B和图C为在图A分析结果基础上，测定不同细胞移植后小鼠体内植入的人CD45⁺细胞比例，其中图B为来自小鼠骨髓的数据，图C为来自小鼠外周血的数据。□为移植辅助细胞(CD34-细胞，Accessory cells)，○为移植未经培养扩增的CD34⁺细胞(Pre-coculture)，■为移植无基质细胞的培养体系扩增的造血细胞(hMSCs free)，●为移植未转导的人骨髓间充质干细胞作基质细胞扩增的造血细胞(Primary)，△为移植转导TPO/FL基因的人骨髓间充质干细胞作基质细胞扩增的造血细胞(TPO/FL)。图D为移植小鼠骨髓单个核细胞的流式细胞仪分析：左上图为设门区域(流式细胞术的专用名词)，右上图为阴性对照(Negative control，非特异性荧光本底)，左下图为移植未扩增的CD34⁺细胞(Pre-coculture)，右下图为移植转导TPO/FL基因的人骨髓间充质干细胞作基质细胞扩增的造血细胞(TPO/FL)。

同样，用转导TPO/FL基因的人骨髓间充质干细胞支持扩增的造血细胞移植后具有强分化能力(图8)，CD45⁺细胞表现出CD34，CD33，CD14，CD41或CD19阳性。

图8中：图A为设门区域，图B为CD45⁺细胞百分比，图C为同型对照(非特异性荧光本底)，图D、E、F、G、H和I分别为CD45⁺细胞中CD14、CD19、CD33、CD34、CD41和GlyA阳性细胞的百分比。

实例总结：

(1)本表达载体构建技术有效地构建了能同时表达TPO和FL两种基因的反转录病毒载体：

经TPO和FL两种基因的cDNA合成和在pBluescript载体上连接F1-IRES-TPO序列片段，再通过XhoI和BamHI两个酶切位点将FL-IRES-TPO片段克隆到反转录病毒载体pLXIN上，构建成高效表达TPO和FL的表达载体pfl30。

(2)pfl30转导的人骨髓间充质干细胞具有高效表达TPO和FL两种细胞因子的优势：

经本转导技术转导的人骨髓间充质干细胞具有显著的表达TPO和FL能力。转导的人骨髓间充质干细胞中的TPO基因表达为175±85ng/10⁵个细胞/24h，FL基因表达为190±99ng/10⁵个细胞/24h。

(3)pfl30转导的人骨髓间充质干细胞有效地支持脐血造血干细胞的体外扩增效率：

由转导TPO/FL基因的人骨髓间充质干细胞作基质细胞来支持造血细胞体外扩增的培养体系中，其扩增的有核细胞总量和CFU-GEMM集落数是未转导TPO/FL基因的人骨髓间充质干细胞作基质细胞的培养体系的3倍，CD34⁺细胞为2倍。

(4)由pfl30转导的人骨髓间充质干细胞作基质细胞支持培养的造血细胞具有显著的植入能力和体内分化能力：

由转导TPO/FL基因的人骨髓间充质干细胞作基质细胞来支持造血细胞体外扩增的培养体系扩增的造血细胞移植SOD/SCID小鼠后，其骨髓和外周血中的CD45⁺细胞是未转导TPO/FL基因的人骨髓间充质干细胞作基质细胞的培养体系的2倍，并且CD45⁺细胞表现出CD34，CD33，CD14，CD41或CD19阳性。

本发明涉及的参考文献：

1.邱丽燕，王金福，沈丹，金洁.人骨髓间充质干细胞的扩增培养及向成软骨样细胞的定向诱导分化.浙江大学学报(理学版)，2004；31：337-342.