人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子特异性表达的基因序列

摘要

一种人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子特异性表达的基因序列，属于生物技术领域。本发明根据植物密码子的特点和植物生理特性人工合成人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子特异性表达的基因，该基因的5′非翻译端具有烟草花叶病毒的5′非翻译端的特征，起始密码子附近有植物Kozak序列特点，该序列能够提高基因的起始效率和表达量，该基因的信号肽被菜豆植物血球凝集素基因的信号肽取代，该基因的末端加上内质网导向信号SEQ ID10多核苷酸序列，含有SEQ ID5多核苷酸序列。本发明为利用植物生产人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，实现外源蛋白在植物种子和贮藏器官中表达，大幅提高人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子及其相关蛋白的生产。

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物技术领域的基因序列。具体地说，是一种人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子特异性表达的基因序列。

技术背景

大豆种子蛋白质的含量一般为40％左右。大豆种子的蛋白主要由两个家族组成，分别为7S和11S家族，其中7S家族蛋白的量占种子总蛋白量的25％左右。7S家族蛋白主要是由α，α′和β三个亚单位组成，其中α′启动子是种子特异性的启动子，能够在种子中高效表达。在本发明中，从大豆品种合丰39中克隆出与所有报道不同的β-伴大豆球蛋白α′亚单位启动子(Gene Bank中序列号：M13759；SEQ ID1)，并加以人工改造，能够在植物种子和贮藏器官中高效表达。

人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子主要应用于临床上因造血系统异常而导致白细胞减少的症状。能刺激粒细胞和巨噬细胞的繁殖、分化，加速骨髓移植病人造血功能的恢复，增强癌症病人对化疗的耐受性，治疗造血障碍性疾病、增强机体防御功能等方面均具有显著作用，且副作用小。荫俊等(中国医学院科学院报，1999年21卷第一期31-36页)采用PCR和定点突变的方法，对hGM-CSF基因5′端序列进行插入和定点修饰，提高了N端起始区的翻译效率，并实现在大肠杆菌中的高效表达，这种改造适用的是原核表达系统。以植物为宿主来表达人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，Ravinder等(Biological activity ofhuman granulocyte-macrophage colony stimulating factor is maintained ina fusion with seed glutelin peptide.Ravinder K.Sardana，Zaman Alli，Anil Dudani，Eilleen Tackaberry，Mitra Panahi，Muthukrishnan Narayanan，Peter Ganz and Illimar altossaar.Transgenic Research，11：521-531，用水稻种子谷蛋白启动子表达具有活性的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，转基因研究，2002年，11期，521-531页)用水稻谷蛋白启动子，在烟草中表达人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，最高表达量达到种子可溶性总蛋白的0.03％。用植物来表达人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，有两个问题没有解决。一、适合在植物中高效表达的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子多核苷酸编码优化序列还没有报道。二、缺乏高效的组织特异性启动子。本发明解决了这方面的问题题。表达量占组织可溶性蛋白总量的1％以上，比已经报道的植物特异性表达系统高出30～100倍。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子特异性表达的基因序列。使其为利用植物生产人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，实现外源蛋白在植物种子和贮藏器官中表达，生产具有生理活性的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，大幅提高人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子及其相关蛋白的生产。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明根据植物密码子的特点和植物生理特性人工合成人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子特异性表达的基因，该基因的5′非翻译端具有烟草花叶病毒的5′非翻译端的特征，起始密码子附近有植物Kozak序列特点，该序列能够提高基因的起始效率和表达量，该基因的信号肽被菜豆植物血球凝集素基因的信号肽取代，该基因的末端加上内质网导向信号SEQ ID10多核苷酸序列，含有SEQ ID5多核苷酸序列。

所述的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子特异性表达的基因，在该基因的末端加上液泡导向信号SEQ ID9多核苷酸序列，含有SEQ ID6多核苷酸序列。

所述的多核苷酸序列，包含有SEQ ID2，含有改造过的从大豆合丰39中克隆出的β-伴大豆球蛋白α′亚单位启动子。

所述的基因序列，其构建的载体，转化植物细胞，表达出的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。其特征是，它包括成熟人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子氨基酸多肽，或其保守区域，或其活性片断，或其活性的衍生物。

本发明具有能够在植物种子和贮藏器官中表达的特异性启动子，该启动子是从大豆中克隆出来的并加以改造，与现在已知的β-伴大豆球蛋白α′亚单位启动子的核苷酸序列不同，但与β-伴大豆球蛋白的α′亚单位启动子有很高的同源性，或者所述的多核苷酸能够在55℃条件下与SEQ ID1杂交。不同的位置主要在集中在第350-500位核苷酸之间，以及第907-980位核苷酸，经过改造的启动子能够在种子中特异高效表达，是一组织特异性启动子，它与β-伴大豆球蛋白的α′亚单位启动子能够杂交，它具有SEQ ID2所述的多核苷酸序列。

本发明具有适合在植物中表达的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子多核苷酸序列，人工设计并合成的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因，该基因具有烟草花叶病毒5′非翻译端；菜豆植物血球凝集素的信号肽；起始位点附近有植物Kozak特征序列；经过优化的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子成熟肽多核苷酸编码区；末端加上内质网的导向信号，这是根据植物特点设计的，能够在植物表达和累积人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，具体地说，是具有SEQ ID3多核苷酸序列。

本发明还具有适合在植物中表达的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子多核苷酸序列。人工设计并合成的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因，该基因具有烟草花叶病毒5′非翻译端；菜豆植物血球凝集素的信号肽；起始位点附近有植物Kozak特征序列；经过优化的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子成熟肽多核苷酸编码区；末端加上液泡的导向信号，这是根据植物特点设计的，能够在植物中表达和累积人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，具体地说，是具有SEQ ID4多核苷酸序列。

所述的载体，是本发明的克隆和表达载体，这些载体包括：结合有SEQ ID2序列新的β-伴大豆球蛋白α′亚单位启动子pMD18-T载体；结合有SEQ ID2序列新的β-伴大豆球蛋白的α′亚单位启动子和胭脂碱合成酶基因(NOS)终止子的pMD18-T载体；具有改造的人粒细胞巨噬细胞刺激因子SEQ ID5多核苷酸序列pMD18-T载体；具有改造的人粒细胞巨噬细胞刺激因子SEQ ID6多核苷酸序列pMD18-T载体；结合有新的β-伴大豆球蛋白的α′亚单位启动子，人粒细胞巨噬细胞刺激因子SEQ ID5多核苷酸序列和NOS终止子的pMD18-T载体；结合有新的β-伴大豆球蛋白的α′亚单位启动子，SEQ ID6多核苷酸序列和NOS终止子pMD18-T载体；具有新的β-伴大豆球蛋白的α′亚单位启动子，人粒细胞巨噬细胞刺激因子SEQ ID5多核苷酸序列和NOS终止子的pCAMBIA2300表达载体；具有新的β-伴大豆球蛋白的α′亚单位启动子，人粒细胞巨噬细胞刺激因子SEQ ID6多核苷酸序列和NOS终止子的pCAMBIA2300表达载体；具有新的β-伴大豆球蛋白的α′亚单位启动子，人粒细胞巨噬细胞刺激因子SEQID5多核苷酸序列和NOS终止子pCAMBIA3300表达载体；具有新的β-伴大豆球蛋白的α′亚单位启动子，人粒细胞巨噬细胞刺激因子SEQ ID6多核苷酸序列和NOS终止子pCAMBIA3300表达载体。

所述的新的β-伴大豆球蛋白α′亚单位启动子是指：从大豆品种合丰39中克隆出β-伴大豆球蛋白α′亚单位启动子转录起始位点下游第二个核苷酸到上游904个核苷酸的基础上，用烟草花叶病毒5′非翻译端代替β-伴大豆球蛋白α′亚单位基因的5′非翻译端。

所述的烟草花叶病毒5′非翻译端是指：烟草花叶病毒的RNA翻译起始位点上游的序列(又叫Ω序列)，具体地说，是指具有所示SEQ ID7的多核苷酸序列。

植物血球凝集素的信号肽序列是指菜豆(Phaseous Vulgaris)中植物血球凝集素前端的21个氨基酸多肽，是由63个核苷酸编码。具体寡核苷酸序列见SEQ ID8。

所述的Kozak序列是指：Kozak等人(1984)发现的，在植物或动物基因的起始密码子ATG之前存在的特定序列。总结出在真核生物中，起始密码子周边序列为ACCATGG时转录和翻译效率最高，特别是-3位的A对翻译效率非常重要。

液泡导向信号，是指菜豆球蛋白(Phaseolin)C端一个短肽AFVY(Ala-Phe-Val-Tyr)，由12个核苷酸编码，具有SEQ ID9寡核苷酸序列，能够将多肽导向液泡贮藏器官。

内质网导向信号，是指某些成熟蛋白C端4个氨基酸KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu)短肽，由12个核苷酸编码，具有SEQ ID10寡核苷酸序列，将所连接的多肽导向内质网。

胭脂碱合成酶基因(NOS)终止子，是指胭脂碱合成酶基因3′非翻译端的多核苷酸序列，它的作用是提供转录终止信号，具有SEQ ID11寡核苷酸序列。

本发明人工设计并合成的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因，在植物中高效表达和累积人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。这些人工合成粒细胞巨噬细胞集落刺激因子为利用植物来生产人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子提供了一种崭新的途径。本发明利用所述的载体转化宿主细胞，产生转基因后代植株。首先将这些载体导入农杆菌中，用上述改造过的pCAMBIA2300表达载体转化拟南芥，用上述改造过的pCAMBIA3300表达载体转化大豆。利用转基因植物生产药用重组蛋白的成本，仅为利用大肠杆菌发酵生产成本的1/10～1/50。

具体的实施方式

下面结合具体的实施例子，进一步阐述本发明的具体实施方式。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等(1989)编著的分子克隆实验手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实验所用的pMD18-T载体是大连TaKaRa公司产品，pCAMBIA2300和pCAMBIA2300是由澳大利亚CAMBIA实验室提供。

实施例1人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子在拟南芥中进行表达

步骤1新的β-伴大豆球蛋白的α′亚单位启动子获得

1.从大豆品种合丰39中用SEQ ID12和SEQ ID13所列的引物，用高保真的Taq酶(购自大连TaKaRa公司公司)克隆出SEQ ID14，连入pMD18-T载体，导入大肠杆菌DH5α，测序验证，与已报道的β-伴大豆球蛋白的α′亚单位启动子有93％的同源性。

2.提取质粒，以SEQ ID14为模板，用SEQ ID12和SEQ ID15所列的引物，克隆出SEQ ID2。连入pMD18-T载体，导入大肠杆菌DH5α，测序验证。

3.从pBI101质粒中用EcoR I和Sac I酶切下NOS终止子，连入含有上述SEQ ID2的pMD18-T载体，组成含有SEQ ID2和NOS终止子的pMD18-T载体，命名pMD18-ID2-NOS。

步骤2人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的人工合成

人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子选用植物偏爱的密码子和根据植物生理特性，合成SEQ ID5和SEQ ID6之后连入载体pMD18-T，分别为pMD18-ID5和pMD18-ID6。

步骤3人粒细胞巨噬细胞序列信息和同源性分析

本发明的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因全长详见序列SEQ ID5和SEQID6，其中开放读框位于核苷酸第8-469位核苷酸，编码152个氨基酸，分子量分别为17142和17137，等电点分别pI＝5.18和pI＝5.33。

将人工合成的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子全长序列及其编码的蛋白用BLAST程序在Non-redundant，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundantGenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白同源性检索，结果发现在核苷酸水平上，它与人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子编码区(SEQ ID18)有64％的同源性。在氨基酸水平上，包含有人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子成熟肽的全部127个氨基酸(SEQ ID19)。

步骤4pCAMBIA2300表达载体的构建

1.将携带合成基因的质粒载体pMD18-ID5和pMD18-ID6用EcoR I和ApaLI双酶切，切下目的基因SEQ ID5和SEQ ID6。

2.用ApaL I部分酶切pMD18-ID2-NOS质粒，用0.8％琼脂糖电泳分离，获得含有SEQID2和NOS终止子的载体片断后用EcoR I酶切。

3.将2中的目标片断分别与人工合成的基因SEQ ID5和SEQ ID6用T4连接酶连接，过夜，用氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆。

4.用EcoR I和Sal I双酶切上述产物，获得SEQ ID16和SEQ ID17片断。

5.用EcoR I和Sal I双酶切pCAMBIA2300质粒，分别与SEQ ID16和SEQ ID17片断用T4连接酶连接，过夜。导入农杆菌GV3101中。

步骤5转化拟南芥

1.当拟南芥开始开花，将花苔的基部剪断，待其侧枝抽苔后再用于转化。

2.将含有步骤3中构建的pCAMBIA2300表达载体农杆菌GV3101菌液，吸取适量加入YEP(每升含10g胰蛋白胨，10g酵母抽提物，5gNaCl)/Gent(庆大霉素80mg/L)+Kan(卡那霉素50mg/L)培养基中，28℃，250rpm培养36hr。

2.22℃，5500g离心20min，去上清，用转化介质(1/2×MS大量成分(Murashige and Skoog，1962)，1/2×B5微量成分(Gamborg et al，1968)，5％sucrose，0.05％silwet-77，44nM benzylaminopurine)重悬，调整OD值达到0.8左右。

3.将刚开花的拟南芥倒立在转化介质中，浸30秒中，并轻轻摇动。

4.取出拟南芥，将叶、茎、花上多余的水珠抖落，平放在干净的塑料盆中，并用薄膜覆盖闭光保湿16hr。

5.揭开薄膜，将拟南芥放置在日光灯下，光照强度80～110μmol.m^-2.s^-1，并浇Hogland营养液(KNO₃5×10^-3mol/L，KH₂PO₄5×10^-3mol/L，MgSO₄.7H₂O4×10^-3mol/L，Ca(NO₃)₂4×10^-3mol/L，FeSO₄·7H₂O5×10^-5mol/L，Na₂-EDTA 5×10^-5mol/L，MS微量成分(Murashige and Skoog，1962))，待其拟南芥角果完全枯黄、开裂时，收获种子。

6.将消毒过的拟南芥种子移至含有Kan(50mg/L)的筛选平板上，均匀平铺，并吸去平板内多余的水。

7. 4’C春化2d，移至温室中，保证光照强度80～110μmol.m^-2.s^-1。

8.约10d之后已转入质粒的植株具有Kan抗性，所以子叶为绿色，下胚轴较长，并已长出两片真叶。

9.将转化子移至已用营养液浇透的蛭石中，用薄膜保湿过夜，第二天移至气候温室中，培养条件同5。

10.收获T2代种子，分析。

步骤6利用western blot检测人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子在转基因拟南芥中的表达。

1.蛋白的提取：a)取50mg叶片，加入100μl1×PBS(KH₂PO₄0.2g/l，Na₂HPO₄1.15g/l，KCl 0.2g/l，NaCl 8g/l)于1.5ml离心管中研碎；b)13000g，4℃离心10分钟；c)取上清，备用(以上过程于冰上进行)。

2.蛋白质定量：参考Bradford法(Bradford，1976)。取2μl蛋白样品，加入1mlBradford试剂，混匀后，分光光度计测OD₅₉₅。

3.SDS-PAGE分离蛋白：SDS-PAGE的制备参考《分子克隆》(Sambrook等，1989)：a)加样前，将样品置于含50mmol/LDTT的加样缓冲液(2×加样缓冲液：甘油2.4g，1M Tris-HCl 1ml(pH6.8)；溴酚兰0.01％，H₂O定容20ml)，煮沸10分钟；c)室温100V电压下聚丙烯酰胺凝胶电泳，直到指示剂(溴酚兰)前沿达到凝胶的底部。

4.蛋白质向硝酸纤维素膜上转移：a)转移之前，用缓冲液(39ml甘氨酸，48mmol Tris-base，0.037％SDS，20％甲醇)平衡凝胶和硝酸纤维膜30分钟；b)室温下用半干式电转仪转移1h，凝胶两侧各垫3层Whatman滤纸。

膜上蛋白检测：a)将硝酸纤维膜浸在封闭液中，37℃缓慢摇动，封闭60分钟(封闭液：取5克脱脂奶粉溶于100ml1×PBS(含0.5g叠氮钠))；b)再将滤膜浸泡在洗涤缓冲液中，37℃洗涤两次，每次15分钟；c)加入第一抗体(抗人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的抗体)，37℃温育30分钟；同步骤b)，洗涤三次；d)加入第二抗体(亲和素-碱性磷酸酶复合物)，37℃温育30分钟；同步骤b)，洗涤两次；e)加入底物显色观察蛋白带。

实施例2人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子在大豆品种合丰25中的表达

步骤1pCAMBIA3300表达载体的构建

1.将携带合成基因的质粒载体pMD18-ID5和pMD18-ID6用EcoR I和ApaLI双酶切，切下目的基因SEQ ID5和SEQ ID6。

2.用ApaL I部分酶切pMD18-ID2-NOS质粒，用0.8％琼脂糖电泳分离，获得含有SEQID2和NOS终止子的载体片断用EcoR I酶切。

3.将2中的目标片断分别与人工合成的基因SEQ ID5和SEQ ID6用T4连接酶连接，过夜，用氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆。

4.用EcoR I和Sal I双酶切上述产物，获得SEQ ID16和SEQ ID17片断。

5.用EcoR I酶切pCAMBIA3300质粒，用T4DNA聚合酶补平，用Shrimp碱性磷酸酶去磷酸化。

6.将上述片断分别与SEQ ID16和SEQ ID17片断用T4连接酶连接，过夜，导入农杆菌LBA4404中。

步骤2转化大豆品种合丰25

1.大豆种子经过消毒，放在MSB(MS大量成分(Murashige and Skoog，1962)+B5微量成分(Gamborg et al，1968))+6-BA(6-苄氨基嘌呤，6-benzylaminopurine)0.4mg/L(PH5.8)培养基上萌发5天，去顶芽并制造伤口，得到外植体，放在MSB+6-BA10mg/L+IBA 0.2mg/L(PH5.8)培养基预培养一天。

2.真空条件下在104Pa负压条件下，实施列4中构建pCAMBIA3300表达载体农杆菌LBA4404感染10～20分钟(OD600nm≈0.5)，放在MSB+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.2mg/L(PH5.8)培养基上共培养3天，取出放在MSB+6-BA0.5mg/L+IBA0.1mg/L+头孢霉素300mg/L+羧苄青霉素300mg/L(PH＝5.8)培养基上除菌2周。

3.除菌后的外植体放在MSB+卡那霉素80mg/L(PH＝5.8)培养基上，每2周转接一次，进行筛选至出现不定芽。伸长到1～2cm时切除子叶，至伸长到3～4cm。

4.切下外植体上的不定芽并放在1/2MSB+卡那霉素50mg/L(PH＝5.8)培养基上，进行转化芽诱导生根15～20天，移栽到大盆直至获得转化植株产生的种子。

5.收获T2代种子，进行分析。

蛋白的定量分析同实施例1中的步骤6

实施例3人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子在大豆品种合丰42中的表达

步骤同实施例2，但转化的品种是大豆合丰42

实验结果表明，人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子累积可以达到种子可溶性蛋白的1％以上，能够在贮藏器官中累积具有生理活性的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。

SEQ ID NO.1的信息

(i)序列特征：

(A)长度：962bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.1

gttttcaaat ttgaatttta atgtgtgttg taagtataaa tttaaaataa aaataaaaac       60

aattattata tcaaaatggc aaaaacattt aatacgtatt atttattaaa aaaatatgta      120

ataatatatt tatattttaa tatctattct tatgtatttt ttaaaaatct attatatatt      180

gatcaactaa aatattttta tatctacact tattttgcat ttttatcaat tttcttgcgt      240

tttttggcat atttaataat gactattctt taataatcaa tcattattct tacatggtac      300

atattgttgg aaccatatga agtgttcatt gcatttgact atgtggatag tgttttgatc      360

catgcccttc atttgccgct attaattaat ttggtaacag attcgttcta atcagttact      420

taatccttcc tcatcataat taatctggta gttcgaatgc cataatattg attagttttt      480

tggaccataa gaaaaagcca aggaacaaaa gaagacaaaa cacaatgaga gtatcctttg      540

catagcaatg tctaagttca taaaattcaa acaaaaacgc aatcacacac agtggacatc      600

acttatccac tagctgatca ggatcgccgc gtcaagaaaa aaaaactgga ccccaaaagc      660

catgcacaac aacacgtact cacaaaggcg tcaatcgagc agcccaaaac attcaccaac       720

tcaacccatc atgagcccac acatttgttg tttctaaccc aacctcaaac tcgtattctc       780

ttccgccacc tcatttttgt ttatttcaac acccgtcaaa ctgcatccca ccccgtggcc       840

aaatgttcat gcatgttaac aagacctatg actataaata tctgcaatct cggcccaagt       900

tttcatcatc aagaaccagt tcaatatcct agtacgccgt attaaagaat ttaagatata       960

ct                                                                      962

SEQ ID NO.2的信息

(i)序列特征：

(A)长度：980bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.2

gttttcaaat ttgaatttta atgtgtgttg taagtataaa tttaaaataa aaataaaaac        60

aattattata tcaaaatggc aaaaacattt aatacgtatt atttaagaaa aaaatatgta       120

ataatatatt tatattttaa tatctattct tatgtatttt ttaaaaatct attatatatt       180

gatcaactaa aatattttta tatctacact tattttgcat ttttatcaat tttcttgcgt       240

tttttggcat atttaataat gactattctt taataatcaa tcattattct tacatggtac       300

atattgttgg aaccatatga agtgtccatt gcatttgact atgtggatag tgttttgatc       360

caggcctcca tttgccgctt attaattaat ttggtaacag tccgtactaa tcagttactt       420

atccttcctc catcataatt aatcttggta gtctcgaatg ccacaacact gactagtctc       480

ttggatcata agaaaaagcc aaggaacaaa agaagacaaa acacaatgag agtatccttt       540

gcatagcaat gtctaagttc ataaaattca aacaaaaacg caatcacaca cagtggacat       600

cacttatcca ctagctgatc aggatcgccg cgtcaagaaa aaaaactgga ccccaaaagc       660

catgcacaac aacacgtact cacaaaggtg tcaatcgagc agcccaaaac attcaccaac       720

tcaacccatc atgagcccac acatttgttg tttctaaccc aacctcaaac tcgtattctc       780

ttccgccacc tcatttttgt ttatttcaac accccgtcaa actgcatgcc accccgtggc       840

caaatgtcca tgcatgttaa caagacctat gactataaat atctgcaatc tcggcccaag       900

ttttcattat ttttacaaca attaccaaca acaacaaaca acaaacaaca ttacaattac       960

tatttacaat tacagtgcac                                                   980

SEQ ID NO.3的信息

(i)序列特征：

(A)长度：536bp

(B)类型：核苷酸

(c)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.3

tatttttaca acaattacca acaacaacaa acaacaaaca acattacaat tactatttac        60

aattacagtg cacaatggct tcctccaact tactctccct agccctcttc cttgtgcttc       120

tcacccacgc aaactcagca cccgcccgct cgcccagccc cagcacgcag ccctgggagc       180

atgtgaatgc catccaggag gcccggcgtc tcctgaacct gagtagagac actgctgctg       240

agatgaatga aacagtagaa gtcatctcag aaatgtttga cctccaggag ccgacctgcc       300

tacagacccg cctggagctg tacaagcagg gcctgcgggg cagcctcacc aagctcaagg       360

gccccttgac catgatagcc agccactaca agcagcactg ccctccaacc ccggaaactt       420

cctgtgcaac ccagattatc acctttgaaa gtttcaaaga gaacctgaag gactttctgc       480

ttgtcatccc ctttgactgc tgggagccag tccaggagaa ggatgagctt tgatga           536

SEQ ID NO.4的信息

(i)序列特征：

(A)长度：536bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.4

tatttttaca acaattacca acaacaacaa acaacaaaca acattacaat tactatttac        60

aattacagtg cacaatggct tcctccaact tactctccct agccctcttc cttgtgcttc       120

tcacccacgc aaactcagct ccagctagat ctccatctcc atctactcaa ccatgggagc       180

atgttaacgc tattcaagag gctagaagac ttcttaacct ttctagagat actgctgctg       240

agatgaacga gactgttgag gttatttctg agatgttcga tcttcaagag ccaacttgcc       300

ttcaaactag acttgagctt tataagcaag gacttagagg atctcttact aagcttaagg       360

gaccacttac tatgattgct tctcattata agcaacattg cccaccaact ccagagactt       420

cttgcgctac tcaaattatt actttcgagt ctttcaagga gaaccttaag gatttccttc       480

ttgttattcc attcgattgc tgggagccag ttcaagaggc tttcgtttac tgatga           536

SEQ ID NO.5的信息

(i)序列特征：

(A)长度：469bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.5

gtgcacaatg gcttcctcca acttactctc cctagccctc ttccttgtgc ttctcaccca        60

cgcaaactca gctccagcta gatctccatc tccatctact caaccatggg agcatgttaa       120

cgctattcaa gaggctagaa gacttcttaa cctttctaga gatactgctg ctgagatgaa       180

cgagactgtt gaggttattt ctgagatgtt cgatcttcaa gagccaactt gccttcaaac       240

tagacttgag ctttataagc aaggacttag aggatctctt actaagctta agggaccact       300

tactatgatt gcttctcatt ataagcaaca ttgcccacca actccagaga cttcttgcgc       360

tactcaaatt attactttcg agtctttcaa ggagaacctt aaggatttcc ttcttgttat       420

tccattcgat tgctgggagc cagttcaaga gaaggatgag ctttgatga                   469

SEQ ID NO.6的信息

(i)序列特征：

(A)长度：469bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.6

gtgcacaatg gcttcctcca acttactctc cctagccctc ttccttgtgc ttctcaccca        60

cgcaaactca gctccagcta gatctccatc tccatctact caaccatggg agcatgttaa       120

cgctattcaa gaggctagaa gacttcttaa cctttctaga gatactgctg ctgagatgaa       180

cgagactgtt gaggttattt ctgagatgtt cgatcttcaa gagccaactt gccttcaaac       240

tagacttgag ctttataagc aaggacttag aggatctctt actaagctta agggaccact       300

tactatgatt gcttctcatt ataagcaaca ttgcccacca actccagaga cttcttgcgc       360

tactcaaatt attactttcg agtctttcaa ggagaacctt aaggatttcc ttcttgttat       420

tccattcgat tgctgggagc cagttcaaga ggctttcgtt tactgatga                   469

SEQ ID NO.7的信息

(i)序列特征：

(A)长度：67bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.7

tatttttaca acaattacca acaacaacaa acaacaaaca acattacaat tactatttac        60

aattaca                                                                   67

SEQ ID NO.8的信息

(i)序列特征：

(A)长度：63bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.8

atggcttcct ccaacttact ctccctagcc ctcttccttg tgcttctcac ccacgcaaac  60

tca                                                                63

SEQ ID NO.9的信息

(i)序列特征：

(A)长度：12bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.9

gctttcgttt ac  12

SEQ ID NO.10的信息

(i)序列特征：

(A)长度：12bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.10

aaggatgagc tt  12

SEQ ID NO.11的信息

(i)序列特征：

(A)长度：277bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.11

gagctcgaat ttccccgatc gttcaaacat ttggcaataa agtttcttaa gattgaatcc        60

tgttgccggt cttgcgatga ttatcatata atttctgttg aattacgtta agcatgtaat       120

aattaacatg taatgcatga cgttatttat gagatgggtt tttatgatta gagtcccgca       180

attatacatt taatacgcga tagaaaacaa aatatagcgc gcaaactagg ataaattatc       240

gcgcgcggtg tcatctatgt tactagatcg ggaattc                           277

SEQ ID NO.12的信息

(i)序列特征：

(A)长度：25bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.12

gttttcaaat ttgaatttta atgtg     25

SEQ ID NO.13的信息

(i)序列特征：

(A)长度：60bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.13

gttgtttgtt gttgttggta attgttgtaa aaataatgaa aacttgggcc gagattgcag 60

SEQ ID NO.14的信息

(i)序列特征：

(A)长度：907bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.14

gttttcaaat ttgaatttta atgtgtgttg taagtataaa tttaaaataa aaataaaaac        60

aattattata tcaaaatggc aaaaacattt aatacgtatt atttaagaaa aaaatatgta       120

ataatatatt tatattttaa tatctattct tatgtatttt ttaaaaatct attatatatt       180

gatcaactaa aatattttta tatctacact tattttgcat ttttatcaat tttcttgcgt       240

tttttggcat atttaataat gactattctt taataatcaa tcattattct tacatggtac       300

atattgttgg aaccatatga agtgtccatt gcatttgact atgtggatag tgttttgatc       360

caggcctcca tttgccgctt attaattaat ttggtaacag tccgtactaa tcagttactt       420

atccttcctc catcataatt aatcttggta gtctcgaatg ccacaacact gactagtctc       480

ttggatcata agaaaaagcc aaggaacaaa agaagacaaa acacaatgag agtatccttt       540

gcatagcaat gtctaagttc ataaaattca aacaaaaacg caatcacaca cagtggacat       600

cacttatcca ctagctgatc aggatcgccg cgtcaagaaa aaaaactgga ccccaaaagc       660

catgcacaac aacacgtact cacaaaggtg tcaatcgagc agcccaaaac attcaccaac       720

tcaacccatc atgagcccac acatttgttg tttctaaccc aacctcaaac tcgtattctc       780

ttccgccacc tcatttttgt ttatttcaac accccgtcaa actgcatgcc accccgtggc       840

caaatgtcca tgcatgttaa caagacctat gactataaat atctgcaatc tcggcccaag       900

ttttcat                                                                 907

SEQ ID NO.15的信息

(i)序列特征：

(A)长度：56bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.15

gtgcactgta attgtaaata gtaattgtaa tgttgtttgt tgtttgttgt tgttgg 56

SEQ ID NO.16的信息

(i)序列特征：

(A)长度：1726bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.16

gttttcaaat ttgaatttta atgtgtgttg taagtataaa tttaaaataa aaataaaaac        60

aattattata tcaaaatggc aaaaacattt aatacgtatt atttaagaaa aaaatatgta       120

ataatatatt tatattttaa tatctattct tatgtatttt ttaaaaatct attatatatt       180

gatcaactaa aatattttta tatctacact tattttgcat ttttatcaat tttcttgcgt       240

tttttggcat atttaataat gactattctt taataatcaa tcattattct tacatggtac       300

atattgttgg aaccatatga agtgtccatt gcatttgact atgtggatag tgttttgatc       360

caggcctcca tttgccgctt attaattaat ttggtaacag tccgtactaa tcagttactt       420

atccttcctc catcataatt aatcttggta gtctcgaatg ccacaacact gactagtctc       480

ttggatcata agaaaaagcc aaggaacaaa agaagacaaa acacaatgag agtatccttt       540

gcatagcaat gtctaagttc ataaaattca aacaaaaacg caatcacaca cagtggacat       600

cacttatcca ctagctgatc aggatcgccg cgtcaagaaa aaaaactgga ccccaaaagc       660

catgcacaac aacacgtact cacaaaggtg tcaatcgagc agcccaaaac attcaccaac       720

tcaacccatc atgagcccac acatttgttg tttctaaccc aacctcaaac tcgtattctc       780

ttccgccacc tcatttttgt ttatttcaac accccgtcaa actgcatgcc accccgtggc       840

caaatgtcca tgcatgttaa caagacctat gactataaat atctgcaatc tcggcccaag       900

ttttcattat ttttacaaca attaccaaca acaacaaaca acaaacaaca ttacaattac       960

tatttacaat tacagtgcac aatggcttcc tccaacttac tctccctagc cctcttcctt      1020

gtgcttctca cccacgcaaa ctcagcaccc gcccgctcgc ccagccccag cacgcagccc      1080

tgggagcatg tgaatgccat ccaggaggcc cggcgtctcc tgaacctgag tagagacact      1140

gctgctgaga tgaatgaaac agtagaagtc atctcagaaa tgtttgacct ccaggagccg      1200

acctgcctac agacccgcct ggagctgtac aagcagggcc tgcggggcag cctcaccaag      1260

ctcaagggcc ccttgaccat gatagccagc cactacaagc agcactgccc tccaaccccg      1320

gaaacttcct gtgcaaccca gattatcacc tttgaaagtt tcaaagagaa cctgaaggac      1380

tttctgcttg tcatcccctt tgactgctgg gagccagtcc aggaggcttt cgtttactga      1440

tgaggtaccg agctcgaatt tccccgatcg ttcaaacatt tggcaataaa gtttcttaag      1500

attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat tatcatataa tttctgttga attacgttaa      1560

gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac gttatttatg agatgggttt ttatgattag      1620

agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat agaaaacaaa atatagcgcg caaactagga      1680

taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt actagatcgg gaattc                     1726

SEQ ID NO.17的信息

(i)序列特征：

(A)长度：1726bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.17

gttttcaaat ttgaatttta atgtgtgttg taagtataaa tttaaaataa aaataaaaac        60

aattattata tcaaaatggc aaaaacattt aatacgtatt atttaagaaa aaaatatgta       120

ataatatatt tatattttaa tatctattct tatgtatttt ttaaaaatct attatatatt       180

gatcaactaa aatattttta tatctacact tattttgcat ttttatcaat tttcttgcgt       240

tttttggcat atttaataat gactattctt taataatcaa tcattattct tacatggtac       300

atattgttgg aaccatatga agtgtccatt gcatttgact atgtggatag tgttttgatc       360

caggcctcca tttgccgctt attaattaat ttggtaacag tccgtactaa tcagttactt       420

atccttcctc catcataatt aatcttggta gtctcgaatg ccacaacact gactagtctc       480

ttggatcata agaaaaagcc aaggaacaaa agaagacaaa acacaatgag agtatccttt       540

gcatagcaat gtctaagttc ataaaattca aacaaaaacg caatcacaca cagtggacat       600

cacttatcca ctagctgatc aggatcgccg cgtcaagaaa aaaaactgga ccccaaaagc       660

catgcacaac aacacgtact cacaaaggtg tcaatcgagc agcccaaaac attcaccaac       720

tcaacccatc atgagcccac acatttgttg tttctaaccc aacctcaaac tcgtattctc       780

ttccgccacc tcatttttgt ttatttcaac accccgtcaa actgcatgcc accccgtggc       840

caaatgtcca tgcatgttaa caagacctat gactataaat atctgcaatc tcggcccaag       900

ttttcattat ttttacaaca attaccaaca acaacaaaca acaaacaaca ttacaattac       960

tatttacaat tacagtgcac aatggcttcc tccaacttac tctccctagc cctcttcctt      1020

gtgcttctca cccacgcaaa ctcagcaccc gcccgctcgc ccagccccag cacgcagccc      1080

tgggagcatg tgaatgccat ccaggaggcc cggcgtctcc tgaacctgag tagagacact      1140

gctgctgaga tgaatgaaac agtagaagtc atctcagaaa tgtttgacct ccaggagccg      1200

acctgcctac agacccgcct ggagctgtac aagcagggcc tgcggggcag cctcaccaag      1260

ctcaagggcc ccttgaccat gatagccagc cactacaagc agcactgccc tccaaccccg      1320

gaaacttcct gtgcaaccca gattatcacc tttgaaagtt tcaaagagaa cctgaaggac      1380

tttctgcttg tcatcccctt tgactgctgg gagccagtcc aggagaagga tgagctttga      1440

tgaggtaccg agctcgaatt tccccgatcg ttcaaacatt tggcaataaa gtttcttaag      1500

attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat tatcatataa tttctgttga attacgttaa      1560

gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac gttatttatg agatgggttt ttatgattag      1620

agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat agaaaacaaa atatagcgcg caaactagga      1680

taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt actagatcgg gaattc                     1726

SEQ ID NO.18的信息

(i)序列特征：

(A)长度：435bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.18

atgtggctgc agagcctgct gctcttgggc actgtggcct gcagcatctc tgcacccgcc        60

cgctcgccca gccccagcac gcagccctgg gagcatgtga atgccatcca ggaggcccgg       120

cgtctcctga acctgagtag agacactgct gctgagatga atgaaacagt agaagtcatc       180

tcagaaatgt ttgacctcca ggagccgacc tgcctacaga cccgcctgga gctgtacaag       240

cagggcctgc ggggcagcct caccaagctc aagggcccct tgaccatgat agccagccac       300

tacaagcagc actgccctcc aaccccggaa acttcctgtg caacccagat tatcaccttt       360

gaaagtttca aagagaacct gaaggacttt ctgcttgtca tcccctttga ctgctgggag       420

ccagtccagg agtga                                                        435

SEQ ID NO.19的信息

(i)序列特征：

(A)长度：127个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：多肽

(iii)序列描述：SEQ ID NO.19

APARSPSPST QPWEHVNAIQ EARRLLNLSR DTAAEMNETV EVISEMFDLQ EPTCLQTRLE   60

LYKQGLRGSL TKLKGPLTMI ASHYKQHCPP TPETSCATQI ITFESFKENL KDFLLVIPFD   120

CWEPVQE                                                             127