人白细胞白介素－12重组昆虫病毒株及其制备方法

摘要

本发明公开了一种人白细胞白介素－12重组昆虫病毒株及其制备方法,重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒AcNPV－hIL12毒株,CCTCC NO.V200108。重组病毒株插入了人白细胞介素－12表达盒,表达盒包括双启动子序列,人白细胞介素－12的P35亚基DNA编码序列和P40亚基DNA编码序列,P35亚基基因位于Polyhederin下游,P40亚基基因位于P10Promoter下游。本发明能高效表达人白细胞介素－12,该细胞因子对人体安全可靠,适用于肿瘤、细菌、病毒和寄生虫等感染性疾病的治疗。

说明书

                        技术领域

本发明涉及生物技术，更具体涉及人白细胞介素-12重组昆虫病毒株(AcNPV-hIL12)，还涉及一种表达人白细胞介素-12重组昆虫病毒株的制备方法。

                         背景技术

人白细胞介素-12(human lnterlukin12，hIL-12)是人体的重要细胞因子，也称之为自然杀伤细胞刺激因子(NKSF)或细胞毒性淋巴成熟因子(CLMF)。1989年，Kobayashi等首先分离并纯化hIL-12(Kobayashi M，et al.J Exp Med，1989ml70：827-845)。1991年，Gubler和Wolf克隆了hIL-12 cDNA全序列，并在哺乳动物细胞中表达(Gubler U，et al，Proc Nati Acad Sci USA，1991，88：4143-4147；Wolf S F，et al，J Immunol，1991，146：3047-3081)。hIL-12是由不具基因相关性的两个蛋白质亚基P35和P40通过二硫键相连构成一个70KDa的糖蛋白异二聚体。P35亚基有197个氨基酸残基，分子量为31KDa；P40亚基有306个氨基酸残基，分子量为40KDa。P35亚基是传递信息的功能亚单位(Gubler，at al.JBiol Chem，1995，270：11)而P40亚基是hIL-12与细胞受体结合的功能蛋白质(Gillessen S，et al European Journal of Immunology，1995，25：1)。IL-12主要是由抗原提呈细胞产生的一种异二聚体细胞因子，能显著增强NK/LAK细胞的杀伤活性，促进特异性CTL细胞的启答能力，诱导T细胞和NK细胞大量分泌IFN-γ，启动T_H0细胞向T_H1细胞的发育，在抗病毒、抗肿瘤、抗细胞内寄生菌感染、艾滋病等多种疾病中将发挥重要作用。(Lamont AG，et al，lmmunology Today，1996，17：214-217)。

国内外学者(杨林等，微生物学报，2001，41(1)35-41，魏海明等，中华微生物学和免疫学杂志，2000，20(6)584-587，Kazuaki Takehara et al VeterinaryImmunology and Immunopathology，2000，77：15-25)利用昆虫病毒双表达载体共表达白细胞介素12双亚基，或者分别表达P35、P40亚基(沈惠等，生物工程学报，1998，14(4)360-364)。或者利用腺病毒载体的E1和E3缺陷区，分别将P40和P35克隆到E1和E3缺陷区进行表达(章卫平等，中华医学杂志，1998，78(1)33-36；中国专利CN98126748.3，申请日1998年12月13日)，并将能表达hIL-12的病毒应用于治疗。

白细胞介素-12是目前所发现的细胞因子中对体内免疫活性细胞诱导调节作用最强且范围最广的一种细胞因子，参与抗体的抗肿瘤、抗过敏、抗感染过程。目前，美国已将IL-12用于治疗艾滋患者和肿瘤患者，现已进入临床III期。IL-12用于抗利什曼原虫、抗疟原虫，抗结核病、抗血吸虫病也已进入动物实验。1997年，Michael Brunda研究组报道，IL-12对多种肿瘤具有明显作用，包括对肾瘤、黑色素瘤，Colon肿瘤和14种亚性肿瘤。在将IL-12用于治疗小鼠16F16黑瘤的模型中，IL-12注射于患瘤鼠，可抑制肿瘤生长；直接把IL-12注射到肿瘤部位导致肿瘤退化，在长期处理后，肿瘤消退，动物治愈。

虽然研究表明hIL-12有巨大的应用前景，并且具有许多制备hIL-12的方法，但是hIL-12的使用存在量的问题，过量的使用会引起机体的免疫反应，产生毒性作用。因此，采用基因工程的方法获得hIL-12用于临床治疗，适时适量提供病人，优于基因治疗，并且基因治疗中存在着导入的病毒安全性的问题。另外，尽管有学者分别表达P35、P40亚基，但由于hIL-12中的P35、P40亚基经形成二聚体才具有活性。因此，需P35、P40双亚基共表达。国内外学者(魏海明等，中华微生物学和免疫学杂志，2000，20(6)584-587)也有利用AcNPV系统共表达P35和P40双亚基，但P35亚基cDNA是置于P10启动子下端，P40亚基cDNA置于Polyhedrin启动子下游。

                        发明内容

本发明的目的是提供一种能高效表达人白细胞介素-12重组昆虫病毒株，该昆虫病毒株不会形成P40亚基的过量表达形成P40同源二聚体。

本发明的另一个目的是提供一种制备高效表达人白细胞介素12的重组昆虫病毒株的制备方法，用该方法制备的重组昆虫病毒株不会形成P40亚基的过量表达形成P40同源二聚体，能高效表达人白细胞介素-12，并且产生的人白细胞介素-12对人体是安全可靠的。

为了达到上述目的，本发明叙述如下：

本发明所提供的重组苜蓿银纹蛾核型多角体病毒属一株命名为重组AcNPV毒株(AcNPV—hIL12，CCTCC NO：V200108)，一种表达人白细胞介素-12(hIL-12)的重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒株，其特征是，该重组病毒株插入了人白细胞介素-12表达盒，表达盒包括双启动子序列，人白细胞介素-12的P35亚基DNA编码序列和P40亚基DNA编码序列，P35亚基基因位于Polyhedrin启动子下游，P40亚基基因位于P10 promoter启动子下游。

本发明的一种构建重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒株的制备方法，其步骤如下：

a)分加扩增p35亚基DNA片段和p40亚基DNA片段，并分别克隆到pCR^2.1载体中，获得pCR35和pCR40质粒。

b)用Bgl II和Bam HI双酶切pCR40质粒，将P40亚基克隆到经Bgl II酶切的pAcUW51质粒DNA中，获得pAcUW51-P40质粒；

c)用Eag I酶切和T4 DNA多聚酶Kelnow片段平头处理pCR35质粒DNA，并将P35亚基克隆到经Bam HI酶切的pAcUW51-P40质粒中，获得pAcUW51-IL12质粒；

d)pAcUW51-IL12质粒与致死缺陷型线性苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒基因DNA共转染昆虫细胞Sf9细胞系；

e)空斑筛选；

f)PCR鉴定重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒株。

在本发明的一个优选例中，提供了一种构建重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒株的方法，其特征是在于该方法包括：

a)RT-PCR扩增667bp P35亚基片段和1000bp P40亚基片段，将该两片段分别克隆到pCR^2.1载体中，通过转化、筛选、鉴定，获得二种菌株E.coli(pCR35)和E.coli(pCR40)；

b)通过用Bgl II和Bam HI二种酶切pCR40质粒DNA获得1000bp P40亚基片段，将该片段克隆到经Bgl II酶切的pAcUW51质粒DNA中，经转化、筛选、鉴定获得含有重组质粒pAcUW51-P40的E.coli(pAcUW51-P40)；

c)通过用Eag I酶切和T4 DNA多聚酶Klenow片段平头处理pCR35质粒DNA获得P35亚基片段，将该片段克隆到经Bam HI酶切的pAcUW51-P40质粒DNA中，经转化、筛选、鉴定获得含有重组质粒pAcUW-IL12的E.coli(pAcUW51-IL12)；

d)pAcUW51-IL12质粒DNA和致死缺陷型线性苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒基因DNA共转染草地贪夜蛾Sf9细胞；

e)空斑筛选；

f)分离重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒株ANPV-hIL12，CCTCC-V200108。

在本发明中，人白细胞介素12编码序列，包括P35亚基和P40亚基的DNA编码序列。

在本发明中，人白细胞介素12表达盒是指含有IL-12的P35和P40亚基的DNA编码的序列以及表达所需元件的序列组成，包括启动子。

在本发明中，可提供使用的昆虫病毒基因DNA是指昆虫核型多角体病毒基因DNA，优选的是苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒基因DNA，更优选的是致死缺陷型线性苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒基因DNA。

由于IL-12是由P35、P40两个亚基经二硫键组成的异源二聚体，只有正确装配的IL-12才具有生物学活性，而P35、P40单体均不能发挥IL-12的生物学作用，相反P40二聚体还会起拮抗IL-12的作用，因此IL-12双亚基共表达载体更具有应用价值。

应用质粒pAcVW51构建含hIL-12P35亚基和P40亚基共表达载体，如果P40亚基在polyhedrin启动子下游，则在表达过程中，由于Polyhedrin启动子是比P10强的启动子，则P40表达过量，形成P40同源二聚体，并且P40同源二聚体是IL-12的拮抗剂，P40亚基的过量表达抑制有生物活性的IL-12的形成，因此，在本发明中，通过不同的酶切方式，将P40亚基置于P10启动子下游，而P35亚基位于强启动子Polyhedrin下游，构建出P35亚基相对于P40亚基过度表达IL-12双亚基共表达的昆虫病毒株，这样能高效表达IL-12，且表达的IL-12安全可靠。本发明提供的重组AcNPV毒株含有二个启动子，分别为P10和Polyhedrin启动子。在hIL-12表达盒中，P35亚基基因位于Polyhedrin启动子下游；P40亚基基因位于P10启动子下游。这种构建有利于P35和P40形成二聚体，而避免P40过表达形成同源二聚体。利用该重组昆虫病毒能高效表达人白细胞介素-12，纯化的人白组介素-12适用于肿瘤、细菌、病毒和寄生虫等感染性疾病的治疗。

                         附图说明

图1.hIL-12 P35、P40亚基PCR产物鉴定

图2.重组质粒pCR35的构建

图3.pCR35酶切和PCR鉴定

图4.重组质粒pCR40的构建

图5.pCR40酶切和PCR鉴定

图6.hIL-12P35DNA序列

图7.hIL-12P40DNA序列

图8.重组质粒pAcUW51-P40的构建

图9.pAcUW51-P40酶切和PCR鉴定

图10.重组质粒pAcUW51-ILl2的构建

图11.pAcUW51-ILl2酶切和PCR鉴定

图12.重组病毒Ac-hILl2 PCR鉴定

                        具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步详细描述：

实施例①人白细胞介素12的P35亚基cDNA和P40亚基cDNA的克隆和鉴定

收集经PDBu(100nM，Sigma)刺激培养20hKB细胞，收集细胞，采用异硫氰酸胍一步法抽提总RNA，MMLV逆转录酶合成cDNA，以其为模板分别采用下述P35和P40引物PCR扩增P35和P40 DNA片段。P35引物：P1 TTGATCA ATG TGT CCA GCG CGC AGCCT

     P2 AGTGACG AGC TAT CTG AAT GCTTCC TAAP40引物：P3 AGATCT ATG TGT CAC CAG CAGTTG GT

     P4 TGGATCCCTA AC TGCAGGG CAC AGATG

PCR反应总体积50μl。反应条件为：94℃预变性5min，PCR循环参数：94℃ 60秒、58℃ 90秒、72℃ 120秒，循环30次，最后1次循环在72℃延伸7min。经0.8％Agarose电泳检测，得到单一的667bp P35 cDNA片段和1000bp P40cDNA片段。0.8％Agarose凝胶电泳结果见图1。

实施例②重组质粒pCR35和pCR40构建与鉴定

(1)重组质粒pCR35构建与鉴定

将实施例①获得的hIL-12 P35 cDNA片段克隆至pCR^2.1载体中，连接产物转化E.coli DH 5α，经Ampcillin和Kanamycin双抗平板筛选得到阳性转化子。该构建重组质粒命名为pCR35。pCR35质粒构建见图2。重组质粒pCR35经Eag I单酶切，得到0.7kb和3.8kb二条DNA片段。pCR35经Not I单酶切，得到～4.5kb一条DNA片段。另外，用P1、P2引物为引物，以pCR35 DNA为模板，PCR扩增得到0.67kb一条DNA片段。PCR反应总体积50μl，反应条件为：94℃预变性5min，PCR循环参数：94℃ 60秒、58℃ 90秒、72℃120秒，循环30次，最后1次循环在72℃延伸7min。凝胶电泳结果与预期相符，见图3。

(2)重组质粒pCR40构建与鉴定

将实施例①获得hIL-12 P40 cDNA片段克隆至pCR^2.1载体中，连接产物转化E.coli DH 5α，经Ampcillin和Kanamycin双抗平板筛选得到阳性转化子。该构建的重组质粒命名为pCR40。pCR40质粒构建见图4。重组质粒pCR40经Bgl II和Bam HI双酶切，得到1.0kb和3.9kb二条DNA片段。pCR40经Not I单酶切，得到～4.9kb一条DNA片段。另外，以P3、P4为引物，以pCR40 DNA为模板，PCR扩增，得到1.0kb一条DNA片段。PCR反应总体积50μl，反应条件为：94℃预变性5min，PCR循环参数：94℃ 60秒、58℃ 90秒、72℃ 120秒，循环30次，最后1次循环在72℃延伸7min。凝胶电泳结果与预期相符，见图5。

实施例③hIL-12 P35和P40序列测定

将实施例②获得pCR35和pCR40经全自动测序(ABI 373，PE公司)分析，测序结果与报道一致(Wolf，S.F，et al.1991，J.1mmunol.146：3074-3081)， P35、P40DNA序列分别见图6、图7。

实施例④重组质粒pAcUW51-P40的构建与鉴定

用Bgl II和Bam HI双酶切实施例②获得的质粒pCR40 DNA，获得1.0kb和3.9kb DNA片段。用Bgl II单酶切质粒pAcUW51 DNA，获得5.9kb DNA片段。采用0.8％低熔点琼脂糖凝胶电泳，回收1.0kb和5.9kb DNA片段。用T4 DNA连接酶连接，连接产物转化E.coli DH 5α，经Amp平板筛选得到阳性转化子。该构建的重组质粒命名为pAcUW51-P40，见图8。重组质粒pAcUW51-P40经Bgl II单酶切，得到6.86kb一条DNA片段。Bam HI单酶切出现6.86kb一条DNA片段。pAcUW51-P40经Eco RI单酶切，正向连接出现0.26kb和6.61kb二条DNA片段；反向连接出现6.11kb和0.76kb二条DNA片段。另外，P3、P4为引物，以pAcUW51-P40 DNA为模板，PCR扩增  获得1.0kb一条DNA片段。PCR反应总体积50μl，反应条件为：94℃预变性5min，PCR循环参数：94℃ 60秒、58℃ 90秒、72℃ 120秒，循环30次，最后1次循环在72℃延伸7min。凝胶电泳结果见图9。

实施例⑤重组质粒pAcUW51-IL12的构建

用Eag I单酶切并用T4 DNA聚合酶Klenow片段平头处理将实施例②获得质粒pCR35 DNA，获得0.7kb和3.8kb二条DNA片段。用BamHI单酶切并用T4 DNA聚合酶Klenow片段平头处理将实施例④获得质粒pAcUW51-P40DNA，获得6.86kb DNA片段。采用0.8％低熔点琼脂糖凝胶电泳，回收0.7kb P35cDNA片段和6.86kb DNA片段。用T4DNA连接酶连接，连接产物转化E.coliDH5α，经Amp平板筛选得到阳性转化子。该构建的重组质粒命名为pAcUW51-IL12，见图10。重组质粒pAcUW51-IL12经Bgl II单酶切，得到7.59kb DNA片段。pAcUW51-IL12经EcoRI单酶切，正向连接出现0.26kb、1.77kb和5.57kb三条DNA片段；反向连接出现0.26kb、1.18kb和6.16kb三条DNA片段。另外，用P1、P2为引物，以pAcUW51-IL12 DNA为模板，PCR扩增，获得657kjp P33cDNA片段；P3、P4为引物，以pAcUW51-IL12 DNA为模板，PCR扩增，获得1000bp P40 cNDA片段。凝胶电泳结果见图11。

实施例⑥表达hIL-12重组杆状病毒AcNPV-hIL12的构建

将实施例⑤获得pAcUW51-IL12 DNA与BaculoGold^TM Linearized BaculovirusDNA共转染草地贪夜蛾细胞Sf9接种2×10⁶个Sf9细胞于60mm培养皿，在含10％胎牛血清的完全培养基中培养，27℃ 50min。将20μl lipofectin和67.5μl无菌水混合，再加入7.5μl 10ng/μl BaculoGoldTM Linearized Baculovirus DNA和5μl 100ng/μl的pAcUW51-IL12。室温温育15min。弃去培养皿中培养基，用1.5ml不含胎牛血清的完全培养液代替培养皿中的培养液。在培养皿中加入lipofectin-DNA复合物，27℃温育4.5h。移弃上述转染缓冲液，换入新的无血清培养基，27℃培养96h，收获病毒上清。

实施例⑦表达hIL-12重组杆状病毒AcNPV-hIL12的纯化

将从实施例⑥收获的病毒上清用不含胎牛血清的完全培养液稀释，按10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷和10⁸的稀释度感染60mm培养皿(2×10⁶个细胞)，27℃孵育1.5h后移弃上述培养基，加入4ml 0.5％琼脂糖(含0.25mg/ml的X-Gal)，待其凝固后，于27℃孵育5d，观察空斑形成。挑选无色空斑，将其分别收入1ml无血清的完全培养基中。

用无菌吸管挑取一个纯的空斑，将琼脂块移入100μl无血清培养液的EP管中，接种一含2.5×10⁶ Sf9细胞和5ml含10％胎牛血清完全培养液的25cm²培养瓶中，27℃温育5天直到细胞被感染。确定病毒滴度为7×10⁷pfu/ml，将1ml该毒种贮液于冻存管中，-80℃保存。该重组杆状病毒命名为AcNPV-hIL-12，并于2001年9月14日送交武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC-V200108。

实施例⑧表达hIL-12重组杆状病毒AcNPV-hIL12的鉴定

按照《精编分子生物学实验指南》(F·奥斯伯等，1998，科学出版社，670-671)中所述方法提取实施例⑦所收获的重组杆状病毒DNA。以每瓶1.8×10⁷细胞的密度接种Sf9细胞于150cm²培养瓶中。27℃温育2h，以0.1的感染复数用重组杆状病毒Ac-hIL12感染，4-5天后收集上清，4℃100,000g离心30min，获得病毒沉淀。用抽提缓冲液(100mmol/L Tris，pH7.5，90mmol/LEDTA，200mmol/LKCl)悬浮，加入45μg/ml蛋白酶K，50℃保温2h，加入1％N-十二烷基肌氨酸钠，50℃温育2h，用等体积的25∶24∶1的份∶氯仿∶异戊的抽提DNA2次。沉淀DNA，用1×TE缓冲液(10mmol/L Tris Cl，1mM EDTA，pH7.4)重悬DNA。加入1/10体积3.0mol/L乙酸钠和2倍体积100％乙醇重新沉淀DNA。用1×TE缓冲液重悬DNA，保存于4℃。

以重组杆状病毒DNA为模板，分别采用P1、P2和P3、P4二对引物，PCR方法扩增P35和P40亚基cDNA片段。PCR反应总体积50μl，反应条件为：94℃预变性5min，PCR循环参数：94℃60秒、58℃ 90秒、72℃ 120秒，循环30次，最后1次循环在72℃延伸7min。分别得到0.67kb和1.0kb DNA片段。凝胶电泳结果与预期相符，见图12。