法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2016-11-23
专利权有效期届满 IPC(主分类):C12N7/01 授权公告日:20030820 申请日:19961022
专利权的终止
2003-08-20
授权
授权
1999-02-17
实质审查请求的生效
实质审查请求的生效
1999-02-03
公开
公开
本发明涉及一种用于基因治疗的病毒载体。本发明更加特别地涉及一种负链RNA病毒载体。
对于用于人类和动物的基因治疗说来，疗效和安全性是非常重要的因素。尤其是，在存在有不容否认的可能性时，如基因可能被插到染色体DNA的非特异位点、重组病毒和致病病毒可能被释放入自然环境以及不能控制转染到细胞中的基因的表达水平等，尽管其疗效被公认，通过使用由病毒基因重组获得的“病毒载体”而进行的治疗还是必须十分小心地进行。
近来，进行了大量的使用重组病毒的基因治疗并且提出了很多基因治疗的临床方案。这些重组病毒载体的特征主要取决于衍生出所述载体的病毒的那些特征。
病毒载体的基本本质是一种通过利用病毒的感染性将目的基因转移到靶细胞的方法。本说明书中的“感染性”是指“病毒通过其维持对细胞的附着和融合到膜的能力而将其核酸等转移到细胞的能力”。与遗传操作以插入目的基因的重组病毒载体的表面相结合的是核壳和包膜蛋白等，其来自于病毒并使重组病毒具有感染性。这些蛋白使得能够将包装的重组基因转移到细胞中。这些重组病毒载体不仅可用于基因治疗的目的，而且可用于生产表达目的基因的细胞以及转基因动物的目的。
病毒载体被分为三类，包括逆转录载体、DNA病毒载体以及RNA病毒载体。
近日来，在基因治疗中使用得最频繁的载体是源自逆转录病毒的逆转录载体。逆转录病毒通过以下过程复制。首先，病毒感染一旦建立其通过利用其自身的逆转录酶作为至少部分的催化剂和其自身的RNA作模板产生互补的DNA(cDNA)。几个步骤之后，所述cDNA被掺入至宿主染色体DNA中，成为前病毒。通过源自宿主的依赖于DNA的RNA聚合酶转录前病毒，产生病毒RNA，其被由其自身的基因编码的基因产物包装成病毒颗粒。
一般，用于基因治疗等的逆转录病毒载体能将过程进行至前病毒的产生。但是，其为丧失其包装所需的基因的缺损病毒以致于其不由前病毒形成病毒颗粒。逆转录病毒例如鼠白血病病毒、猪白血病病毒、baboon丙型肿瘤病毒、人免疫缺损病毒、成人T细胞白血病病毒等。此外，迄今报导的重组逆转录载体包括源自鼠白血病病毒[参见“病毒学”(Virology)，65，1202(1991)，“生物技术”(Biotechniques)，9，980(1989)，“核酸研究”(NucleicAcids Research)，18，3587(1990)，“分子和细胞生物学”(Molecular and CellularBiology)，7，887(1987)，“美国国家科学院院刊”(Proceedings of NationalAcademy of Sciences of United States of America)，90，3539(1993)，“美国国家科学院院刊”，86，3519(1989)，等]以及那些源自人免疫缺损病毒的那些载体[参见“临床研究杂志”(Journal of Clinical Investigation)，88，1043，(1991)]等。
产生逆转录病毒目的在于有效地将一个特异的DNA整合到染色体DNA中。但是，由于不能预料目的基因的插入位置，存在着不容否认的可能性，如损伤正常基因、激活致癌基因以及由于插入灭活过量或抑制表达目的基因。为解决这些问题，已研制出了利用可用作染色体外基因的DNA病毒载体的瞬时表达系统。
DNA病毒载体源于DNA病毒，病毒颗粒中有作为遗传信息的DNA。所述DNA的复制是通过以利用源于宿主的依赖于DNA的DNA复制酶作为至少一部分催化剂以自身作模板的产生互补DNA链的过程的重复来进行的。实际的利用腺病毒载体(一种可用作染色体外基因的DNA病毒载体)的基因治疗可以“自然遗传学”[(Nature Genetics)，3，1-2(1993)]中的文章为例。但是，由于在DNA病毒载体的情况下，产生不合乎需要的与核中染色体DNA的重组也是非常可能的，其作为基因治疗载体应非常小心地应用。
近来，已研究出基于RNA病毒的RNA病毒载体来作为可能比上述DNA病毒载体更为安全的载体。通过重复用于以其自身RNA作模板用其自身的依赖于RNA的RNA复制酶作催化剂产生互补链的过程来复制RNA病毒。
正链RNA病毒的基因组RNA具有作为信使RNA(下文简称为mRNA)的双重功能，依赖于宿主细胞的转译功能产生复制和病毒颗粒形成所需的蛋白。换句话说，正链RNA病毒的基因组RNA本身具有传播(disseminative)能力。本说明书中“传播能力”指“形成感染的颗粒或其相当的复合体并在通过感染或人工技术将核酸转移至宿主细胞中后将它们传播到其他细胞以及所述核酸的胞内复制的能力”。归于正链RNA病毒的新培斯病毒和归于负链RNA病毒的仙台病毒均有感染性和传播能力。归于Parboviruses的腺-卫星病毒有感染性但无传播性(形成病毒颗粒需要与腺病毒混合感染)。而且，源于体外人工转录的新培斯病毒的正链RNA是无传播性的(在转染到细胞中时形成感染的病毒颗粒)，但体外人工转录的仙台病毒的正和负RNA链均不是传播性的(在转染到细胞中时不产生感染的病毒颗粒)。
鉴于基因组RNA同时起着mRNA的作用的优点，以前是研制源于正链RNA病毒的RNA病毒载体[参见“生物技术”(Bio/Technology)，11，916-920(1993)，“核酸研究”(Nucleic Acids Research)，23，1495-1501(1995)，“人类基因治疗”(Human Gene Therapy)，6，1161-1167(1995)，“细胞生物学方法”(Methods in Cell Biology)，43，43-53(1994)，“细胞生物学方法”，43，55-78(1994)]。例如，源自Semliki forest virus(SFV)和新培斯病毒的RNA病毒载体主要是RNA结构，其中缺损与病毒结构有关的结构基因区域，并保留了编码病毒转录和复制所需的蛋白的一组基因和连接到转录启动子下游的目的外源基因。通过显微注射直接将可转录所述RNA的这些重组RNA或cDNA转染至细胞中[“核酸研究”(Nucleic Acids Reseurch)，23，1495-1501(1995)]使得能够自主复制含外源基因的RNA载体，转录插入到转录启动子下游的外源基因，结果导致细胞中由外源基因表达目的产物。而且，本发明在通过用于表达病毒结构基因的cDNA单元(辅助病毒)和用于在包装细胞中表达所述RNA载体的共存建立起感染的但无传播性的复合体的方面获得了成功。但是，源于辅助病毒的RNA和载体RNA之间的重组常常发生在包装中，导致了感染颗粒的出现。随后，阐明了存在于作为正链RNA病毒的特征的二十四面体外壳中的突起蛋白催化这一重组。因而，曾试图以在突起蛋白中导入变异来解决这些问题[“生物技术”，11，916-920(1993)]。
预计正链RNA病毒载体可用作具自主复制能力的RNA载体，但其用作基因治疗载体会引起以下问题。
1.由于其为二十四面体结构，允许插入的外源基因的大小被限制到至多有3,700个核苷酸。
2.直到核酸由包装复合体释放至细胞中并且被复制，需要多至5个过程，包括细胞粘着、胞吞、膜融合、去衣壳化以及复制酶的转译。
3.不能否认在包装中可能形成即使是少量的传播性的病毒颗粒。尤其是，即使用减毒的病毒颗粒，其内部的RNA本身有传播能力并可能扩增被延迟，使难以检测它们。
4.由于这些载体源于通过诸如蚊子的昆虫传播到动物的病毒，在被转染这些载体基因的动物和人类被用野生型病毒混合感染时，就可能形成有传播性的重组体，还可能产生所述重组体被通过昆虫传播到自然环境中的危险。
设想到如果构建源于负链RNA病毒的RNA病毒载体，上述这些难题会基本解决。即，由于负链RNA病毒不具有二十四面体结构的衣壳，并且也由于了解到颗粒的包膜大小根据内部的RNA含量而变化，推测其在用作RNA病毒载体时更少被待插入的外源基因的大小限制。而且由于一组转录和复制所需的蛋白被包装到颗粒中，直至核酸被从包装的复合体释放并被复制，只需两个步骤，包括细胞粘着和膜融合。另外，单独的病毒RNA本身是无传播性的，且传播性的颗粒能容易地被鉴定，因为其极易与细胞膜融合并在细胞中增殖。因此，可容易地检测到有传播性的颗粒的存在。除此之外，负链RNA病毒还不会被昆虫传播。
虽然可用作工业用病毒载体来源的负链RNA病毒有许多优点，直至现在还未能获得任何能用于基因治疗的负链RNA载体。这可能是由于在通过病毒cDNA重建病毒方面有相当大的难度。由于插入外源基因到载体中需DNA水平的基因操作，就不从携带插入的外源基因的病毒cDNA重建病毒颗粒而言，难以用负链RNA病毒作为载体。“病毒颗粒的重建”指在体外或胞内由人工制备的病毒基因组核酸建成原病毒或重组病毒。
如上述，已清楚地说明即便是将负链RNA病毒(vRNA；病毒RNA)或仅将其互补链RNA(cRNA，互补RNA)转染到细胞中，也不能产生任何负链RNA病毒。从正链RNA病毒的情况看来，这是一个明显不同的要点。虽然在Tokkai H4-211377中，描述了“用于制备相应于负链RNA病毒基因组的cDNA和感染的负链RNA病毒的方法”，后来证明描述于“欧洲分子生物学联合地杂志”，9，379-384(1990)中的所述文件的全部实验不能重现，因而作者本人不得不收回所有的文章内容[参考“欧洲分子生物学联合会杂志”，10，3558(1991)]。因此，显然于Tokkai H4-211377中描述的技术与本发明的有关领域不一致。
关于用于负链RNA病毒的重建体系，就流感病毒有所报导[微生物学年评”(Annu.Rev.Microbiol.)，47，765-790(1993)；“当今遗传学和发育学观点”(Curr.Opin.Genet.Dev.)，2，77-81(1992)]。流感病毒是分8个节段的负链RNA病毒。根据这些文献，首先将外源基因插入到与一个所述节段相应的cDNA中，并把由与包括插入所述外源基因的所有八个节段相应的cDNA转录的RNA与源于病毒的NP蛋白装配成一个RNP。然后，通过向细胞提供这些RNP和依赖于RNA的RNA聚合酶建立起病毒重建体系。此外，关于负的单链RNA病毒，报导过用于弹状病毒的狂犬病毒由cDNA重建病毒[“病毒学杂志”，68，713-719(1994)]。
但是，由于以下问题，一直难于以类似的这些病毒重建技术来构建用于基因治疗的载体。
1.只通过标记基因表达、RT-PCR等鉴定重建的病毒。还未建立起能用于以令人满意的产率产生载体病毒的重建系统。
2.与正链RNA病毒的情况不同，为形成有感染性但缺乏如用于基因治疗的载体的传播能力的复合体，必需在复合体中包装初转录和复制所需的因子。还未建立起大规模扩增这些复合体的技术。
3.为了在胞内提供病毒重建所需的因子，将导入cDNA的细胞用诸如野生型病毒和重组痘苗病毒等的辅助病毒混合感染。不容易分离这些加入的天然型病毒。
此外，由于一个通常与RNA病毒相关的问题，如果情况是大量复制和转录RNA对治疗的人类和动物产生不希望有的效果，可能首先必须提供对宿主复制和转录无影响的用于RNA病毒载体复制的抑制剂。但是，还未研制出任何这样的抑制剂。
本发明要解决的问题是研制用于实际用途的负链RNA病毒载体、用于有效制备所述载体的方法以及用于所述载体复制的抑制剂。
本发明首先试图由所述为典型负链RNA病毒的仙台病毒的核酸重建仙台病毒，并设想从安全性和方便的角度看来，其作为载体在工业上是最有用的。首先，为用于重建实验，用源自仙台病毒DI(缺损干扰)颗粒[参见“欧洲分子生物学联合会杂志”，10，3079-3085(1991)]的cDNA或仙台病毒小基因组的cDNA作为实验材料进行了各种实验。结果，本发明人发现了有关待转移到宿主细胞的物质间的重量比例的有效条件，这些物质包括cDNA、关于转录和复制的cDNA以及提供用于表达T7RNA聚合酶的单元的重组痘苗病毒。此外，本发明人获得了与正链和负链相应的全长cDNA，构建了用于诱导仙台病毒的正链和负链RNA的胞外生物合成的质粒，并将所述质粒转移到其中表达有关转录和复制的cDNA的宿主细胞中。结果，他们首次成功地由源自仙台病毒颗粒的cDNA重建了仙台病毒。
另外，本发明人发现可以不用作为T7-RNA聚合酶表达单元的重组痘苗病毒来重建仙台病毒。即，在将体外转录的仙台病毒的全长RNA转移到细胞中，且在T7启动子的控制下转录编码用于初转录和复制的酶的cDNA时，重建病毒颗粒。这表明，如果构建了表达初转录和复制所需的所有酶的细胞，可以完全不用诸如痘苗病毒的辅助病毒建成重组仙台病毒并最终建成上述复合体。由于对表达初转录和复制所需的所有酶类的细胞已经描述[“病毒学杂志”，68，8413-8417(1994)]，本领域的那些熟练技术人员可以参考到所述文章建成这样的细胞。所述参考中所述细胞是染色体上携带仙台病毒的三种基因，即NP，P/C和L，表达由这三种基因编码的蛋白NP，P/C和L的293细胞系的衍生型。
由多例病毒载体看来，如果可从核酸有效重建病毒颗粒，显然本领域中的那些熟练技术人员能够轻易地替换目的病毒基因，插入外源基因，或者灭活或缺失目的基因。例如，一篇关于DI颗粒的用途的文章[“病毒学杂志”，68，8413-8417(1994)]清楚地表明，在将至少缺损一部分仙台病毒结构基因但其关于复制酶的基因正常的RNA转移至细胞中时，如果细胞中提供初转录和复制所需的酶类，随后的自主复制可能是能够进行的，因而，一旦含有外源基因且由“缺损至少一部分结构基因但有关复制酶类的基因正常的特异的病毒cDNA”转录的RNA能被包装到含初转录和复制酶的病毒结构中，就能建成感染性的并且自主复制的但缺损传播能力并且起着外源基因载体功能的复合体。这样的复合体作为基因治疗的载体是非常有用的。即，在本发明中，以负链RNA病毒制备感染的以及自主复制的但传播能力缺损的复合体(如含有初转录和复制酶的复合体)就成为了可能。
本发明还研究出一种用于通过用所述复合体转染表达与复合体RNA中的已被缺失或灭活的基因相应的结构蛋白的细胞来扩增同样复合体的方法。考虑到禽卵是用于增殖仙台病毒以便扩增所述复合体的最合适的培养基，本发明人还发现染色体上携带仙台病毒M，F和HN基因中的至少一个或多个基因的转基因禽，其卵和细胞适于用于扩增复合体。用于制备转基因禽的方法已经报导[“家禽科学”(Poultry Sci.)，65，1445-1448(1986)]；“生物技术”，12，60-63(1994)]，本领域的那些熟练技术人员可以适当地生产在其染色体上携带M、F和HN基因中至少一个或多个基因的转基因鸟类。由M、F和NH基因中涉及复合体中所含RNA的传播能力缺损的基因编码的蛋白优选在转基因鸟类中表达。
本发明还研究出了一种用于制备上述复合体的方法。下文中，举例说明了与仙台病毒有关的情况。仙台病毒Z的基因组是含15384个核苷酸的单链RNA[“病毒学”，108，318-324(1981)]。其全部碱基序列已由通过使用逆转录酶制备的cDNA克隆测得。[“核酸研究”，11，7313-7330(1983)；核酸研究”，12，7965-7972(1984)；“核酸研究”，14，1545-1563(1986)]。由于其基因组RNA是负链，病毒颗粒中一类用于转录和复制的酶以基因组RNA作模板，既进行转录又进行复制。已了解到包括NP，P/C，M，F，HN和L在内的至少6种蛋白是由基因组RNA编码的蛋白。已经阐明，这些蛋白中，NP、P/C和L对于复制是必需的且是足够的[“病毒学杂志”，68，8413-8417(1994)]，且M，F和HN是构建病毒结构所必需的成份。基于这些事实，当衍生出RNA的特异RNA病毒是仙台病毒时，可能通过在体外将1)可转录成DNA的cDNA和2)编码在细胞中转录所述cDNA所需的RNA聚合酶的基因或由所述cDNA转录的RNA分子本身转染到细胞中来重建感染的复合体，其中在该细胞中表达所有用于自主复制的所有基因，NP、P/C和L，以及关于RNA传播的缺损的M、F和HN基因中的一组基因。在这一情况下，所有关于自主复制的基因，NP、P/C和L以及关于RNA的传播能力缺损的M、F和NH基因中的基因可通过用编码各基因的质粒转染细胞来瞬时表达。但是，优选将至少涉及RNA的传播能力缺损的基因掺入染色体以便其被稳定地表达。
本发明还研究出了一种用于大量生产这样重建的所述复合体的方法，其中，通过转染到不具有涉及自主复制的基因但表达涉及RNA传播能力缺损的M、F和HN基因中的基因来复制所述复合体。在这一情况下，作为不具有涉及自主复制基因但表达涉及RNA传播能力缺损的M、F和NH基因中基因的细胞，优选将表达该类基因的转基因禽卵用于大量生产复合体。
本发明者还生产了用于繁殖含所述RNA和蛋白质的复合体的细胞。更为特别的是，该细胞是那些带有与涉及由所述复合体保留的RNA的感染颗粒形成能力缺损的一类基因相应的基因，并且能够在胞内产生由所述基因编码的蛋白。在衍生出RNA的特异RNA病毒是仙台病毒的情况下，使用了在其染色体上具有M、F和HN基因中的至少一个以上基因的细胞或具有这样的细胞的动物。另外，M、F和HN基因不必是野生型的。任何那些具有与野生型的等功能的基因将是可利用的。即，在功能地导入细胞中时，只要所述基因与关于缺损病毒的野生型有互补性时，则任何基因都可以使用。优选的待用细胞是仙台病毒的宿主细胞。优选地，由与载体病毒RNA中的M、F和HN基因中的那些涉及感染颗粒形成能力缺损的基因相应的基因编码的蛋白是在胞内产生。
迄今仅仅还强调用常规RNA病毒载体来增强表达效力，还未作出任何努力来研制出化合物以抑制RNA复制从而防止由于过量表达而导致的不利结果。在这一方面，本发明人研制出了一种用于负链病毒载体的抑制剂，其特异地抑制依赖于RNA的RNA复制和依赖于RNA的RNA转录，而不影响源于细胞的RNA的转录和转译，只引起对依赖于RNA的RNA复制。
这就是说，本发明包括以下内容：
1.一种复合体，其含有一种源自特异的传播性的负链RNA病毒的RNA分子和不含核酸的病毒结构成份，其具有感染性和自主RNA复制能力，但缺损传播能力。
2.描述1的复合体，其中所述特异RNA病毒是一种具不分节段基因组的负链RNA病毒。
3.描述2的复合体，其中所述特异RNA病毒是仙台病毒。
4.一种RNA分子，其含有仙台病毒RNA或仙台病毒cRNA，其中所述RNA分子是缺损的，至少一个以上编码M、F和HN蛋白的基因缺失或被灭活。
5.一种复合体，含有描述4的RNA和不含任何源自仙台病毒的核酸的病毒结构成分，其具有感染性和自主RNA复制能力，但缺乏传播能力。
6.一种DNA分子，其含有可在体外或胞外能转录成描述4的RNA分子的模板DNA。
7.描述1-3或5中任一项的复合体，其中所述复合体中所含RNA分子含有外源基因。
8.描述3或5的复合体，其中所述复合体中所含RNA分子含有外源基因。
9.描述4的RNA分子，其含有外源基因。
10.描述6的DNA分子，其含有一个外源基因。
11.一种用于描述1-3、5、7或8的中任一项的复合体中所含的RNA复制的抑制剂，其含有用于依赖于RNA的RNA复制的抑制药物。
12.一种能向其中传播描述1-3，5，7或8中任一项的复合体的宿主。
13.描述12的宿主，其染色体含有一组涉及描述1-3，5，7或8中任一项的复合体的感染性的基因，并能在用其感染时能复制相同拷贝的所述复合体。
14.描述12或13的宿主，其中所述宿主是动物，或其细胞，组织或卵。
15.描述14的宿主，其中所述动物是哺乳动物。
16.描述14的宿主，其中所述动物是禽。
17.一种宿主，其染色体上含有一组涉及描述3，5或8中任一项的复合体的感染性的基因，并且在用其感染时能复制相同拷贝的所述复合体。
18.一种宿主，其染色体上含有仙台病毒的M、F和HN基因或具有与其同功能的基因中的至少一种基因。
19.一种宿主，其染色体上含有仙台病毒的M基因或其同功能基因。
20.一种宿主，其染色体上含有仙台病毒的M，NP，P/C和L基因(其中每种基因可分别被其同功能的基因取)。
21.一种宿主，其染色体上含有仙台病毒的M、F和HN基因(其中每种基因均可分别为其同功能的基因取代)。
22.一种宿主，其染色体上含有仙台病毒的M，F，HN，NP，P/C和L基因(其中每种基因均可分别为其同功能的基因取代)。
23.描述17-22中任一项的宿主，其中所述宿主是动物或其细胞、组织或卵。
24.描述23的宿主，其中所述动物是哺乳动物。
25.描述23的宿主，其中所述动物是禽类。
26.一种试剂盒，其由以下三种成份组成：
a.描述1-3，5，7或8中任一项的复合体中所含的RNA分子，或所述RNA的cRNA，或一种能生物合成所述RNA或所述cRNA的单元，
b.一组复制所述RNA或所述cRNA所需的酶，或能生物合成所述酶类的单元，以及
c.一组涉及所述复合体的感染性的蛋白或一种用于生物合成所述蛋白类的单元。
27.一种试剂盒，其由以下三种成份组成：
a.描述1-3，5，7或8中任一项的复合体中所含的RNA分子，或所述RNA的cRNA，或一种能生物合成所述RNA或所述cRNA的单元，
b.一组复制所述RNA或所述cRNA所需的酶，或一种能生物合成所述酶类的单元，以及
c.描述12-25中任一项的宿主。
28.一种试剂盒，其由以下两种成份组成：
a.描述1-3，5，7或8中任一项的复合体，以及
b.描述12-25中任一项的宿主。
29.一种试剂盒，其由以下三种成份组成：
a.描述3，5或8中任一项的复合体中所含的RNA分子，或所述RNA的cRNA，或一种能生物合成的单元，
b.仙台病毒的全部NP，P/C和L蛋白，或一种用于生物合成所述蛋白组的单元，以及
c.一组涉及所述复合体的感染性的蛋白，或一种用于生物合成所述蛋白组的单元。
30.一种试剂盒，其由下列三种成份组成：
a.描述3，5或8中任一项的复合体中所含的RNA分子，所述RNA的cRNA或能生物合成所述RNA或所述cRNA的单元，
b.仙台病毒的全部的NP，P/C和L蛋白，或能生物合成所述蛋白组的单元，以及
c.描述17-25中任一项的宿主。
31.一种试剂盒，其含有下列两种成份：
a.描述3，5或8中任一项的复合体，以及
b.描述17-25中任一项的宿主。
32.一种用于生产描述述1-3，5，7或8中任一项的复合体的方法，其是通过将描述26a，26b和26c的三种成份导入宿主。
33.一种用于生产描述1-3，5，7或8中任一项的复合体的方法，其是通过将描述27a和27b的二种成份都导入描述27c的宿主。
34.一种用于扩增和生产描述28a的复合体的方法，其是通过将所述复合体转染到描述28b的宿主中。
35.一种用于生产描述3，5或8中任一项的复合体的方法，其是通过将描述29a，29b和29c的三种成份导入宿主。
36.一种用于生产描述3，5或8中任一项的复合体的方法，其是通过将描述30a和30b的两种成份都导入描述30c的宿主。
37.一种用于扩增和生产描述31a的复合体的方法，其是通过将所述复合体转染到描述31b的细胞中。
38.描述9的RNA分子，其中与M基因相应的基因缺失或被灭活。
39.描述9的RNA分子，其中与M、F和HN基因相应的所有基因均缺失或被灭活。
40.一种试剂盒，其由以下三种成份组成：
a.描述38的RNA分子，
b.描述20的宿主，以及
c.描述19的宿主。
41.一种用于生产复合体的方法，其是通过将描述40a的RNA分子导入描述40b的宿主并通过将其转染到描述40c的宿主中来扩增和生产所述复合体。
42.一种复合体，其是通过描述41的方法来生产的。
43.一种试剂盒，其由以下三种成份组成：
a.描述39的RNA分子，
b.描述22的宿主，以及
c.描述21的宿主。
44.一种用于生产复合体的方法，其是通过将描述43a的RNA分子导入描述43b的宿主并通过将其导入描述43c的宿主来扩增和生产该复合体。
45.一种复合体，其是通过描述44的方法来生产的。
46.一种抑制剂，其用于描述42或45的复合体中所含的RNA复制，其含有依赖于RNA的RNA复制的抑制药物。
47.一种用于制备外源蛋白的方法，其中所述方法包括将描述7的复合体导入宿主的步骤以及回收所表达的外源基因的步骤。
48.一种用于生产描述47的外源基因的方法，其中宿主是一种表达那些涉及传播能力的在描述7的复合体中所含的RNA分子中缺失的一组基因的细胞。
49.一种含有表达的外源基因的培养基或绒毛膜尿囊液，其中所述培养基或绒毛膜尿囊液是通过将描述7的复合体接种到宿主中并回收它而获得的。
可用任何有传播能力的负链RNA病毒作为本发明的材料。虽然通常也可将诸如缺损干扰颗粒(DI颗粒)和合成的寡核苷酸的不完全病毒用作部分材料，但它们必须具有与具传播能力的病毒的相当的碱基序列。本发明的负链RNA病毒包括，例如，仙台病毒、新城疫病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒，副粘病毒科的牛rinderpest病毒和canine dirstemper病毒，正粘病毒科的流感病毒，弹状病毒科的水泡性口炎病毒和狂犬病毒。
与负链病毒材料一样，源于上述任何病毒的并保留了传播能力的重组负链病毒也可被使用。例如，重组负链病毒可以是带有灭活的免疫原性基因或被改变以增强RNA转录和复制的效率的基因的部分区域。
本发明的RNA-蛋白复合体中所含的RNA可以通过在体外或胞外转录源于上述任何病毒或重组病毒的修饰的cDNA而获得。在这样获得的RNA中，至少一种涉及原病毒的传播能力的基因必须被缺失或灭活，但涉及自主复制的基因应该不被缺失或灭活。此外，也可使用通过体外或胞外转录获得的带有人工序列的RNA分子、将自主复制基因插入到带有诸如DI分子的病毒基因组的两个末端结构而形成的DNA。
如上述，在仙台病毒的情况下，“涉及自主复制的基因”指NP，P/C和L基因中的任何一个，且“涉及传播能力的基因”指M、F和HN基因中的任何一个。因而，例如，仅缺损M基因的仙台病毒Z毒株的RNA分子适合作为本发明的“复合体”中所含的成份。优选也将带有全部的M、F和HN基因缺失或灭活的RNA分子作为本发明的“复合体”中所含的成份。另一方面，必需从RNA表达编码NP，P/C和L蛋白的基因。但是，这些基因的序列不必和病毒的相同，并且可以通过导入变异或由源于其它病毒的相应基因替代而被修饰，只要得到的RNA的转录和复制活性与天然RNA的相同或比之更高。
本发明的“无核酸的病毒结构成份”包括，例如，仅除去RNA的病毒。在早期补充感染性和自主复制能力但不补充传播能力的成份被用作这样的结构成份。在仙台病毒的情况下，含仅带有缺失的M基因的复合体和只去除其RNA的仙台病毒具有感染性和自主复制力，但无传播能力。复合体可含有其它成份，只要其不提供传播能力就行。例如，复合体可以在其包膜表面含有有利于粘附到特异细胞的粘附分子、配体、受体等。
复合体中所含的RNA分子可在其合适位点具有插入的外源基因。为表达目的基因，插入编码所述蛋白外源基因。在仙台病毒RNA的情况下，优选将将一段数目为6倍的碱基的序列插入到序列R1(5′-AGGGTCAAAGT-3′)和R2(5′-GTAAGAAAAA-3′)之间[“病毒学杂志”，67卷，8(1993)，4822-4830页]。插入到RNA中的外源基因的表达水平可借助基因插入位点以及外源基因的侧翼碱基序列来调节。例如，在仙台病毒RNA的情况下，已了解到插入基因的表达水平随着所述基因距离NP基因的距离的减小而增加。优选的用于导入表达目的蛋白的复合体的宿主细胞是表达所述复合体所含RNA分子中缺失基因的那些。由此，最优选以表达所述基因的转基因禽卵来大量制备蛋白。例如，在宿主细胞为培养细胞时从培养基而在宿主细胞为鸡卵时从绒毛膜尿囊液以标准技术回收这样表达的蛋白。在实施例5和6中用一种传播性复合体来替代本发明的非传播性复合体。但是，本领域的那些熟练技术人员会明了在用“表达复合体中所含RNA分子中有关传播能力的基因中缺失的基因的细胞”作宿主时，用本发明的复合体获得的结果与用那些实施例中以传播性复合体获得的结果相似。
另外，本发明者已证实，为有效重建仙台病毒颗粒，待导入细胞的cDNA优选是环形的而不是线形的，并且为以高效形成病毒颗粒，正链RNA的转录优于细胞中负链RNA的转录。虽然这些条件可不必是能应用到所有其他负链RNA病毒的重建，但是可以依据本发明的公开和常规技术研究用于重建其他负链RNA病毒的合适条件。这表明可能建立生产目的负链病毒载体的基本物质的技术，即病毒重建系统。
如本发明的“RNA复制抑制剂”，可以应用任何抑制依赖于RNA的RNA复制的药物，例如，优选使用狂犬病毒，TJ13025等。这样的复制抑制剂是有效的，例如，在注意到随着重组RNA的细胞扩增健康恶化或在需要控制源于重组RNA的外源基因的胞内表达时。
作为本发明的一个实施方案，由缺失仙台病毒的M基因的cDNA重建本发明的复合体的过程(步骤A-B)和扩增所述复合体的那些过程(步骤B-C)示于图1。
附图的简要描述
图1是由缺失仙台病毒的M基因的cDNA产生本发明的复合体的过程(步骤A→B)和进一步扩增所述复合体的过程(步骤B→C)的图示。
图2是构建PUC18/T7(+)HVJRz.DNA的图示。
图3是构建PUC18/T7(-)HVJRz.DNA的图示。
图4是表示将SeVgp120感染至CV-1细胞中以后的时间和HAU及gp/120表达水平的关系的图。
在下文中，将参考到实施例，但不限于它们，对简要描述本发明
实施例1
仙台病毒转录单元PUC18/T7(-)HVJRz.DNA和PUC18/T7(+)HVJRz.DNA的制备
通过顺序将含T7RNA聚合酶启动子的DNA分子、设计成待被转录成负链RNA的仙台病毒cDNA和核酶基因插入到PUC18载体来构建质粒PUC18/T7(-)HVJRz.DNA。还通过顺序将含T7RNA聚合酶启动子的DNA分子、设计成待被转录成正链RNA的仙台病毒cDNA和核酶基因插入到PUC18载体来构建质粒PUC18/T7(+)HVJRz.DNA。PUC18/T7(-)HVJRz.DNA和PUC18/T7(+)HVJRz.DNA的构建分别示于图1和图2中。
实施例2
由cDNA重建仙台病毒的实验
将以常规方式胰蛋白酶消化的LLC-MKZ细胞(2×106)置于直径60mm的塑料平皿中，并在37℃下于5％CO2环境中将其于MEM培养基(补充10％PBS的MEM)(2ml)培养24小时。除去培养基并用PBS(1ml)洗涤后，以感染复数(moi)2向细胞中加入表达T7聚合酶的重组痘苗病毒vTF7-3于PBS(0.1ml)的悬液。每15分钟轻搅拌该平皿以充分分散病毒溶液以感染1小时。除去病毒溶液并用PBS(1ml)洗涤后，向平皿加入如下制备的含cDNA的培养基。
把表1和2中所示的核酸(含表达仙台病毒、pGEM-L、pG EM-P/C和pGEM-NP复制所需的因子的质粒)置于一枚1.5ml的样品管中，并用HBS(Hepes缓冲盐液；20mM Hepes pH7.4，含150mM Nacl)调节至总体积为0.1ml)。这些表中，(-)和(+)cDNA分别代表质粒PUC18/T7(-)HVJRz.DNA和PUC18/T7(+)HVJRz.DNA，/C和/L分别表示在用限制酶MLuI处理后以环形和线形导入细胞。
另一方面，向一枚聚苯乙烯管中置入HBS(0.87ml)，DOTAP(BoehringerMannheim)(0.03ml)。向该管中加入上述核酸溶液，并象这样将该混合液静置10分钟。然后向该混合物加入上述细胞培养基(2ml，加入10％FBS的MEM)，然后加入痘苗病毒抑制剂，利福平和阿糖胞苷C(C/Ara/C)至终浓度分别为0.1mg/mL和0.04mg/mL，结果制备成含上述cDNA的培养基。
将上述平皿于37℃下在5％CO2环境中培养40小时。平皿中的细胞用一橡皮刮棒收获，转移至Eppendorf管中，以6,000rpm离心5分钟沉淀并重悬于PBS(1ml)中。象这样的或稀释后的该细胞悬液的等份接种到10天龄的发育着的受孕鸡卵中。即，该细胞悬液用PBS稀释至表1中所示的细胞数目，以其0.5mL的等份接种的卵于35℃下培养72小时，然后于4℃下过夜。用带有针管的注射器从这些卵中回收绒毛膜尿囊液成病毒溶液。
如下测回收的病毒溶液的血凝素单位(HAU)和噬斑形成单位(PFU)。
如下测HAU。于400×g将鸡血离心10分钟，弃去上清液。将这样获得的沉淀悬浮于100体积的PBS中，并于400×g离心10分钟以弃去上清液。将这一过程重复2次以制备0.1％的血细胞溶液。制备病毒溶液的2倍系列稀释液，将待测的每一稀释液的0.05mL分加到96-孔微孔板的每一孔中。再将血细胞溶液(各0.05mL)加至每孔中，轻摇以确保完全混合，并置于4℃下40分钟。将引起肉眼可观察到的血凝的最高病毒稀释度作为HAU。
如下测PFU。将CV-1细胞生长至在6孔培养板上成单层。弃去培养基后，在37℃下将10倍系列稀释的病毒溶液(各0.1mL)分加到培养板的每孔中以下感染细胞1小时。感染中，制备无血清的2×MEM和熔化的2％琼脂(55℃)的混合物，并向混合物加入胰蛋白酶至终浓度为0.0075mg/mL。感染1小时并除去病毒溶液后，向培养板的每孔加入与琼脂混合的培养基(各3mL)，并于37℃下在5％CO2气氛中培养3天。向每孔加入酚红(0.1％)(0.2mL)，于37℃下培养3小时，然后除去。计数未染色的噬斑以测病毒滴度PFU/ml。
表1示转染到LLC-2细胞中的仙台病毒模板cDNA，RNA复制所需的cDNA因子、pGEM-L、pGEM-P/C和pGEM-NP的量，培养时间、接种到鸡卵的细胞数，HAU和PFU值。
表1模板cDNA 总量 pGEM pGEM pGEM 培养 细胞 HAU PFU
(μg) -L -P/C -NP 时间 数目
(μg) (μg) (μg) (h)(+)cDNA/C 10 4 2 4 40 1.00×105 512 2×109(+)cDNA/C 10 4 2 4 40 1.00×105 256 9×108(+)cDNA/C 10 4 2 4 40 1.00×106 256 9×108(+)cDNA/L 10 4 2 4 40 1.00×105 ＜2 ＜10(+)cDNA/L 10 4 2 4 40 1.00×105 ＜2 ＜10(+)cDNA/L 10 4 2 4 40 1.00×106 ＜2 ＜10(-)cDNA/L 10 4 2 4 40 1.00×104 ＜2 ＜10(-)cDNA/L 10 4 2 4 40 1.00×105 ＜2 ＜10(-)cDNA/L 10 4 2 4 40 1.00×106 ＜2 ＜10(-)cDNA/L 10 4 2 4 40 1.00×104 ＜2 ＜10(-)cDNA/L 10 4 2 4 40 1.00×105 ＜2 ＜10(-)cDNA/L 10 4 2 4 40 1.00×106 4 8×103
既表现HAU也表现出PFU的样品被通过超离心沉淀，重悬，通过20％-60％的蔗糖密度梯度离心纯化，并以12.5％SDS-PAGE分级。这些样品中所含的每种蛋白的大小与仙台病毒的那些蛋白相同。
这些结果表明仙台病毒能通过将cDNA导入细胞重建，并且，与那些转录负链RNA的相比，通过导入转录正链RNA的DNA会更加有效地重建病毒颗粒，通过导入环形cDNA而不是线形cDNA也会更有效地重建病毒颗粒。
实施例3
仙台病毒重建所需的RNA复制因子的检测
进行实验以检测重建仙台病毒是否需要表达L，P/C和NP蛋白的全部三种质粒。除开是pGEM-L，pGEM-P/C和pGEM-NP质粒中任两种的组合或它们中的任一种而不是如实施例2中的所有这3种组合与模板cDNA一起导入细胞之外，实验方法与实施例2中所述的那些相同。
表2示导入LLC-MK2细胞的仙台病毒模板cDNA、包括pGEM-L，pGEM-P/C和pGEM-NP在内的RNA复制所需的cDNA因子的量，培养时间、接种到鸡卵中的细胞的数目以及HAU和PFU的值。
表2模板cDNA 总量 pGEM pGEM pGEM 培养时 培养的细 HA PFU
(μg) -L -P/C -NP 间(h) 胞数目 U(+)cDNA/C 10 4 2 4 40 1.00×105 256 6×108(+)cDNA/C 10 4 2 4 40 1.00×106 512 4×109(+)cDNA/C 10 0 2 4 40 1.00×106 ＜2 ＜10(+)cDNA/C 10 0 2 4 40 1.00×106 ＜2 ＜10(+)cDNA/C 10 4 0 4 40 1.00×106 ＜2 ＜10(+)cDNA/C 10 4 0 4 40 1.00×106 ＜2 ＜10(+)cDNA/C 10 4 2 0 40 1.00×106 ＜2 ＜10(+)cDNA/C 10 4 2 0 40 1.00×106 ＜2 ＜10(+)cDNA/C 10 0 0 4 40 1.00×106 ＜2 ＜10(+)cDNA 10 0 0 4 40 1.00×106 ＜2 ＜10(+)cDNA/C 10 0 2 0 40 1.00×106 ＜2 ＜10(+)cDNA/C 10 0 2 0 40 1.00×106 ＜2 ＜10(+)cDNA/C 10 4 0 0 40 1.00×106 ＜2 ＜10(+)cDNA/C 10 4 0 0 40 1.00×106 ＜2 ＜10
如表2中所示，通过将这三种因子中的2种的组合导入细胞未观察到病毒重建，证明病毒重建需要这三种蛋白L，P/C和NP。
实施例4
于体外由转录的RNA重建仙台病毒的实验
由于实施例2中描述了由功能cDNA克隆重建仙台病毒，还检验了所述cDNA于体外的转录产物，即，vRNA和cRNA，是否能支持同样的重建。
在用限制酶MluI将仙台病毒转录单元，PUC18T7(-)HVJRz.DNA和PUC18T7(+)HVJRz.DNA线性化后，用这些DNA作模板，用纯化的T7聚合酶制剂(EPICENTRE TECHNOLOGIES：Ampliscribe T7转录试剂盒)于体外进行RNA合成。体外合成RNA的方法实际是按随该试剂盒提供的方案。使用这样获得的RNA产物取代实施例2中的cDNA，进行同样的实验，并通过HA实验测定病毒产物。结果示于表3。
表3模板 总量 pGEM pGEM pGEM 培养 培养的细 HA PFU
-L -P/C -NP 时间 胞数目 UcDNA (μg) (μg) (μg)(μg) (h)体外 10 4 2 4 40 1.00×106 512 2×109(-)RNA体外 10 4 2 4 40 1.00×106 512 ND(-)RNA体外 10 4 2 4 40 1.00×106 2 5×103(+)RNA体外 10 4 2 4 40 1.00×106 ＜2 ND(+)RNA
这些结果表明可以通过将负链或正链RNA导入细胞中来重建病毒。
实施例5
插入宿主细胞中仙台病毒载体中的外源基因的表达
1.插入外源基因(HIV-1gp120)的仙台病毒载体“pSeVgp120”的制备
用由引物a(5′-TGCGGCCGCCGTACGGTGGCAATGAGTGAAGGAGAAGT-3′)(序列1)和引物d(5′-TTGCGCCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTTATTACTACGGCGTACGTCATCTTTTTTCTCTCTGC-3′)(序列2)组成的一组引物，以标准PCR技术于“PN1432”上扩增HIV-1gp120基因。把PCR产物进行TA克隆，用NotI消化，并插入“pSeV18+”的NotI位点。然后用此重组质粒转化E.coli细胞。以“小量制备”(“Miniprep”)方法从每一克隆E.coli提取DNA，用DraIII消化，然后电泳。通过证实含由插入而预计大小的片段选择阳性克隆(下文称为“克隆9”)。在证实DNA片段具真正的核苷酸序列后，以氯化铯密度梯度离心纯化DNA。下文将以gp120基因插入的pSeV18+称为“pSeVgp120”。
2.含pSeVgp120(SeVgp120)的仙台病毒的重建和gp120表达的分析
除开在pGEM-NP，pGEM-P/C和pGEM-L之外再将pSeVgp120转染至LLCMK2细胞中之外，由受孕鸡卵回收绒毛膜尿囊液并通过实施例2中所述的方法测病毒HAU。如下还通过ELISA对回收的病毒检测gp120的表达。
将样品(各100μl)分加到已包被了抗HIV-1的单克隆抗体的96-孔板的每一个孔中，并于37℃下培养60分钟。用PBS洗涤后，向每孔加入HRP-连接的抗-HIV-1抗体(各100μl)，并于37℃下培养60分钟。用PBS洗涤后，向每孔中加入四甲基联苯胺，通过按450nm处的光密度测在酸性条件下通过HRP作用转化反应产物的量，以估计gp120的表达量。结果示于表4的左边栏中。
将如此获得的病毒接种至CV-1细胞中，并如下同样检测。以5×105细胞/板将CV-1细胞分加到培养板中，生长，然后弃去培养基。用PBS(-)洗涤后，以感染复数为10将病毒溶液加到细胞中并于室温下培养1小时。弃去病毒溶液后，用PBS(-)洗涤，把普通的MEM培养基(补充了抗生素AraC和Rif以及胰蛋白酶的MEM培养基)加入到细胞中并于37℃下培养48小时。反应后，回收培养基并检测HAU(以与实施例2中所述的方法相似的方法)，检测gp120的表述(通过ELISA)。结果示于表4的中间栏中。另外，把CV-1细胞培养基的上清液再接种到受孕鸡卵中，并对该病毒溶液测HAU，还检测gp120表达(通过ELISA)。结果示于表4的右边栏中。
表4
(μg/ml)
绒毛尿囊液(F1) CV-1培养基(F1) 绒毛尿囊液(F2)
gp120(HAU) gp120(HAU) gp120(HAU)
0.10(4) 3.46(128)
0.15(32) 1.81(128) 1.56，1.21
(512，512)
0.05(32) 2.20(128)
如表4中所示，检测到培养中CV-1细胞中(表的中栏)且在再次用病毒接种的受孕鸡卵的绒毛膜尿囊液中(表的右栏)也有相当高浓度的gp120。表左栏和中栏中示三种克隆的平均值。
此外，以Western印迹法分析gp120的表达。在20,000rpm下离心以SeVgp120感染的CV-1细胞的培养基1小时以沉淀病毒后，于冰上用三氯乙酸(TCA)(10％，V/V)处理上清液15分钟或于-20℃下用70％乙醇处理，并于15,000rpm下离心15分钟。将这样沉淀的蛋白混合以与“SDS-PAGE样品缓冲液”(Daiichi Chemicals)于90℃下反应3分钟，然后于10％SDS-PAGE上进行电泳。把这样分级分离的蛋白质转移至PVDF膜(Daiichi Chemicals)，于室温下与单克隆抗体902反应1小时，再用T-TBS洗涤。然后于室温下把此膜与抗-mIgG(Amersham)反应1小时，并用T-TBS洗涤，加入4-氯-1-萘酚(4CNPlus)(Daiichi Chemicals)以检测gp120。结果，在与预计分子量为gp120相应的位置显色蛋白质带。
另外，分析了以SeVgp120转染的CV-1细胞的感染后时间对HAV值以及gp120表达量的效果。以感染复数10用SeVgp120感染分加至10-cm板的CV-1细胞(5×106)，于感染后30，43，53和70小时时回收培养基(各1ml)，并进行HAU分析，gp120表达检测(通过ELISA)和Western印迹。结果示于表4。如图3中清楚地表示，gp120的产物趋向于随着仙台病毒的HA滴度增加而增加。
实施例6
对各种类型细胞中的SeVgp120增殖和gp120表达水平的分析
除开使用各种类型的细胞之外，使用了与实施5中的那些相同的方法，分析了HAU和gp120的表达水平(通过ELISA)。结果示于表5。
表5
细胞类型 时间(感染后) HAU rgp120(μg/ml)
CV-1 96 32 2.5
LLCMK2 48 16 0.5
CHO 55 4 0.46
NIH3T3 48 4 0.25
MT4 24 16 0.8
MOLT4/ 24 16 1.2
表中左栏示以SeVgp120感染的各种类型的细胞的感染后时间。结果，在实验的所有类型的细胞中检测到了SeVg120增殖以及gp120的表达。
实施例7
对宿主细胞中仙台病毒载体中插入的荧光素酶基因表达的研究
为分离荧光素酶基因以插入载体，通过以“pHvluciRT4”作模板，用一套引物[5′-AAGCGGCCGCCAAAGTTCACGATGGAAGAC-3′](30个碱基)(序列3)和[5′-TGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGATTATTACAATTTGGACTTTCCGCCC-3′(69个碱基)(序列4)的PCR构建连结到两端的工程NotI位点的荧光素酶基因。将PCR产物克隆到pSe18+的NotI窗(window)以获得插入荧光素酶基因的仙台病毒。然后把重组的载体转染到LLCMK2细胞中，并接种到受孕鸡卵中。切除发育的卵的绒毛膜尿囊膜，用冷PBS(-)洗涤两次，并在加入裂解缓冲液(Picagene WAKO)(25μl)以及充分混合后，于15,000rpm下离心2分钟。向上清液(各5μl)中加入底物(IATRON)(50μl)，把混合物分加到96-孔板的各孔中。用发光计(luminous CT-9000D，DIA-IATRON)测荧光强度酶活性以每秒计数(CPS)表示。结果，在感染后24小时后，检测到CV-1细胞有相当高的荧光素酶活性。在这一情况下，把不携带荧光素酶基因的仙台病素用作对照(表中以“SeV”表示)。由两个克隆获得的结果示于表中。
表6
荧光强度(计数/10秒)
绒毛尿囊膜 CV-1(感染后24小时)
Luc/SeV 669187
2891560 8707815
SeV 69 48
23 49
工业上的可应用性
本发明中，已建立起一个由负链病毒的cDNA有效拯救病毒颗粒的系统，并已研究出一种使得能够生产和扩增“由源于传播性特异负链RNA病毒的RNA病毒和不含任何核酸的病毒结构成份组成以致于有感染性和自主的RNA复制能力但无传播能力的复合体”的方法。由于所述复合体仅能在感染的细胞中复制，这些技术在高度重视治疗安全性的基因治疗等领域中特别有用。
序列表序列1
长度：38
类型：核酸
链型：单链
拓朴结构：线性
分子类型：其他核酸(合成的DNA)
序列
TGCGGCCGCC GTACGGTGGC AATGAGTGAA GGAGAAGT38序列2
长度：69
类型：核酸
链型：单链
拓朴结构：线性
分子类型：其他核酸(合成的DNA)
序列TTGCGGCCGC GATGAACTTT CACCCTAAGT TTTTVTTACTACGGCGTACG TCATCTTTTT TCTCTCTGC 69
序列3
长度：30
类型：核酸
链型：单链
拓朴结构：线性
分子类型：其他核酸(合成DNA)
序列AAGCGGCCGC CAAAGTTCAC GATGGAAGAC 30
序列4
长度：69
类型：核酸
链型：单链
拓朴结构：线性
分子类型：其他核酸(合成DNA)
序列TGCGGCCGCG ATGAACTTTC ACCTAAGTT TTTCTTACTACGGATTATTA CAATTTGGAC TTTCCGCCC 69
机译： 具有自主复制能力的负链RNA病毒载体
机译： 具有自主复制能力的负链RNA病毒载体
机译： 具有自主复制能力的负链RNA病毒载体
