一种咖啡酰对羟基苯酚酯及其制备方法和在制备酪氨酸酶抑制剂中的应用

摘要

本发明公开了一种咖啡酰对羟基苯酚酯及其制备方法和在制备酪氨酸酶抑制剂中的应用。本发明从南美蟛蜞菊植物中提取分离强效的酪氨酸酶抑制剂化合物p-hydroxyphenyl caffeate，植物材料来源丰富，既具良好经济效益，又对环境友好。药理实验显示，化合物p-hydroxyphenyl caffeate的酪氨酸酶抑制活性比曲酸更强，可望进一步发展为新的美白化妆品增效剂、治疗色素沉着皮肤病的药物、昆虫控制剂、甚或食品保鲜剂等，前景看好。

说明书

技术领域：

本发明属于天然药物化学并涉及医药和化妆品领域，具体涉及一种新的咖啡酰对羟基苯 酚酯天然化合物，即p-hydroxyphenyl caffeate，及该新化合物自植物南美蟛蜞菊中提取分离制 备的方法和该化合物或其可药用的盐在制备酪氨酸酶抑制剂或相关药物中的应用。

背景技术：

酪氨酸酶又称酚氧化酶、多酚氧化酶，广泛存在于微生物、植物和哺乳动物中，是调节 生物体内黑色素合成的一个关键酶。酪氨酸酶通过催化作用，使单酚羟基氧化成邻二酚，然 后邻二酚在其催化下进一步被氧化成邻二醌类，随后再经一系列复杂的非酶反应过程，最终 生成黑色素，在此过程中，酪氨酸酶起着关键的作用。酪氨酸酶与人的衰老，昆虫的伤口愈 合与发育，果蔬的褐变等有密切关系。

作为黑色素合成的关键酶，其异常过量表达可导致人体的色素沉着性疾病，引起严重的 健康和美容等问题，如色斑、黑斑、老年斑等；对昆虫来说，酪氨酸酶在黑色素合成、伤口 愈合、骨化等方面具有重要作用，并与昆虫蜕皮过程中的鞣化作用有关，是昆虫赖于生存的 一种重要的酶；在果蔬和食品加工中，酪氨酸酶是导致褐变的主要酶类，其因催化反应导致 新鲜水果、蔬菜和饮料产生褐变，从而降低其贮藏周期、营养价值和市场价值。

酪氨酸酶抑制剂可以抑制酪氨酸酶的活性，进而抑制黑色素的产生，从而降低酪氨酸酶 的不利影响。酪氨酸酶抑制剂可以治疗目前常见的色素沉着皮肤病如雀斑、黄褐斑、老年斑 等；因酪氨酸酶对昆虫的发育相当重要，对该酶抑制剂的研究在新型的生物杀虫剂的设计中 也具有指导作用；另外，酪氨酸酶抑制剂通过抑制酪氨酸酶的活性，可阻止或减缓果蔬储运 和食品加工中的褐变，因而酪氨酸酶抑制剂在用作食品保鲜剂方面也具有重要潜力。

基于酪氨酸酶抑制剂潜在广泛的价值用途，酪氨酸酶抑制剂的研究一直备受关注。不过 因受限于有效性、安全性以及成本等因素，到目前为止只有极少数酪氨酸酶抑制剂被用于商 业上，这包括有具代表性的用于皮肤增白剂制造的曲酸(kojic acid)和用于食品保鲜的4-己 基间苯二酚等。因而在医药化妆品、食品、以及昆虫控制等领域，目前都迫切需要开发新的 酪氨酸酶抑制剂，而以天然产物为来源的酪氨酸酶抑制剂，具有广阔的应用前景。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种具有酪氨酸酶抑制活性的咖啡酰对羟基苯酚酯— p-hydroxyphenyl caffeate。

本发明的新化合物p-hydroxyphenyl caffeate，其结构式如式(Ⅰ)所示：

本发明的第二个目的是提供一种化合物p-hydroxyphenyl caffeate的制备方法，其特征在 于，化合物p-hydroxyphenyl caffeate是从植物南美蟛蜞菊(Wedelia trilobata(L.)Hitchc (Synonym:Sphagneticola trilobata(L.)Pruski))中制备分离得到的。

具体材料可以是干品或鲜品，优选植物的干品。

具体步骤优选为：

a、制备总浸膏：将南美蟛蜞菊植物全株干品材料粉碎后用乙醇水溶液、乙醇、丙酮水溶 液或丙酮浸提，提取液浓缩去除乙醇或丙酮，得到总浸膏粗提物，将总浸膏粗提物悬浮于水 中，先用石油醚萃取，再用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取物经浓缩后得乙酸乙酯总浸膏；

b、分离纯化：乙酸乙酯总浸膏经正相硅胶柱层析，以氯仿/甲醇为洗脱剂，依次从体积 比98:2，95:5，90:10，85:15，7:3，6:4,0:100梯度洗脱，收集氯仿/甲醇9:1v/v洗脱的馏分， 再经中压反相硅胶柱层析，以甲醇/水为流动相，依次从体积比为3:7，4:6，5:5，6:4，10:0 的梯度洗脱，收集甲醇/水5:5v/v洗脱的馏分，再经Sephadex LH-20色谱柱纯化，以氯仿/甲 醇1:4v/v洗脱，洗脱物经重结晶得到p-hydroxyphenyl caffeate。

所述的乙醇水溶液或者丙酮水溶液优选为体积分数大于等于70％的乙醇水溶液或者丙酮 水溶液。

本发明的第三个目的是提供南美蟛蜞菊在制备化合物p-hydroxyphenyl caffeate的应用。

本发明的新化合物p-hydroxyphenyl caffeate，经体外药理实验证实，其对酪氨酸酶具有强 效的抑制作用，其抑制活性(IC₅₀＝2.00±0.31μM)甚至显著强于阳性对照品曲酸即Kojic acid (IC₅₀＝12.55±8.22μM)。因此该新化合物，可发展用于制备美白化妆品、治疗色素沉着皮肤 病的药物、昆虫控制剂、甚或食品保鲜剂等，应用潜质广泛。

本发明的第四个目的是提供p-hydroxyphenyl caffeate或其可药用的盐在制备酪氨酸酶抑 制剂中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种酪氨酸酶抑制剂，其特征在于，含有有效量的化合物 p-hydroxyphenyl caffeate或其可药用盐作为活性成分。

本发明的第六个目的是提供p-hydroxyphenyl caffeate或其可药用的盐作为酪氨酸酶抑制 剂在制备美白化妆品、治疗色素沉着皮肤病的药物、昆虫控制剂、甚或食品保鲜剂中的应用。

本发明的第七个目的是提供一种美白化妆品、治疗色素沉着皮肤病的药物、昆虫控制剂、 甚或食品保鲜剂，其特征在于，其含有有效量的化合物p-hydroxyphenyl caffeate或其可药用 盐作为活性成分。

本发明的新化合物p-hydroxyphenyl caffeate或其可药用的盐可与常用辅料或载体结合， 制备得到具有p-hydroxyphenyl caffeate抑制酪氨酸酶活性的，可用于制备美白化妆品、治疗 色素沉着皮肤病的药物、昆虫控制剂、或食品保鲜剂的抑制剂或组合物。该抑制剂或组合物 可以采用可湿性粉剂、膏状物、气雾剂等剂型；还可采用现代化妆品界或制药界所公知的控 释或缓释剂型或纳米制剂。

本发明采用从我国南方广泛分布的具有巨大生物量的入侵性植物南美蟛蜞菊中提取分离 强效酪氨酸酶抑制剂化合物p-hydroxyphenyl caffeate，材料来源丰富，且在采用该植物为原料 进行提取时还可以有利于控制该植物的进一步入侵，在取得经济效益的同时还能对环境友好。 该化合物p-hydroxyphenyl caffeate的酪氨酸酶抑制活性显著高于对照品曲酸，因而极可能进 一步发展为有效的新的美白化妆品增白剂、治疗色素沉着皮肤病的药物、昆虫控制剂、甚或 食品保鲜剂等，具有重要的应用开发潜质。

附图说明：

图1是化合物p-hydroxyphenyl caffeate的¹H NMR图谱；

图2是化合物p-hydroxyphenyl caffeate的¹³C NMR图谱；

图3是化合物p-hydroxyphenyl caffeate的HSQC图谱。

图4是化合物p-hydroxyphenyl caffeate的HMBC图谱。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制，根据本发明的实质对本 发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例1：南美蟛蜞菊中咖啡酰对羟基苯酚酯p-hydroxyphenyl caffeate的制备

1.1仪器与试剂

减压浓缩采用日本东京理化公司N-1000旋转蒸发仪、CCA-1110循环式冷却箱和 SB-1000电热恒温水浴锅；MPLC采用创新通恒公司CXTH P3000型液相色谱仪、UV 3000 UV-Vis检测器和C18反相色谱柱(粒径50μm,YMC Co.Ltd.,Kyoto,Japan，400mm×25mm)； 电喷雾质谱(ESIMS)采用美国应用生物系统公司MDS SCIEX API 2000LC/MS/MS仪，以甲醇 为溶剂直接进样测定；¹H NMR谱和¹³C NMR谱采用Bruker AVANCE 600核磁共振仪，并 以四甲基硅烷为内标测定。显色方法采用10％硫酸乙醇溶液处理后加热显色。

1.2植物来源与鉴定

供提取用植物南美蟛蜞菊(Wedelia trilobata(L.)Hitchc)于2011年9月采自华南植物园， 由中国科学院华南植物园邢福武研究员鉴定。

1.3提取与分离

样品(南美蟛蜞菊干品，重2.0公斤)粉碎后用体积分数95％乙醇水溶液室温下提取三 次，合并提取液减压浓缩除去有机溶剂乙醇，得到总浸膏粗提物。将总浸膏粗提物悬浮于500 ml水中，在用等体积的石油醚提取后，再用等体积的乙酸乙酯提取三次，乙酸乙酯萃取液经 减压浓缩得到乙酸乙酯总浸膏(35g)。将乙酸乙酯总浸膏用体积比1：1的氯仿/甲醇(150mL) 进行溶解，加入正相硅胶(80-100目)以重量比1:1.5拌样挥干，干法装柱(200-300目，1000 克)干法上样，依次用氯仿/甲醇＝98:2，95:5，90:10，85:15，7:3，6:4,0:100v/v为流动相梯 度洗脱，根据薄层板检测，各流份按照极性的差别从小到大依次收集7个组份F1–F7；氯仿/ 甲醇9:1v/v洗脱下的馏分F3(1.3g)，再经反相中压柱层析，以MeOH/H₂O(3:7，4:6，5:5， 6:4，10:0,v/v)为流动相洗脱，以5:5v/v的MeOH/H₂O洗脱部分E_5-2(66mg)再经Sephadex  LH-20柱层析(1500mm×25mm i.d)分离纯化，以氯仿/甲醇＝1:4v/v洗脱，洗脱馏分重结 晶得到如式(Ⅰ)所示的纯化合物1(p-hydroxyphenyl caffeate)(3.5mg)。

1.4化合物1(p-hydroxyphenyl caffeate)的结构鉴定

所获化合物1为黄色无定形粉末，分子式为C₁₅H₁₂O₅，其¹H NMR图谱、¹³C NMR图谱、 HSQC图谱和HMBC图谱分别如图1、2、3和图4所示，ESI-MS(pos.)m/z 273[M+H]⁺，295 [M+Na]⁺，567[2M+Na]⁺；ESI-MS(neg.)m/z 271[M-H]^-，543[2M-H]^-；HR-ESI-MS(pos.) m/z 295.0564[M+Na]⁺(calcd for C₁₅H₁₂NaO₅,295.0577)；¹H(CD₃OD,600MHz)和¹³C NMR (CD₃OD,150MHz)数据如表1所示：

表1.新化合物p-hydroxyphenyl caffeate的NMR数据

Data were measured at 600MHz for ¹H and 150MHz for ¹³C in CD₃OD,δin ppm and J in Hz.

根据以上质谱和一维、二维核磁等波谱相关数据的综合分析，解析推导出该新化合物的 化学结构为p-hydroxyphenyl caffeate，其结构式如式(Ⅰ)所示。

实施例2：化合物p-hydroxyphenyl caffeate的酪氨酸酶抑制活性检测

2.1试剂与仪器

试剂：酪氨酸酶购自Sigma Chemical Co.(Sigma-Aldrich,St.Louis,USA)，左旋多巴 (L-DOPA)、曲酸购自Aladdin Industrial Corporation(USA)，Na₂HPO₄，NaH₂PO₄，待测化 合物为植化分析实验制备；

实验仪器：酶标仪(Genois microplate reader,Tecan GENios,Swizerland)。

2.2测试方法

a)配制药物溶液：将待测化合物p-hydroxyphenyl caffeate、曲酸分别由二甲基亚砜(DMSO) 配制成为10mg/ml的溶液，67mmol的磷酸缓冲液(超纯水配制)，46U/ml酪氨酸酶溶液(用 磷酸缓冲液配制)，2.5mM L-DOPA(用磷酸缓冲液配制)。

b)采用比色法，通过96孔细胞培养板完成待测化合物对酪氨酸酶半数抑制浓度的测定。 首先将待测样品溶液用磷酸缓冲液按一定比例稀释(DMSO的量要小于5％)，每孔加入样品 溶液120μL，使待测样品的最终浓度为：100μg/mL,50μg/mL,25μg/mL,12.5μg/mL,6.25 μg/mL,3.125μg/mL,1.56μg/mL，0.78μg/mL，再将40μL的酪氨酸酶(46U/ml)加入到样 品孔中，在23℃反应10min，最后再加入40μL底物L-DOPA(2.5mM)。放置在23℃反应 10min后，最终在475nm波长处用酶标仪测定。阳性对照为曲酸，阴性对照为溶解样品溶 液所用比例相同的含DMSO的磷酸缓冲液，所有的空白对照为相同体积的磷酸缓冲液代替酶 溶液。待测化合物对酪氨酸酶抑制率的计算公式如下(Masuda et al.,2005)：抑制率(％)＝ (OD_{negative control}–OD_blank)–(OD_test–OD_{test control})/(OD_{negative blank}–OD_blank)×100％。其中待测化 合物对酪氨酸酶的半数抑制浓度(IC₅₀)由剂量效应曲线得到。

2.3实验数据参见表2：

表2.p-hydroxyphenyl caffeate的酪氨酸酶抑制活性

2.4实验结论：

酪氨酸酶是生物体内黑色素合成的一个关键酶，其与人的衰老，昆虫的伤口愈合与发育， 果蔬和食品的褐变等有密切关系，因而酪氨酸酶抑制剂在制备美白化妆品、治疗色素沉着皮 肤病的药物、昆虫控制剂、甚或食品保鲜剂等方面具有广泛应用潜质。本实验结果表明，我 们发掘的新化合物p-hydroxyphenyl caffeate具有强效抑制酪氨酸酶的作用，其抑制活性甚至 比商业应用的阳性对照品曲酸(Kojic acid)更强，因而具有较强的应用开发潜质，可望能进 一步发展成为新的美白化妆品增效剂、用于治疗色素沉着皮肤病的药物、或昆虫控制剂、甚 或食品保鲜剂等，应用潜质广泛。