赋予针对RAF抑制剂的抗性的C-RAF突变体

摘要

本发明提供了具有突变体C-RAF序列的核酸和蛋白质、鉴定有可能从联合治疗中获益的患有癌症的患者的方法、以及治疗方法。

说明书

相关申请

本申请要求于2012年3月28日递交的美国临时申请号61/616,999 和于2012年10月1日递交的61/708,372的利益，其在此以全文引用 的方式并入本文。

联邦政府资助的研究或开发

本发明受到政府资助，其由美国国立卫生研究院授予，联邦资助 号DP2 OD002750。政府享有本发明的一定的权利。

背景技术

在50-70％的恶性黑素瘤中发现丝氨酸/苏氨酸激酶B-RAF(也称 为BRAF)中的癌基因突变。(Davies,H.et al.,Nature 417,949–954 (2002).)黑素瘤被认为是皮肤癌的最致命的形式并且美国国家癌症研 究所已经估计2012年预计有72,250新病例，其可导致美国大约9,180 人死亡。临床前研究已经证实B-RAF(V600E)突变预测黑素瘤中促 分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号传导级联的依赖性(Hoeflich,K. P.et al.,Cancer Res.69,3042–3051(2009)；McDermott,U.et al.,Proc. Natl Acad.Sci.USA 104,19936–19941(2007)；Solit,D.B.et al.BRAF  mutation predicts sensitivity to MEK inhibition.Nature 439,358–362 (2006)；Wan,P.T.et al.,Cell 116,855–867(2004)；Wellbrock,C.et  al.,Cancer Res.64,2338–2342(2004))——观察到已经在临床试验中成 功验证RAF或MEK抑制剂(Flaherty,K.T.et al.,N.Engl.J.Med. 363,809–819(2010)；Infante,J.R.et al.,J.Clin.Oncol.28(suppl.), 2503(2010)；Schwartz,G.K.et al.,J.Clin.Oncol.27(suppl.),3513 (2009).)

最近，美国食品药品管理局(FDA)批准了Raf抑制剂威罗菲尼 (Vemurafenib)(PLX4032)。(Dummer et al.,2008；Infante et al., 2010；Joseph et al.,2010；Flaherty et al.,2010)然而，针对靶向癌症治 疗剂的临床反应经常受到新生抗性或获得抗性混淆。(Engelman,J.A. et al.,Science 316,1039–1043(2007)；Gorre,M.E.et al.,Science 293, 876–880(2001)；Heinrich,M.C.et al.,J.Clin.Oncol.24,4764–4774 (2006)；Daub,H.,Specht,K.&Ullrich,A.Nature Rev.Drug Discov.3, 1001–1010(2004).)在临床和体外背景下，最近该现象已被证明由以 下方式所支配：或是由一个平行信号模块(CRAF，COT)的过表达 (Montagut et al.,Cancer Res 68:4853-4861(2008)；Johannessen et al., Nature 468:968-972(2010)，平行信号通路(PDGFRb，IGF-1R)的激 活(Nazarian et al.,Nature 468:973-977(2010)；Villanueva et al., Cancer Cell 18:683-695(2010)，上游靶标(BRAF)的扩增(Shi et al., Nat Commun 3:724(2012)，靶标(p61BRAF)的删除(Poulikakos et al., Nature 480:387-390(2011)或是通过激活下游靶标或靶蛋白本身 (Mek)的突变(Emery et al.,Proc Natl Acad Sci U S A 106: 20411-20416(2009)；Wagle et al.,JCO 29:3085-3096(2011)。因此，仍 然需要以下方法：用于以阐明用长效治疗策略的“可药用(druggable)” 靶标的方式鉴定抗性机理的新方法，用于鉴定有可能从治疗策略中获 益的患者的新方法，以及以长效治疗策略治疗患者的方法。

发明内容

本发明涉及对癌症治疗的治疗剂的抗性的开发和赋予对癌症治疗 的抗性的靶标的鉴定。本发明还涉及用于促进长效治疗策略和鉴定可 以从该治疗获益的患者的平行药物靶标的鉴定。

在一个方面，本发明提供编码具有C-RAF活性的突变体C-RAF 多肽的核酸分子。所述突变体C-RAF多肽包括与含有SEQ.ID.NO.2 的野生型C-RAF多肽相比至少一个氨基酸的取代，所述至少一个氨 基酸的取代赋予对表达所述突变体RAF多肽的细胞上一种或多种 RAF抑制剂的抗性。

在另一个方面，本发明提供一种表达载体。所述表达载体包括编 码具有C-RAF活性的突变体C-RAF多肽的核酸分子，其中所述突变 体C-RAF多肽包括与含有SEQ.ID.NO.2的野生型C-RAF多肽相比 至少一个氨基酸的取代并且所述至少一个氨基酸的取代赋予对表达所 述突变体C-RAF多肽的细胞上一种或多种RAF抑制剂的抗性。

在另一个方面，本发明提供一种宿主细胞。所述宿主细胞包括所 述表达载体。

在另一个方面，本发明提供一种分离的具有C-RAF活性的突变体 C-RAF多肽。所述突变体C-RAF多肽包括与含有SEQ.ID.NO.2的 野生型C-RAF多肽相比至少一个氨基酸的取代并且所述至少一个氨 基酸的取代赋予对表达所述突变体RAF多肽的细胞上一种或多种 RAF抑制剂的抗性。

在另一个方面，本发明提供一种抗体制剂。所述抗体制剂特异性 结合本发明的分离的突变体C-RAF多肽。

在又一个方面，本发明提供一种治疗患有癌症的受试者的方法。 所述方法包括从患者的癌症细胞提取核酸，并测定编码C-RAF多肽 的至少一部分核酸分子的编码C-RAF多肽的核酸分子中一个或多个 突变的存在，所述突变在以下一个或多个位置与野生型C-RAF多肽 相比改变所编码的C-RAF多肽的一个或多个氨基酸处氨基酸残基的 身份(identity)：104E、257S、261P、356G、361G、427S、447D、 469M、478E和554R。所述方法还包括当所述核酸分子包括与野生型 C-RAF多肽相比在所述编码C-RAF多肽的一个或多个氨基酸改变所 述氨基酸残基的核苷酸时给予所述受试者有效量的RAF抑制剂和有 效量的第二抑制剂。

在另一个方面，本发明提供一种鉴定有可能从用RAF抑制剂和第 二抑制剂联合治疗中获益的患有癌症的受试者的方法。所述方法包括 从患者的癌症细胞提取核酸，并测定编码C-RAF多肽的至少一部分 核酸分子。与野生型C-RAF多肽相比，编码C-RAF多肽的核酸分子 内存在一个或多个突变，其在所编码的C-RAF多肽的一个或多个氨 基酸处改变氨基酸残基的身份，突变位于选自以下组的一个或多个位 置：104E、257S、261P、356G、361G、427S、447D、469M、478E 和554R，意味着需要用RAF抑制剂和第二抑制剂治疗所述受试者。

附图说明

图1显示A375细胞中C-RAF突变体等位基因(BRAFV600E) 对RAF抑制剂PLX4720的抗性。

(A)显示从PLX4720突变筛选得到C-RAF编码序列的候选突 变的平均变体得分。示出了高得分突变(>2％)的相应氨基酸取代。 (B)左图：显示C-RAF激酶结构域(残基340-618；灰色)(PDB 编号：3OMV)的晶体结构，包括代表性的C-RAF抗性突变体(棒) 以及结合的PLX4720的空间填充模型。还示出了DFG基序和P-环。 右图：C-RAF结构旋转90°以暴露二聚体界面残基R401(结构由 PyMOL渲染)。(C)C-RAF结构域代表(CR，保守区；RBD，Ras 结合结构域以及CRD，富含半胱氨酸的结构域)描绘C-RAF抗性突 变体(星号)和对C-RAF调控重要的三个丝氨酸残基(圆形)的位 置。

图2显示C-RAF抗性突变体的功能特征。

(A)表达C-RAF(WT)和C-RAF(鉴定的等位基因)的A375 细胞以剂量依赖的方式(0.08μM、0.4μM、2μM、5μM和10μM) 用RAF抑制剂PLX4720处理90min。免疫印迹显示pErk1/2、 pMek1/2、C-RAF。α-微管蛋白用作上样对照。(B)高表达抗性C-RAF 突变体的A375细胞用2μM的PLX4720处理16h。显示pMek1/2、 pErk1/2、Mek、S259C-RAF、S338C-RAF、S621C-RAF和肌动蛋 白的水平。(C)A375和C-RAF抗性等位基因应答于PLX4720和(D) 威罗菲尼的生长抑制曲线。(E)高表达抗性C-RAF突变体的A375 细胞用1μM的Mek抑制剂AZD6244处理16h。显示pMek1/2、 pErk1/2、Mek、S259C-RAF、S338C-RAF、S621C-RAF和肌动蛋 白的水平。(F)A375和C-RAF抗性等位基因应答于AZD6244和(G) Mek-GSK 1120212的生长抑制曲线。

图3显示C-RAF抗性突变体表现出与B-RAF增强的结合。

(A)表达C-RAF抗性等位基因的293/T细胞和(B)表达C-RAF 抗性等位基因的A375细胞用总C-RAF免疫沉淀。结合蛋白(B-RAF 和14-3-3)的水平由免疫印迹进行评估。输入(Input)裂解物(下图) 显示14-3-3、B-RAF、C-RAF、pMek1/2、pErk1/2、Mek、肌动蛋白 和S259C-RAF、S338C-RAF和S621C-RAF(右上图)。结果代表 两个以上独立的实验。

图4采用(S)-甲基1-(4-(3-(5-氯-2-氟-3-(甲基磺酰氨基)苯基)-1-异 丙基-1H-吡唑-4-基)嘧啶-2-基氨基)丙-2-基氨基甲酸酯显示C-RAF抗 性等位基因的生化特性。

(A)免疫印迹代表表达C-RAF抗性等位基因的A375细胞用1 μM的PLX4720、(S)-甲基1-(4-(3-(5-氯-2-氟-3-(甲基磺酰氨基)苯 基)-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)嘧啶-2-基氨基)丙-2-基氨基甲酸酯和 AZD6244处理16h的pMek1/2、pErk1/2、Mek、Erk和C-RAF水 平。肌动蛋白用作上样对照。(B)A375和C-RAF抗性等位基因应 答于PLX4720、(C)(S)-甲基1-(4-(3-(5-氯-2-氟-3-(甲基磺酰氨基) 苯基)-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)嘧啶-2-基氨基)丙-2-基氨基甲酸酯和 (D)AZD6244的生长抑制曲线。

图5显示赋予对威罗菲尼(PLX4032)抗性的C-RAF抗性突变体。

(A)A375和C-RAF抗性等位基因应答于威罗菲尼(PLX4032) 的生长抑制曲线。(B)在存在和不存在威罗菲尼16h的情况下，来 自表达WT,S257P,P261T和G361A的A375细胞的提取物中C-RAF 激酶活性。免疫印迹代表pMek1/2、pErk1/2、Mek、Erk和肌动蛋白。 结果代表三个独立的实验。(C)A375和C-RAF抗性等位基因应答 于PLX4720、(D)AZD6244和(E)PLX4720和AZD6244的生长 抑制曲线。

图6显示C-RAF抗性突变体的同源二聚化和激酶活性。

(A)共表达His/V5标签和Flag标签的C-RAF抗性突变体48h 的293T细胞与镍(参见方法部分)免疫沉淀以拉下His标签的C-RAF， 并且Flag标签的C-RAF用免疫印迹进行评估。输入裂解物也采用检 测Flag-C-RAF、V5-C-RAF、总C-RAF、p-MEK、p-ERK和总ERK 的抗体进行评估。(B)共表达His/V5标签和Flag标签的C-RAF抗 性突变体的293T细胞用或者载体(DMSO)或者2μM的威罗菲尼 处理1h，并且His/V5标签的C-RAF如上述(A)所述的进行免疫沉 淀。输入裂解物采用识别C-RAF(S338)、p-MEK、p-ERK和肌动蛋 白(上样对照)的抗体免疫印迹。(C)体外C-Raf激酶活性在源自 如下293T细胞的细胞提取物中测量：瞬时表达Flag标签空载体 (“C”)、野生型C-RAF(“WT”)和携带抗性突变体S257P、P261T、 G361A和E478K的C-RAF。分析在存在或不存在2μM威罗菲尼的 情况下进行(参见方法部分)。输入裂解物也采用检测p-MEK1/2、 p-ERK1/2、总MEK、总ERK和肌动蛋白的抗体进行免疫印迹。(D) 在存在和不存在2μM威罗菲尼的情况下，在源自如下细胞的细胞提 取物中测量体外C-Raf激酶活性：A375细胞(B-RAF^V600E)(“C”) 和稳定表达野生型C-RAF(“WT”)和携带抗性突变体S257P、P261T 和G361A的A375。对输入裂解物采用识别p-MEK1/2、p-ERK1/2、 总MEK、总ERK和肌动蛋白的抗体进行免疫印迹研究。所有结果代 表三个独立的实验。

图7显示C-RAF抗性突变体的异源二聚化和14-3-3结合性质。

(A)在不存在(-)或存在(+)2μM威罗菲尼1h情况下的瞬 时表达所示C-RAF抗性突变体的293/T细胞与C-RAF免疫沉淀并且 结合蛋白(B-RAF和14-3-3ζ)(上图)的水平由免疫印迹评估。输 入裂解物(下图)显示14-3-3ζ、B-RAF、C-RAF、pMek1/2、pErk1/2、 Mek、S338C-RAF和肌动蛋白。结果代表两个以上独立的实验。(B) 在不存在和存在2μM威罗菲尼16h情况下的稳定表达所示C-RAF 抗性突变体的A375细胞与C-RAF免疫沉淀并且结合蛋白(B-RAF 和14-3-3ζ)(上图)的水平由免疫印迹评估。输入裂解物与图7A相 同的方法进行印迹。结果代表两个以上独立的实验。

图8显示C-RAF抗性突变体要求MEK/ERK信号的二聚化。

(A)表达或者Flag标签、野生型C-RAF或所示C-RAF抗性突 变体的构建体在不存在(左)或存在(右)二聚化缺陷突变体R401H (粉)的情况下表达于293T细胞。裂解物采用识别p-MEK、p-ERK、 总MEK或总C-RAF进行印迹。(B)共表达His标签C-RAF抗性 突变体的293/T细胞其自身和在二聚化缺陷(粉)相关情境中在不存 在或存在威罗菲尼(2μM，1hr)的情况下培养。采用镍珠进行免疫 沉淀并且Flag标签的C-RAF的水平由免疫印迹进行评估。还显示了 输入裂解物与识别Flag-C-RAF、V5-C-RAF、总C-RAF、p-MEK、 p-ERK、S338-C-RAF和肌动蛋白的抗体的印迹。

图9显示C-RAF抗性等位基因的生化特性

(A)采用表达包含各种从随机诱变筛选中出现的抗性等位基因 的C-RAF的A375细胞比较表达于A375细胞中的pMek/pErk水平。 微管蛋白作为阳性对照。(B)表达或者野生型C-RAF或者C-RAF 抗性等位基因的A375细胞用Raf抑制剂PLX4720以所示剂量处理90 分钟。用抗p-ERK、p-MEK和总C-RAF的抗体进行免疫印迹研究。 微管蛋白作为上样对照。

图10显示同源二聚化和激酶活性。

(A)共表达His/V5标签的C-RAF抗性突变体48h的293/T细 胞与His免疫沉淀并且Flag标签的C-RAF相互作用用免疫印迹进行 评估。输入裂解物代表Flag-C-RAF、V5-C-RAF、C-RAF、pMek、 pErk和Erk。(B)293/T细胞用二聚化缺陷C-RAF突变体R401H 和看门突变T421N转染并且在存在威罗菲尼(2μM)1h的情况下检 测Mek/Erk敏感性。T421N用作阴性对照并且G361A用作阳性对照。

发明详述

本发明涉及癌症治疗的治疗剂的抗性的开发和赋予癌症治疗抗性 的靶标的鉴定。本发明还涉及用于促进长效治疗策略和鉴定可以从该 治疗获益的患者的平行药物靶标的鉴定。

本发明的实践将采用，除非另有说明，常规的分子生物学、免疫 学、微生物学、细胞生物学和重组DNA技术，这些都在本领域的技 术范围内。参见例如Sambrook,Fritsch和Maniatis,MOLECULAR  CLONING:A LABORATORY MANUAL,(当前版本)；CURRENT  PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel et al.编 著,(当前版本))；the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press,Inc.)；PCR 2:A PRACTICAL APPROACH(当前版 本)；ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL和ANIMAL CELL  CULTURE(R.I.Freshney,编著(1987)).DNA Cloning:A Practical  Approach,vol.I&II(D.Glover,ed.)；Oligonucleotide Synthesis(N. Gait,编著,当前版本)；Nucleic Acid Hybridization(B.Hames&S. Higgins,编著,当前版本)；Transcription and Translation(B.Hames &S.Higgins,eds.,当前版本)；Fundamental Virology,第2版,vol.I &II(B.N.Fields和D.M.Knipe编著)

促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联是一个关键的细胞内信号 转导通路，其调节信号转导响应于多种细胞外刺激物，包括生长因子、 细胞因子和原癌基因。激活该途径导致转录因子活化和基因表达的改 变，这最终导致细胞功能的改变，包括细胞增殖、细胞周期调控、细 胞存活、血管生成和细胞迁移。经典的MAPK信号传导是通过在细胞 表面的受体酪氨酸激酶开始的，但许多其他细胞表面分子能够激活 MAPK级联，包括整合素、异三聚体G蛋白以及细胞因子受体。

结合细胞表面受体的配体，例如，受体酪氨酸激酶，通常会导致 受体的磷酸化。接头蛋白Grb2与激活的受体的磷酸化的细胞内结构 域结合，并且该结合募集鸟嘌呤核苷酸交换因子包括SOS-I和CDC25 至细胞膜。这些鸟嘌呤核苷酸交换因子与GTP酶Ras相互作用并激 活GTP酶Ras。常见的Ras亚型包括K-Ras、N-Ras、H-Ras及其它 亚型。Ras激活之后，丝氨酸/苏氨酸激酶Raf(例如，A-Raf、B-Raf、 C-Raf或Raf-1)通过与Ras相互作用被募集至细胞膜或以不依赖Ras 的方式在细胞质中，其中它经历构象变化并结合例如14-3-3的支架蛋 白(King et al.,Nature 396；180-183(1998)；Chaudhary et al.,Curr  Biol 10:551-554(2000)；Avruch et al.,Endo Rev 56:127-156(2001), Wellbrock et al.,Nat Rev Mol Cell Biol 5:875-885(2004))。14-3-3结 合并稳定/激活CRAF是由例如负电荷调控区(N-区)中的S338、Y341 以及C端、激酶结构域之外的S621激活残基的磷酸化，和负电荷调 控残基例如CR2结构域中的S259(图1C)的去磷酸化以及进一步反 应其复杂调控的许多其它遍布整个蛋白的磷酸化位点所支配(Avruch  et al.,Id.(2001)；Wellbrock et al.,Id.(2004)；Garnett et al.,Mol.Cell 20:963-969(2005))。CRAF的激活也被人工同源二聚体的形成所诱 导(Avruch et al.,Id.(2001)；Wellbrock et al.,Id.,(2004).)

然后Raf被磷酸化。Raf通过磷酸化217和221位的两个丝氨酸 残基直接激活MEKl和MEK2。激活后，MEKl和MEK2磷酸化丝氨 酸/苏氨酸激酶Erkl和Erk2的酪氨酸(Tyr-185)和苏氨酸(Thr-183) 残基，导致Erk激活。激活的Erk调节细胞质中的许多靶标并且还移 位入核，在那里它磷酸化大量调节基因表达的转录因子。Erk激酶有 大量靶标，包括EIk-I、c-Etsl、c-Ets2、p90RSKl、MNKl、MNK2、 MSKl、MSK2和TOB。虽然前面的通路是MAPK信号的经典代表， MAPK通路与其它信号级联之间有相当多的交叉对话。

MAPK信号传导通路中的偏差对癌症生物学具有显著作用。Ras 表达的改变常见于多种癌症，并Ras中激活的突变也已确定。这些突 变见于所有癌症的高达30％，并且是在胰腺癌(90％)和结肠癌(50％) 尤其常见。此外，已经确定在黑素瘤和卵巢癌中激活的B-Raf突变。 最常见的突变，BRAF^V600E，导致下游MAP激酶通路的组成型激活并 且是黑素瘤的细胞增殖、软琼脂生长和肿瘤异种移植物的形成所必需 的。CRAF扩增已经涉及前列腺癌和膀胱癌(Edwards et al.,2003； Simon et al.,2001)，此外，在胃癌和毛细胞型星形细胞瘤中的染色 体易位(Shimizu et al.,1986；Jones et al.,2009)。然而，CRAF突变 在人类癌症的发生率是1％(COSMIC)，这是由于其与BRAF相比 低的基础激酶活性(Marais et al.,Science 280:109-112(1997)；Emuss  et al.,Cancer Res 65:9719-9726(2005)；Garnett et al.,Mol.Cell 20: 963-969(2005))。基于对MAPK的定义的在人类癌症中过度激活的 角色，用特异性抑制剂靶向MAPK通路的成分是一种有前途的癌症治 疗方法。但是，患者可能有对这些有前途的治疗方法的先天抗性或获 得抗性。赋予靶激酶突变抗性的鉴定、诊断和/或预后标记物和对这些 有先天或获得抗性的患者进行治疗的疗法在下文进行描述。

C-RAF突变

虽然用例如PLX4032的RAF抑制剂的癌症治疗是一种有前途的 治疗方法，接受这种治疗的患者经常复发或无法响应，其结果是患者 的疾病发展。如本发明所述，本发明涉及发现赋予对RAF抑制剂抗性 的C-RAF中的突变，其中一些是目前处于临床开发中的。在癌症细 胞中获得这样的突变使得患者的细胞对某些RAF抑制剂的治疗具有 抗性。在示例的实施方案中，本发明涉及对RAF抑制剂抗性的开发， 其可以包括但不限于RAF265、索拉非尼、SB590885、PLX 4720、 PLX4032、GDC-0879、ZM 336372和(S)-甲基1-(4-(3-(5-氯-2-氟-3-(甲 基磺酰氨基)苯基)-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)嘧啶-2-基氨基)丙-2-基氨基 甲酸酯。通过非限制性的例子，示例性的RAF抑制剂示于表1中。所 述RAF抑制剂(S)-甲基1-(4-(3-(5-氯-2-氟-3-(甲基磺酰氨基)苯基)-1- 异丙基-1H-吡唑-4-基)嘧啶-2-基氨基)丙-2-基氨基甲酸酯被一般性及 具体涉及到(本临时申请的第50页的表1的化合物9；PCT公开文本 WO2011/025927的第72页上的化合物9。

赋予对本发明所述的RAF抑制剂抗性的C-RAF突变的临床上的 出现表明，RAF/MEK相关的依赖关系的生物相关性被维持，即使在恶 性肿瘤的后期阶段。因此，RAF抑制剂的失效引发许多恶性肿瘤中持 续的肿瘤反应，包括黑素瘤，可能表明在临床上不理想的药物效力或 药效学研究。基于本发明所述的发现，涉及RAF-或MEK-驱动的肿瘤 靶向药物治疗方式可能会受益于更有效的药物、现有药物的改变的给 药或组合RAF和MEK抑制作用。示例性RAF抑制剂包括，但不限 于表1中列出的抑制剂。MEK抑制剂的非限制性的例子包括： AZD6244；CI-1040；PD184352；PD318088、PD98059、PD334581、 RDEA119、6-甲氧基-7-(3-吗啉-4-基-丙氧基)-4-(4-苯氧基-苯氨基)-喹 啉-3-腈和4-[3-氯-4-(1-甲基-1H-咪唑-2-基磺酰基)-苯氨基]-6-甲氧基 -7-(3-吗啉-4-基-丙氧基)-喹啉-3-腈。示例性MEK抑制剂显示于表2。 这些治疗创新，与分层患者的强大的肿瘤基因组谱一起，应当与“可药 用”原癌基因突变一起加快癌症的个性化癌症治疗的出现。

表1：示例性的RAF抑制剂

表2：示例性的MEK抑制剂

在各种实施方案中，本发明涉及鉴定C-RAF多肽中突变，或编码 所述C-RAF多肽的核酸分子中突变的方法，所述突变赋予表达所述 C-RAF多肽的细胞对抑制RAF活性的药物的抗性。“突变体C-RAF 多肽”，如本文所指称的，包括包含赋予对一种或多种已知RAF抑制 剂的抗性的一个或多个突变的C-RAF多肽。同样，“突变体C-RAF 核酸分子”，如本文所指称的，包括编码突变体C-RAF多肽的核酸分 子。编码包括一个或多个突变的C-RAF多肽的核酸分子可以采用本 领域已知的任何合适的方法制造，包括，例如，野生型C-RAF核酸 序列的随机诱变或位点定向诱变，其可在大肠杆菌中进行。在示例性 的实施方案中，野生型C-RAF核酸序列是人野生型MEK1核酸序列。 在具体的实施方案中，所述野生型C-RAF核酸序列是野生型人C-RAF (SEQ ID NO:1)(登录号BC018119.2.)。然后，所述突变体C-RAF 核酸分子可在对用RAF抑制剂的治疗别样敏感的细胞中被筛选以鉴 定编码突变体C-RAF多肽的核酸分子，其与野生型C-RAF多肽相比 对用RAF抑制剂的治疗具有抗性。在一些实施方案中，所述C-RAF 多肽是所述野生型人C-RAF(SEQ ID NO:2)(Swiss-Prot ID#是 P04049-10)。

任何合适的方法可用于筛选对用RAF抑制剂的治疗具有抗性的 突变体C-RAF核酸和突变体C-RAF多肽。例如，编码突变体C-RAF 多肽的核酸分子可在对用RAF治疗别样敏感的细胞中被表达。用于此 目的的示例性的细胞系是黑素瘤细胞系A375。所述突变体C-RAF多 肽表达之后，所述细胞可以用RAF处理。然后，可以测定所述突变体 C-RAF多肽的活性并与相似表达的野生型C-RAF多肽的活性比较以 及用RAF抑制剂处理。例如，C-RAF多肽的活性可以通过测定用RAF 抑制剂处理之后的细胞的增殖或活力来确定，其中增殖或活力与 C-RAF活性呈正相关。可以采用本领域已知的任何合适的方法确定细 胞生长、增殖或活力。在一个实施方案中，可以采用基于孔的细胞增 殖/活力分析，例如MTS或细胞滴度GLo，来确定细胞生长，其中， 在存在RAF抑制剂的情况下细胞生长表示为在不存在所述RAF抑制 剂的情况下培养的未处理的细胞中所观察到的细胞生长的百分比。在 某些实施方案中，抗性被定义为与合适的对照相比GI50值至少2倍 的变化，更优选至少3倍，最优选至少4-5倍。在其它实施方案中， 抗性被定义为GI50值～1uM。C-RAF多肽的活性还可以通过例如确 定用所述RAF抑制剂处理之后的细胞中存在的磷酸化的ERK1/2的相 对量来进行检测。野生型或突变体C-RAF多肽的活性还可以采用体 外磷酸化测定进行确定，其中MEK1活性通过检测用RAF或MEK 抑制剂处理后试验中磷酸化的ERK 1/2底物的比例来确定。用RAF 抑制剂处理后比野生型C-RAF多肽具有更高活性的突变体C-RAF多 肽被鉴定为含有赋予对RAF抑制剂的抗性的突变。然后，赋予对RAF 抑制剂的抗性的所述突变可以通过对编码所述突变体C-RAF多肽的 核酸进行测序或通过直接对所述突变体C-RAF多肽进行测序来进行 鉴定。

以这种方式，以及采用大规模平行测序方法，如实施例1中所述， 当突变赋予对所述RAF抑制剂PLX4032、PLX4720和(S)-甲基 1-(4-(3-(5-氯-2-氟-3-(甲基磺酰氨基)苯基)-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)嘧 啶-2-基氨基)丙-2-基氨基甲酸酯的抗性时，鉴定所述C-RAF多肽中的 氨基酸取代。具体地，人C-RAF多肽的以下一个或多个氨基酸的取 代赋予对RAF抑制剂的抗性，包括104E、257S、261P、356G、361G、 427S、447D、469M、478E和554R。在某些实施方案中，所述突变体 C-RAF多肽包括相对于所述野生型人C-RAF多肽在这些氨基酸残基 的一个或多个的突变。在示例性实施方案中，所述突变体C-RAF多 肽包括一个或多个以下抗性突变：104E>K、257S>P、261P>T、 356G>E、361G>A、427S>T、447D>N、469M>I、478E>K和554R>K。

分离的核酸分子

本发明涉及与C-RAF基因和其相应的基因产物相关的多核苷酸 或核酸分子。这些多核苷酸或核酸分子是可以从哺乳动物细胞分离和 纯化的。在本发明具体的方面，本文所述的分离的C-RAF核酸分子 包括赋予对一种或多种RAF抑制剂的抗性的突变。“突变体C-RAF 核酸分子”，如本文所指称的，包括编码突变体C-RAF的C-RAF核 酸分子，即C-RAF多肽包括一个或多个赋予对一种或多种RAF抑制 剂的抗性的突变。

考虑分离的和纯化的C-RAF核酸分子，例如，突变体C-RAF核 酸分子，可以是RNA或DNA的形式。如本文所使用的，术语“RNA 转录本”是指RNA分子，其是DNA核酸分子转录的产物。该转录本 可以编码一个或多个蛋白。

如本申请所使用的，术语“多核苷酸”是指核酸分子，RNA或DNA， 其已经被分离了，例如不含全基因组核酸。因此，“编码C-RAF的多 核苷酸”是指包括C-RAF编码序列的核酸片段，但其被从全基因组 DNA和蛋白分离而来或纯化而得并且不含全基因组DNA和蛋白。当 本申请引用编码C-RAF的多核苷酸或核酸的功能或活性，其意味着 所述多核苷酸编码能够执行野生型C-RAF多肽的活性(例如ERK1/2 底物的磷酸化)的分子。

术语“cDNA”旨在表示使用RNA作为模板DNA的制备。还设想 的是，来自给定细胞的给定的C-RAF编码核酸或C-RAF基因可以由 天然变体或株代表，其具有略微不同的核酸序列但尽管如此还编码活 性C-RAF多肽。在优选的实施方案中，所述活性C-RAF多肽是活性 人C-RAF多肽。在特别优选的实施方案中，所述活性C-RAF多肽是 具有野生型C-RAF多肽活性的突变体C-RAF多肽，但其对一种或多 种已知RAF抑制剂具有抗性。因此，本发明的某些方面涵盖了带有最 小的核酸或氨基酸改变但具有相同的生物学功能的C-RAF核酸或多 肽衍生物。

在一些实施方案中，本发明涉及整合入DNA序列的重组载体， 所述DNA序列编码突变体C-RAF多肽或在其氨基酸序列范围内包括 按照或基本上对应于突变体C-RAF多肽的连续氨基酸序列的肽。在 示例性实施方案中，本发明涉及整合入DNA序列的分离的DNA片段 和重组载体，所述DNA序列编码在其氨基酸序列范围内包括包含赋 予对一种或多种RAF抑制剂抗性的一个或多个突变的C-RAF多肽的 连续氨基酸序列的C-RAF多肽。

本发明所使用的核酸片段，不管编码序列本身的长度，可与其他 DNA或RNA序列结合，例如启动子、多腺苷酸化信号、额外的限制 性酶位点、多克隆位点、其他编码片段等，使得它们的总长度可以变 化很大。因此，设想的是几乎可以采用任何长度的核酸片段，优选全 长是由易于在旨在重组DNA实验操作中制备和使用的限制。“异源” 序列是指对于剩余序列是外来的或外源的序列。异源基因是指在邻接 与它现在被置于的序列的自然界中没有被发现的基因。

在一些实施方案中，所述核酸序列可以编码具有C-RAF活性的突 变体C-RAF多肽，其在包括下述的一个或多个氨基酸位置发生至少 一个氨基酸取代：104E、257S、261P、356G、361G、427S、447D、 469M、478E和554R。在其它实施方案中，所述突变体C-RAF多肽 包括一个或多个以下的抗性突变：104E>K、257S>P、261P>T、356G>E、 361G>A、427S>T、447D>N、469M>I、478E>K和554R>K。

表达载体和宿主细胞

本发明涵盖了表达载体组合物和该载体的用途，以编码C-RAF 多肽，例如，突变体C-RAF多肽，以及宿主细胞组合物，在其中这 样的表达载体已被引入。术语“载体”用来指载体核酸分子，在其中核 酸序列可以被插入以引入细胞，在那里它可以被复制。核酸序列可以 是“外源的”，其意味着它对要将载体引入其中的细胞是外来的或者所 述序列与细胞中的序列同源但在宿主细胞核酸范围内的一个位置里， 在其中所述序列通常是没有被发现的。载体包括质粒、粘粒、病毒(噬 菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如YAC)。本领域技 术人员熟知并通过标准重组技术即可构建载体。

术语“表达载体”或“表达构建体”是指含有编码能够转录的基因产 物的至少一部分核酸的载体。然后，在一些情况下，RNA分子被翻译 成蛋白质、蛋白或肽。在其它情况下，例如，在反义分子或核酶的生 产中这些序列不被翻译。表达载体可包含多种“控制序列”，其是指转 录以及在特别的宿主生物体中可操作连接的编码序列的可能的翻译所 必须的核酸序列。支配转录和翻译的控制序列之外，载体和表达载体 还可包含具有其它功能的核酸序列。

如本发明所使用的，术语“细胞”，“细胞系”和“细胞培养物”可以 互换使用。包含C-RAF多肽的细胞，或是突变的或是野生型的，可 用于本发明。所有这些术语还包括它们的后代，其是指任何和所有的 后续世代。应该理解的是，所有后代可能并不相同由于有意或无意的 突变。在表达异源核酸序列的上下文中，“宿主细胞”是指原核或真核 细胞，并且它包括任何可转化的生物体，其能够复制载体和/或表达载 体编码的异源基因。宿主细胞可以，并且已经，用作载体的接受者了。 宿主细胞可以被“转染”或“转化”，其是指外源核酸转移或引入宿主细 胞的过程。转化的细胞包括初级受体细胞及其后代。“重组宿主细胞” 是指携带重组核酸的宿主细胞，即已经在体外被操作的核酸或是已经 被操作的核酸的复制的拷贝的核酸。宿主细胞可以源自原核细胞或真 核细胞，其取决于所期望的结果是载体的复制、载体部分或全部编码 核酸序列的表达或感染病毒颗粒的制备。

分离的多肽分子

本发明的另一个方面涉及分离的和/或纯化的C-RAF多肽，以及 它们的生物学活性部分。在本发明的具体的方面，本发明所述的 C-RAF多肽包含于一个或多个氨基酸处赋予对一种或多种RAF抑制 剂的抗性的突变。“突变体C-RAF多肽”，如本文所指称的，包括包 含于一个或多个氨基酸赋予对一种或多种RAF抑制剂的抗性的突变 的C-RAF多肽。

C-RAF多肽的生物学活性部分包括包含源自C-RAF多肽的氨基 酸序列的氨基酸序列的多肽，例如，SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列， 其包括比全长的C-RAF多肽更少的氨基酸，并显示出C-RAF多肽的 至少一种活性。典型地，生物学活性部分(肽，例如，如5、10、15、 20、30、35、36、37、38、39、40、50、100或更长的氨基酸的肽) 包含具有C-RAF多肽的至少一种活性的结构域或基序。此外，其它 生物学活性部分，其中蛋白的其它区域被删除，可以通过重组技术制 备并且评估本发明所述的一个或多个活性。优选地，C-RAF多肽的生 物学活性部分包括一种或多种选定的结构域/基序或其具有生物活性 的部分。

C-RAF多肽可以通过重组DNA技术来生产。例如，编码蛋白的 核酸分子克隆到表达载体(如上所述)，所述表达载体引入宿主细胞 (如上所述)并且所述C-RAF多肽在所述宿主细胞中表达。然后， 所述C-RAF多肽可以通过合适的纯化方案采用标准蛋白纯化技术从 所述细胞分离。重组表达的替代方式，C-RAF多肽可采用标准肽合成 技术进行化学合成。此外，可以从细胞(例如，癌细胞)分离天然C-RAF 多肽和/或突变体C-RAF多肽，例如采用抗C-RAF抗体，其可以利用 本发明的C-RAF多肽或其片段通过标准技术生产。

也可以使用C-RAF的嵌合或融合蛋白。如本文中所使用的， MEK1“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包含可操作地连接到非C-RAF多肽 的C-RAF多肽。“C-RAF多肽”是指具有对应于C-RAF多肽的氨基酸 序列的蛋白，而“非C-RAF多肽”是指具有对应于与C-RAF多肽基本 上不同源的蛋白质的氨基酸序列的蛋白，例如，基本上不同于C-RAF 多肽的蛋白，其不显示C-RAF活性并且其衍生自相同或不同的生物 体。在所述融合蛋白范畴内，术语“可操作地连接”旨在表明，所述 C-RAF多肽和所述非C-RAF多肽被框内融合在一起。所述非C-RAF 多肽可融合至所述C-RAF多肽的N末端或C末端。例如，在一个实 施方案中所述融合蛋白是GST-C-RAF融合蛋白，其中C-RAF氨基酸 融合至GST多肽的C末端。此类融合蛋白可以促进重组C-RAF多肽 的纯化。在另一个实施方案中，所述融合蛋白是含有在其N末端的异 源信号序列的C-RAF多肽。在某些宿主细胞(例如，哺乳动物宿主 细胞)中，可以通过使用异源信号序列提高MEK1蛋白的表达和/或 分泌。

突变体C-RAF多肽可以由野生型的C-RAF多肽或编码野生型 C-RAF多肽的核酸分子经诱变生成。突变体C-RAF多肽也可以通过 对C-RAF突变体的组合文库筛选具有期望的活性(例如，对一种或 多种RAF抑制剂的抗性)突变体C-RAF多肽来鉴定。用于筛选通过 点突变或截短制成的组合文库的基因产物和用于对具有选定特性的基 因产物筛选cDNA文库的技术是本领域已知的几种技术。这些技术适 用于快速筛选由组合诱变产生的基因文库。用于筛选大基因文库的最 广泛使用的技术(其适合于高通量分析)通常包括将基因文库克隆进 可复制的表达载体中，以得到的载体文库转化合适的细胞，并在促进 编码其产物被检测的所述基因的载体的分离的条件下表达组合基因。

抗体

本发明的多核苷酸所表达的多肽可用于产生抗体。在一些实施方 案中，所述抗体可用于检测和定量突变体C-RAF多肽的表达。在一 些实施方案中，所述抗体可用于改变突变体C-RAF多肽的活性。包 含至少六、八、十、十二、十五、二十或三十个连续氨基酸的本发明 的多核苷酸表达的多肽可以作为免疫原。所述多肽可用于获得抗体制 剂，其特异性结合本发明的本发明的突变体C-Raf多肽，所述突变体 C-Raf多肽具有赋予对RAF抑制剂的抗性的人C-Raf多肽的一个或多 个以下氨基酸处的一个或多个氨基酸取代，包括：104E、257S、261P、 356G、361G、427S、447D、469M、478E和554R。在示例性的实施 方案中，所述突变体C-RAF多肽包括以下一个或多个抗性突变： 104E>K、257S>P、261P>T、356G>E、361G>A、427S>T、447D>N、 469M>I、478E>K和554R>K。

所述抗体可以是单克隆和多克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、双 功能/双特异性抗体、人源化抗体、人抗体以及互补决定区(CDR)接 枝的抗体，所述抗体对靶蛋白或其片段是特异性的，并且还包括抗体 片段，包括Fab、Fab′、F(ab′)2、scFv、Fv、骆驼体(camelbodies) 或微抗体。抗体还可以是指抗独特型抗体，即，针对抗体的序列的抗 原特异性的部分并从而识别其他抗体的结合位点的抗体；或是抗独特 型抗体，即，具有模拟用来产生原始抗体的抗原上的表位的结合位点 的抗体。产生抗体的技术是本领域公知的。

还可以构建单链抗体。例如，可以从本领域已知的单链免疫球蛋 白展示文库分离特异性结合本发明的多核苷酸表达的多肽的单链抗 体。所述文库针对多肽“淘选”，可以分离大量高亲和性结合所述多肽 的不同表位的单链抗体。Hayashi et al.,1995,Gene 160:129-30。此类 文库是已知的并且对本领域技术人员是可用的。所述抗体也可以使用 杂交瘤cDNA作为模板使用聚合酶链式反应(PCR)构建。Thirion et  al.,1996,Eur.J.Cancer Prey.5:507-11。

单链抗体可以是单或双特异性的，并且可以是二价或四价的。 Coloma和Morrison,1997,Nat.Biotechnol.15:159-63教导了四价双 特异性单链抗体的构建。Mallender和Voss,1994,J.Biol.Chem.269: 199-206教导了双价双特异性单链抗体的构建。

然后，编码单链抗体的核苷酸序列可以采用手动或自动核苷酸合 成构建、采用如上所述的标准重组DNA方法克隆进DNA表达载体， 并且引入表达所选基因的细胞。可选地，所述抗体可以直接使用丝状 噬菌体技术产生Verhaar et al.,1995,Int.J.Cancer 61:497-501； Nicholls et al.,1993.J.Immunol.Meth.165:81-91。

所述抗体特异性结合由本发明的多核苷酸表达的多肽的表位。在 优选实施方案中，表位不存在于其它人蛋白质上。编码表位的连续氨 基酸的最小数目通常是6、8或10。但是也可以采用更多，例如至少 15、25或50，尤其是形成涉及非连续的残基或特定的构象的抗原表位。

特异性结合所述多肽的抗体包括那些结合全长多肽的抗体。特异 性结合抗体不检测人细胞的免疫印迹的其它蛋白，或提供比本发明的 靶蛋白所提供的信号低至少十倍的信号。具有该特异性的抗体可以通 过常规筛选获得。在本发明优选的实施方案中，所述抗体将本发明的 多核苷酸表达多肽从细胞提取物或溶液中免疫沉淀。另外，所述抗体 可以与在组织切片中或聚丙烯酰胺凝胶的免疫印迹上的本发明的多核 苷酸表达的多肽反应。优选地，所述抗体不表现出与Western印迹或 免疫细胞化学分析的其它人蛋白的非特异性的交叉反应性。

用于纯化针对本发明的多核苷酸表达的多肽的抗体的技术是本领 域可用的。在优选的实施方案中，将所述抗体通过柱子，本发明的多 核苷酸表达的特定蛋白或多肽结合到柱上。然后，例如用具有高盐浓 度的缓冲液洗脱所结合的抗体。

突变的检测

在另一个方面，本发明涉及检测在样品(例如来自癌症患者的生 物样品)中突变体C-RAF多肽存在的方法。各种筛选方法可用于检 测样品(例如，核酸和/或蛋白样品)中的本发明的突变体C-RAF多 肽的存在。在具体实施方案中，所述样品包括细胞或细胞提取物。在 示例性实施方案中，所述样品从受试者(例如患有癌症的受试者)获 得。

用于检测含有编码C-RAF多肽或其生物学活性部分的序列的基 因组DNA、cDNA和RNA(即mRNA)中抗性突变存在的方法可以 在本发明的范围内使用。同样，用于检测在C-RAF多肽或其生物学 活性部分中抗性突变存在的方法，可以在本发明的范围内使用。在具 体的实施方案中，方法包括，但不限于，以下可以用于检测与野生型 C-RAF多肽(SEQ ID NO:2)相比具有位于一个或多个氨基酸位置的 突变的C-RAF多肽或编码C-RAF多肽的核酸分子的存在。在一些实 施方案中，针对突变体C-RAF多肽的抗体可以用于检测突变体多肽 的存在。

可以采用任何合适的本领域已知的方法检测点突变，包括，例如， 变性梯度凝胶电泳(“DGGE”)、限制性片段长度多态性分析 (“RFLP”)、化学或酶裂解法、通过PCR扩增的靶区域的直接测序 (参见上文)、单链构象多态性分析(“SSCP”)、聚合酶链式反应、 测序、杂交或“杂交捕获”后焦磷酸测序或单分子测序。还可以使用本 领域技术人员已知的用于检测突变的其它方法。

筛选方法可用来对个体的上述鉴定的突变的发生进行筛选。例如， 在一个实施方案中，从患者取出样品(例如血或其它体液或细胞或组 织样品)进行分析。在示例性实施方案中，所述患者是癌症患者。适 于处理这些样品以检测C-RAF合适或C-RAF多肽中的突变的方法是 现有技术已知的，并且本领域技术人员可以针对所选择的检测方法适 应性调整这些样品的处理。

本文所述的一个或多个突变的存在或不存在确定所筛选个体抗 RAF抑制剂治疗的可能性。根据本发明提供的方法，这些结果将会用 于调整和/或改变所述RAF抑制剂的剂量，或选择使用第二抑制剂的 疗程。在一些实施方案中，所述第二抑制剂可以是MEK抑制剂。患 有癌症的受试者的有效治疗可以包括癌细胞的消灭、癌症(例如实体 瘤)生长速率的停止或降低或至少一种癌症症状的改善。

C-RAF多肽或编码C-RAF多肽的核酸分子中的抗性突变可采用 本领域中已知的任何合适的方法或其改进来检测，包括下面描述的方 法。这些方法包括采用等位基因特异性聚合酶链式反应、该位点的直 接或间接测序、采用所述位点的各等位基因创造或消除限制性位点的 限制性酶、采用等位基因特异性杂交探针、采用特异性针对突变体 C-RAF多肽的抗体或任何其它生化解释。

对靶向治疗具有抗性的诊断/预后标志物

在一些方面，本发明涉及检测样品(例如来自癌症患者的生物样 品)中一种或多种诊断或预后标志物的存在的方法。本领域技术人员 已知的各种筛选方法可用于检测在所述样品中所述标志物的存在，包 括DNA、RNA和蛋白检测。该技术可用于确定获取自患者的样品中 突变的存在或不存在。在一些实施方案中，所述患者可以有先天或获 得性对激酶靶向治疗的抗性，包括B-RAF抑制剂或泛-RAF (pan-RAF)抑制剂。例如，所述患者可以有对下述RAF抑制剂先天 或获得性抗性：PLX4720和/或PLX4032和/或(S)-甲基1-(4-(3-(5-氯 -2-氟-3-(甲基磺酰氨基)苯基)-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)嘧啶-2-基氨基) 丙-2-基氨基甲酸酯。在一个实施方案中，本发明所述的含有获取自患 者的样品的癌症细胞中的包括一个或多个突变的C-RAF核酸或多肽 的鉴定表明所述患者处于复发的高风险的状态或对RAF抑制剂的治 疗缺乏响应。上述在患者中的一个或多个C-RAF突变的鉴定协助医 生确定和实施对患者的治疗方案。例如，在上述鉴定的所述C-RAF 多肽中具有一个或多个突变的患者中，医生可以采用如下详细描述的 联合治疗方法治疗所述患者。

在所述C-RAF多肽中抗性突变的鉴定还允许对患有癌症的患者 进行筛选以确定所述癌症中一个或多个氨基酸位置的C-RAF抗性突 变的存在或不存在。确定在癌症中一个或多个C-RAF抗性突变的存 在或不存在允许改变癌症患者的治疗策略。例如，这些改变包括开始 或停止用RAF抑制剂或MEK抑制剂治疗、给予联合治疗、提供RAF 抑制剂和第二抑制剂的顺次给药等等。

在一些实施方案中，所述RAF抗性突变可以在具有C-RAF活性 的编码突变体C-RAF多肽的核酸中鉴定，其中与SEQ ID NO:2所示 的野生型C-RAF多肽相比所述突变体C-RAF多肽包括至少一个氨基 酸取代并且其中所述至少一个氨基酸取代赋予对表达所述突变体 RAF多肽的细胞上的一种或多种RAF抑制剂的抗性。在一些实施方 案中，所述RAF抗性突变可以在具有C-RAF活性的突变体C-RAF 多肽中鉴定，其中与SEQ ID NO:2所示的野生型C-RAF多肽相比所 述突变体C-RAF多肽包括至少一个氨基酸取代，并且其中所述至少 一个氨基酸取代赋予对表达所述突变体C-RAF多肽的细胞上的一种 或多种RAF抑制剂的抗性。在一些实施方案中，赋予对RAF抑制剂 抗性的所述取代位于以下野生型C-RAF多肽的一个或多个氨基酸， 包括：104E、257S、261P、356G、361G、427S、447D、469M、478E 和554R。在一些实施方案中，所述野生型C-RAF多肽的一个或多个 氨基酸的所述取代选自以下组：104E>K、257S>P、261P>T、356G>E、 361G>A、427S>T、447D>N、469M>I、478E>K和554R>K。在一些 实施方案中，所述野生型C-RAF多肽的一个或多个氨基酸的所述取 代选自以下组：257S、261P和361G。

治疗方法

在各种实施方案中，本发明提供用于治疗患有癌症的患者的方法。 所述方法一般包含第一抑制剂和第二抑制剂的给药。一种抑制剂可以 是RAF抑制剂。示例性RAF抑制剂显示于上表1中。一种抑制剂可 以是MEK抑制剂(参见示出示例性的MEK抑制剂的表2)。在一些 实施方案中，提供癌症的联合疗法，包含有效量的RAF抑制剂和有效 量的第二抑制剂。在一些实施方案中，所述第二抑制剂是MEK抑制 剂。

在上述方面的示例性的实施方案中，本发明提供的所述RAF抑 制剂是PLX4720、PLX4032、BAY 43-9006(索拉非尼)、ZM 336372、 RAF 265、AAL-881、LBT-613、(S)-甲基1-(4-(3-(5-氯-2-氟-3-(甲基 磺酰氨基)苯基)-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)嘧啶-2-基氨基)丙-2-基氨基甲 酸酯或CJS352。有效用于联合治疗的其它示例性RAF抑制剂包括泛 -RAF抑制剂、B-RAF的抑制剂、A-RAF的抑制剂、RAF-1的抑制剂。 还可以使用本领域已知的其它RAF抑制剂。

作为非限制性的例子，本发明所提供的所述MEK抑制剂可以是 CI-1040、AZD6244、PD318088、PD98059、PD334581、RDEA119、 6-甲氧基-7-(3-吗啉-4-基-丙氧基)-4-(4-苯氧基-苯氨基)-喹啉-3-腈和 4-[3-氯-4-(1-甲基-1H-咪唑-2-基磺酰基)-苯氨基]-6-甲氧基-7-(3-吗啉 -4-基-丙氧基)-喹啉-3-腈、罗氏(Roche)化合物RG7420或其组合。 还可以使用本领域已知的其它MEK抑制剂。

组合给药包括以单一制剂或单位剂型组合给药、该组合的单个试 剂同时但分别给药或该组合的单个试剂顺次通过任何合适的途径的给 药。该组合的单个试剂的剂量可能要求试剂之一与该组合中的其它试 剂相比给药频率更高。因此，为了运行合适的给药，包装的药物产品 可以包含一种或多种含有药剂(agent)组合的剂型，以及一种或多种 含有药剂组合之一但不是组合的其它药剂的剂型。

药剂可以包含诸如立体中心或手性轴的一个或多个不对称元素， 例如不对称的碳原子，这样该化合物可以以不同的立体异构形式存在。 例如，这些化合物可以是外消旋体或光学活性形式。对于具有两个或 多个不对称元素的化合物，这些化合物还可以是非对映异构体的混合 物。应当理解的是，对于具有不对称中心的化合物，所有的光学异构 体及其混合物均被涵盖。此外，带有碳-碳双键的化合物可以发生Z- 和E-形式；所述化合物的所有异构体形式都包括在本发明中。在这些 情况下，单一对映异构体(光学活性形式)可以通过不对称合成、从 光学纯的前体合成或者通过拆分外消旋体来获得。例如，外消旋体的 拆分也可以通过常规方法例如在拆分试剂存在下结晶或采用例如手性 HPLC柱的色谱法来完成。

除非另外指明，或者由文本清楚地表明，所引用的本发明的联合 治疗中有用的化合物包括化合物的游离碱和化合物的所有药学上可接 受的盐。优选的盐是盐酸盐。

术语“药学上可接受的盐”包括所公开的化合物的衍生物，其中母 体化合物通过制备其无毒性的酸或碱加成盐的方法改性，并进一步指 药学上可接受的溶剂合物，包括此类化合物和此类盐的水合物。药学 上可接受的盐的例子包括，但不限于，碱性残基诸如胺的矿物或有机 酸加成盐；酸性残基如羧酸的碱金属盐或有机加成盐等，以及包含前 述一种或多种盐的组合。所述药学上可接受的盐包括例如从无毒性无 机酸或有机酸形成的母体化合物的无毒性盐和季铵盐。例如，无毒性 酸的盐包括从无机酸(例如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸和 硝酸)衍生的盐；其它可接受的无机盐包括金属盐例如钠盐、钾盐和 铯盐；以及碱土金属盐，如钙盐和镁盐；以及包含前述一种或多种盐 的组合。

药学上可接受的有机盐包括由有机酸如乙酸、三氟乙酸、丙酸、 琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血 酸、双羟萘酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水 杨酸、甲磺酸(mesylic)、乙磺酸、苯磺酸、对氨基苯磺酸、2-乙酰 氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸(methanesulfonic)、乙烷 二磺酸、草酸、羟乙磺酸、HOOC(CH₂)_nCOOH，其中n是0-4制 得的盐；有机胺盐如三乙胺盐、吡啶盐、甲基吡啶盐、乙醇胺盐、三 乙醇胺盐、二环己胺盐、N,N'-二苄基乙二胺盐；以及氨基酸盐如精氨 酸盐、天冬酰胺酸盐和谷氨酸盐，以及包含前述一种或多种盐的组合。

药剂组合的“有效量”是这样的量，以所述组合处理，其量足以提 供相对于所述疾病的基线临床上可观察的迹象和症状的可观察到的改 善。

药物制品可通过口服或其他形式，例如，直肠或肠胃外注射给药。 “口服剂型”是指包括处方或旨在用于口服给药的单位剂型。口服剂型 可以或可以不包括多个子单元，诸如，微胶囊或微片，以单剂量给药 包装。

药物制品可以以各种形式释放。“可释放的形式”是指包括瞬时释 放、立即释放、控制释放和持续释放的形式。

“瞬时释放”是指包括设计通过修饰活性剂的正常晶型以获得更快 速溶解以确保活性剂的快速释放的剂型。

“立即释放”是指包括常规或未经修饰的释放形式，其中大于或等 于大约50％或更优选大约75％的活性剂在给药的两小时内释放，优选 在给药的一小时内。

“持续释放”或“延迟释放”包括活性剂以这样的速率释放：血液(例 如血浆)水平在给药后处于稳态维持在治疗范围内但低于毒性水平至 少大约8小时，优选至少约12小时，更优选大约24小时。术语“稳态” 指给定活性剂或活性剂组合的血浆水平已经达到并以后续活性剂剂量 维持于处于或高于给定活性剂的最小有效治疗水平的水平并且低于给 定活性剂的最小毒性血浆水平。

本发明所使用的术语“治疗”是指舒缓、减轻或缓解受试者疾病的 至少一种症状。例如，治疗可以是疾病的一种或几种症状减弱或是疾 病(如癌症)的完全根除。在本发明的含义内，术语“治疗”也表示阻 止、延缓其发作(即疾病的临床表现之前的时期)和/或降低疾病发展 或恶化的风险。本发明的术语“保护”是用于指防止延迟或治疗，或全 部，作为适当的，受试者中疾病的发展或持续或加重。在本发明的含 义内，所述疾病与癌症相关。

术语“受试者”或“患者”是指包括动物，其能够患有或被癌症或任 何直接或间接涉及癌症的疾病所折磨。受试者的实例包括哺乳动物， 例如人、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基 因非人动物。在某些实施方案中，所述受试者是人，例如患有、有风 险患有或潜在能够患有癌症的人。

术语“大约”或“约”通常指给定值或范围的20％以内，更优选地 10％以内，以及最优选还是在5％以内。可选地，尤其是在生物学系 统中，术语“大约”指给定值的大约一个对数(即一个数量级)以内， 优选在给定值的2倍以内。

术语“一个”和“一种”以及“所述”和类似的指代的使用在描述(特 别是在以下权利要求的上下文中)的本发明的上下文中，被解释为既 包括单数和复数，除非在此另有说明或与上下文明显矛盾。除非另有 说明，术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应当被解释为开放式术 语(即指“包括，但不限于”)。本发明的数值范围的描述仅旨在用作 单独提及每一个落在该范围内单独的值的速记法，除非本发明另有说 明，并且每个单独的值的范围被并入说明书中，如同其在本发明中单 独列举一样。

如上所述，在一个方面，本发明提供了一种在受试者中包括对受 试者给予联合治疗、包括有效量的RAF抑制剂和第二抑制剂从而有效 用于治疗、预防、阻止、延缓癌症的发作和/或降低癌症发展的危险或 逆转癌症的至少一种症状。在一些实施方案中，所述第二抑制剂是 MEK抑制剂。优选地，这些抑制剂以治疗有效剂量给药，当联合使 用时，其提供有益效果。所述给药可以是同时的或顺次的。

本发明的术语“癌症”是用于指广谱肿瘤，包括所有实体瘤和血液 系统恶性肿瘤。这些肿瘤的例子包括但不限于白血病、淋巴瘤、骨髓 瘤、癌、转移性癌、肉瘤、腺瘤、神经系统的癌症和泌尿生殖器癌症。 在示例性实施方案中，上述方法可有效用于治疗成人和小儿急性淋巴 细胞白血病、急性髓细胞性白血病、肾上腺皮质癌、艾滋病相关的癌 症、肛门癌、阑尾癌、星形细胞癌、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、 骨癌、骨肉瘤、纤维组织细胞瘤、脑肿瘤、脑干神经胶质瘤、小脑星 形细胞瘤、恶性胶质瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、幕上原始神经外胚 层瘤、下丘脑神经胶质瘤、乳腺癌、男性乳腺癌、支气管腺瘤、伯基 特淋巴瘤、类癌肿瘤、来源不明的癌、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星 形细胞瘤、恶性胶质瘤、宫颈癌、儿童癌症、慢性淋巴细胞白血病、 慢性髓细胞性白血病、慢性骨髓增生性疾病、大肠癌、皮肤T细胞淋 巴瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤因家族肿瘤、颅外生殖细 胞瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆道癌、眼内黑素瘤、视网膜母细 胞瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道间质瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖 细胞瘤、卵巢生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、胶质瘤、毛细胞白 血病、头颈癌、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、下咽癌、 下丘脑和视觉通路胶质瘤、眼内黑素瘤、胰岛细胞瘤、卡波西肉瘤、 肾癌、肾细胞癌、喉癌、唇和口腔癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、 原发性中枢神经系统淋巴瘤、瓦尔登斯特巨球蛋白血症、恶性纤维组 织细胞瘤、髓母细胞瘤、黑素瘤、默克尔(Merkel)细胞癌、恶性间 皮瘤、鳞状颈癌、多发性内分泌肿瘤综合征、多发性骨髓瘤、蕈样肉 芽肿、骨髓增生异常综合征、骨髓增生性疾病、慢性骨髓增生性疾病、 鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口咽癌、卵巢癌、胰腺癌、 甲状腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、成松果体细胞瘤和幕上原始 神经外胚层肿瘤、垂体癌、浆细胞肿瘤、胸膜肺母细胞瘤、前列腺癌、 直肠癌、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、软组织肉瘤、子宫肉瘤、塞扎里综 合征、非黑素瘤皮肤癌、小肠癌、鳞状细胞癌、鳞状颈癌、幕上原始 神经外胚层肿瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、移 行细胞癌、滋养细胞肿瘤、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外 阴癌、以及肾母细胞瘤。

具体地，所述癌症可以与B-RAF基因中的突变相关。在一些实施 方案中，所述癌症可以是RAF依赖的癌症。这些癌症包括但不限于黑 素瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、神经胶质瘤、肺癌、卵巢癌、肉瘤和甲 状腺癌。

在具体的实施方案中，本发明提供的治疗组合有效用于治疗受试 者的中度至重度的癌症。

剂量

用于癌症治疗的药剂组合的最适剂量可以根据经验使用已知的方 法对受试者确定并将取决于多种因素，包括药剂的活性；受试者的年 龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；给药的时间和路径；以及受 试者服用的其它药物。最适剂量可通过在本领域中熟知的常规试验和 方法来建立。

可与载体材料组合以生产单个剂型的药剂组合的量将根据所治疗 的个体和特定给药模式而变化。在一些实施方案中，包含本发明所述 的药剂组合的单位剂型将包含被典型地给药、药剂单独给药时的组合 的每种药剂的量。

具有本领域普通技术的医生或兽医可以很容易地确定并开出所需 的药物组合物的有效量。例如，医生或兽医可以从本发明所采用的药 物组合物中的化合物剂量水平低于为了获得所期望的治疗效果所需的 剂量开始并逐步增加剂量直到获得所期望的效果。

通常，本发明的化合物的合适的日剂量将是有效产生治疗效果的 最低剂量的化合物的量。该有效剂量将通常取决于上述因素并且很容 易由本领域技术人员确定。

通常，本发明的用于患者的治疗有效剂量的化合物，用于所示的 镇痛效果时，其范围会是每天每千克体重大约0.0001-大约1000mg， 更优选每天每千克大约0.01-大约50mg。

如果需要，有效日剂量的活性化合物可以以适当的间隔在整个白 天以两个、三个、四个、五个、六个或更多个分别给药的分剂量给药， 任选，以单位剂型。

药物制剂和给药途径

本发明提供的是包含用于癌症(例如黑素瘤)治疗的药剂组合的 药物制剂。所述药物制剂还可以包含载体或赋形剂、稳定剂、矫味剂 和/或着色剂。

本发明提供的是包含药剂组合的药物制剂，例如所述组合可以是 两种试剂的组合：(1)RAF抑制剂和/或所述抑制剂的药理学活性的 代谢物、盐、溶剂化物和外消旋体以及(2)MEK抑制剂和/或所述 MEK抑制剂的药理学活性的代谢物、盐、溶剂化物和外消旋体。

所述药剂组合可以采用本领域技术人员已知的各种给药路径给 药。所述药剂组合可以通过以下所期望的方式对人和其它动物给药： 口服、肠胃外、舌下、通过雾化或吸入喷雾、直肠、脑池内、阴道内、 腹膜内、经颊或局部，以含有常规无毒性药学上可接受的载体、助剂 和赋形剂的剂量单位形式。局部给药还可以包括采用透皮给药，例如 透皮贴剂或电离子透入装置。本发明所使用的术语肠胃外包括皮下注 射、静脉注射、肌肉注射、胸骨内注射或输注技术。

制剂方法是本领域公知的，并且在例如Remington:The Science  and Practice of Pharmacy,Mack Publishing Company,Easton,Pa., 19th Edition(1995)中公开。对于本发明中使用的药物组合物可以是无 菌、无热原的液体溶液或悬浮液，包衣胶囊，栓剂，冷冻干燥粉末， 透皮贴剂或本领域已知的其他形式的形式。

可注射的制剂，例如，无菌可注射的水性或油性悬液可根据已知 技术采用合适的分散或润湿剂和悬浮剂来配制。该无菌可注射的制剂 还可以是在无毒性肠胃外可接受的稀释剂或溶剂(例如，如在1,3丙 二醇或1,3丁二醇中的溶液)中的无菌可注射的溶液、悬液或乳液。 在可以使用的可接受的载体和溶剂中有水、林格氏溶液、U.S.P.和等 渗氯化钠溶液。此外，无菌、不挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。 为此，任何温和的固定油都可以使用，包括合成的单或二甘油酯。此 外，脂肪酸如油酸可以用于注射剂的制备中使用。可注射的制剂可以 进行灭菌，例如，通过细菌截留过滤器过滤，或以无菌固体组合物的 形式通过引入灭菌剂，所述无菌固体组合物在使用前可以被溶解于或 分散于无菌水或其它无菌可注射介质。

为了延长药物的效果，通常期望自皮下或肌肉注射以减慢药物吸 收。这可以通过利用水溶性差的晶体或无定形材料的液体悬液来实现。 药物的吸收速率取决于其溶解速度，这反过来又可能取决于晶体大小 和晶型。可选地，肠胃外给药的药物形式的延迟吸收可通过于油性载 体中溶解或悬浮药物来实现。可注射的贮存形式可以通过在可生物降 解的聚合物如聚交酯聚乙交酯中形成药物的微囊基质制得。根据药物 与聚合物的比例和所用特定聚合物的性质，药物释放的速率是可以控 制的。其它可生物降解聚合物的例子包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。 贮存可注射制剂还可通过将与身体组织相容的药物包埋在脂质体或微 乳液中制备。

用于直肠或阴道给药的组合物优选栓剂，其可通过将本发明的化 合物与合适的无刺激性赋形剂或载体如可可脂，聚乙二醇或栓剂用蜡 混合进行制备，它们在环境温度下是固体而在体温下为液体并且因此 在直肠中或阴道腔中融化并释放出活性化合物。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、粉剂和颗粒 剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种惰性、药学上可接受 的赋形剂或载体如柠檬酸钠或磷酸氢钙和/或以下物质混合：a)填充 剂或膨胀剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸，b)粘 合剂，如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿 拉伯胶，c)湿润剂如甘油，d)崩解剂如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木 薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠，e)溶液阻滞剂，如石蜡，f) 吸收促进剂如季铵化合物，g)润湿剂，如乙酰基醇和甘油单硬脂酸酯， h)吸收剂，例如高岭土和膨润土，以及i)润滑剂如滑石粉、硬脂酸 钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠，及其混合物。在胶囊、 片剂和丸剂的情况下，所述剂型还可以包含缓冲剂。

相似类型的固体组合物也可在软和硬填充明胶胶囊中使用这些赋 形剂如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等用作填充剂。

片剂、锭剂、胶囊、丸剂和颗粒剂的固体剂型可以用包衣和例如 肠溶衣以及其它包衣的药物制剂领域中公知的壳制备。它们可以任选 含有遮光剂，也可以是它们仅在或优先在肠道的某一部分中任选地以 延迟方式释放活性成分的组合物。可以使用的包埋组合物的例子包括 聚合物质和蜡。

活性化合物也可以是如上所述的带有一种或多种赋形剂的微囊化 形式。片剂、锭剂、胶囊、丸剂和颗粒剂的固体剂型可以用包衣和例 如肠溶包衣、控释包衣以及其它包衣的药物制剂领域中公知的壳制备。 在这些固体剂型中，活性化合物可以与至少一种惰性稀释剂如蔗糖、 乳糖或淀粉混合。这些剂型还可包括，在正常情况下，除惰性稀释剂 之外的其它物质，例如压片润滑剂和其他压片助剂，例如硬脂酸镁以 及微晶纤维素。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，所述剂型也可以包含 缓冲剂。它们可以任选含有遮光剂，也可以是它们仅在或优先在肠道 的某一部分中任选地以延迟方式释放活性成分的组合物。可以使用的 包埋组合物的例子包括聚合物质和蜡。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶 液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。除了活性化合物外，液体剂型可含有 在本领域中常用的惰性稀释剂，例如，水或其它溶剂、增溶剂和乳化 剂例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙 二醇、1,3丁二醇、二甲基甲酰胺、油(尤其是棉籽油、花生油、玉米 油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二 醇以及脱水山梨醇的脂肪酸酯，及其混合物。除惰性稀释剂外，口服 组合物还可以包括助剂如润湿剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、调味剂 和芳香剂。

用于本发明的化合物的局部或透皮给药的剂型包括软膏剂、糊剂、 霜剂、洗剂、凝胶剂、粉剂、溶液剂、喷雾剂、吸入剂或贴剂。将活 性组分在无菌条件下与药学上可接受的载体和任何需要的防腐剂或可 能需要的缓冲剂混合。眼科制剂、滴耳剂等也被涵盖在本发明的范围 之内。

除本发明的活性化合物，软膏剂、糊剂、乳膏剂和凝胶剂可以含 有赋形剂如动物和植物脂肪、油类、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维 素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石粉以及氧化锌、或 其混合物。

本发明的组合物也可以配制成用于递送的液体气溶胶或可吸入的 干粉。液体气溶胶制剂可主要雾化成可以传递给最终呼吸性细支气管 的颗粒大小。

本发明的气溶胶制剂可使用一种气溶胶形成装置，如喷嘴、振动 多孔板或超声雾化器递送，优选选择以允许质量中等平均直径主要介 于1-5μm的气溶胶粒子的形成。此外，该制剂优选具有平衡渗透压离 子强度和氯化物浓度，以及能够对感染的部位递送有效剂量的本发明 化合物的最小的可雾化体积。此外，该气溶胶制剂优选不消极损害气 道的功能，并且不会引起不希望的副作用。

适合用于本发明的气溶胶制剂给药的雾化装置包括，例如，喷嘴、 振动多孔板、超声波雾化器以及赋能干粉吸入器，其能够雾化本发明 的制剂成尺寸大部分地在1-5μm的气溶胶粒径。本申请的“大部分地” 指所有产生的气溶胶粒子的至少70％但优选大于90％在1-5μm范围 内。喷嘴喷雾器的工作原理是通过空气压力打破液体溶液雾化成气溶 胶液滴。振动多孔板的工作原理是利用迅速振动的多孔板产生的音速 真空，将溶剂液滴挤出通过多孔板。超声波喷雾器的工作原理是通过 压电晶体将液体剪切成小的气溶胶液滴。许多合适的装置都能购得， 包括，例如，AERONEB和AERODOSE振动多孔板喷雾器(AeroGen, Inc.,Sunnyvale,California)，侧流喷雾器(Medic Aid Ltd.,West  Sussex,England)，PARI LC和PARI LC STAR喷嘴喷雾器(Pari  Respiratory Equipment,Inc.,Richmond,Virginia)，以及 AEROSONIC(DeVilbiss Medizinische Produkte(Deutschland) GmbH,Heiden,Germany)和ULTRAAIRE(Omron Healthcare,Inc., Vernon Hills,Illinois)超声波喷雾器。

本发明化合物还可以配制成局部用的粉剂和喷雾，它们除包含本 发明化合物外，可包含赋形剂如乳糖、滑石粉、硅酸、氢氧化铝、硅 酸钙和聚酰胺粉，或这些物质的混合物。喷雾还可以含有常用的推进 剂如氯氟烃。

透皮贴片还具有的优点是能提供化合物向机体的受控传递。这种 剂型可以通过将化合物溶解或分散在合适的介质中制备。也可以用吸 收增强剂来提高化合物通过皮肤的进入量。其速度可由控速膜控制或 通过将该化合物分散在聚合物基质或凝胶中来控制。本发明的化合物 也可以以脂质体的形式给药。如本领域已知的，脂质体通常衍生自磷 脂或其它脂质物质。脂质体是由分散在水性介质中的单或多层层状水 合液晶形成的。可以使用能够形成脂质体的任何无毒性的、生理学上 可接受以及可代谢的脂类。除了本发明的化合物之外，本发明脂质体 形式的组合物可以包含稳定剂、防腐剂、赋形剂等。优选的脂质是磷 脂以及磷脂酰胆碱(卵磷脂)，包括天然的和合成的。形成脂质体的 方法是本领域已知的。例如，参见Prescott(编者),"Methods in Cell  Biology,"Volume XIV,Academic Press,New York,1976,p.33及以 下。

实施例

实施例1：CRAF抗性突变的体外识别和表征

为了鉴定赋予对RAF抑制剂抗性的体细胞RAF突变，饱和随机 诱变筛选采用XL1-Red细菌系统和表达C-RAF的cDNA的逆转录病 毒载体进行(Emery et al.,Id.2009,Wagle et al.,Id.2011)。所得到 CRAF突变的随机诱变饱和cDNA文库表达于携带BRAF^V600E突变的 A375黑素瘤细胞，所述BRAF^V600E突变对RAF抑制剂高度敏感(Li et  al.,2007；Tsai et al.,2008,Emery et al.,Id.2009)。在全抑制剂浓度的 PLX4720(1.5μM)存在下培养这些细胞4周并且收集所出现的抗性 克隆并通过大规模并行测序表征(Emery et al.,Id.2009,Wagle et al., Id.2011)。检查的所有C-RAF突变(图1A)可稳定表达于A375细 胞。(图9A)。另外，10个最突出的C-RAF突变的8个赋予了在 A375细胞中对RAF抑制剂PLX4720的生化抗性，如p-MEK和p-ERK 水平所证明的(图9B)。这些等位基因之一(CRAF^G361A)赋予了在 高PLX4720浓度时p-MEK的大量“反常(paradoxical)”激活(图9B)。

通过筛选得到的CRAF突变被映射(mapped)到CRAF激酶结 构域的晶体结构(340-618)(Hatzivassiliou et al.,2010)(PDB编号: 30MV)(图1B)。所述突变的三个没有被映射，因为迄今为止还没 有解析CRAF的全长结构。CRAF抗性等位基因群集集向(clustered  towards)两个不同的区域，即调节区(N-末端)外部或内部和激酶结 构域(C-末端)中(图1C)。CRAF由两个14-3-3共有结合位点组 成并且抗性等位基因的两个，S257P和P261T，占据了在CR2区中的 14-3-3共有结合位点之一，而E104K等位基因在CR1区中(图1B)。

第二类抗性等位基因涵盖激酶结构域，包括富含甘氨酸的环。如 G356E和G361A的突变见于ATP-结合P-环、GxGxxG基序的甘氨酸 残基。已经在若干蛋白激酶中发现P-环突变(Christopher et al., 2007)，包括通过激活Mek具有细胞转化能力的BRAF(Wan et al.,Cell 116:855-867,2004；Garnett et al.,Id.2005)。突变的其他子集(S427T、 D447N、M469I、E478K和R554K)位于活化区段外(图1B)。

实施例2：C-RAF抗性突变体的功能表征。

为了研究所鉴定的C-RAF抗性等位基因的功能作用，代表性的突 变(图1A)引入并在A375黑素瘤细胞中表达。用Raf抑制剂处理之 后进行生化分析，在A375细胞和WT-C-RAF表达细胞中PLX4720 在2μM的浓度减弱Mek磷酸化(pMek)和Erk磷酸化(pErk)(图 2A)。然而，抗性等位基因在相同(图2A)的浓度下显示出持续的 pMek和pErk。此外，群集朝向14-3-3结合区域(S257P和P261T) 的抗性等位基因和在ATP结合区域的一个抗性等位基因，尤其是 G361A，赋予对PLX4720深远的药理抗性。与WT(0.4μM)相比， 这些突变提将PLX4720的GI₅₀值提高～100倍(S257P和P261T)和 30倍(G361A)(图2C)。此外，C-Raf的稳定性已经与S259和S621 的磷酸化相关(图1C)并且随后的14-3-3结合和C-RAF的激活已经 与S338和S621残基的磷酸化相关(图1C)(Wellbrock et al.,Id. 2004)。PLX4720诱导S338的磷酸化以及S621的适度增加，尤其 在S257P、P261T和G361A抗性突变体中，这与这些变体中pMek 的反常激活一致(图2B)。MEK/ERK信号传导的该C-RAF激活被 药理学MEK抑制所抑制(图2G)。表达WT的细胞显示S338但不 是S621的适度增加。相反，S259位点在基础条件下是磷酸化的并且 WT-C-RAF的异位表达在不存在PLX4720的情况下加剧该效应(图 2B)。但是，PLX4720也在抗性突变体中诱导S259的磷酸化，但相 比之下，这些突变体表现出较低的S259磷酸化水平(图2B)，但该 效应在存在AZD6244的情况下减弱，伴随减少的pErk水平(图2E)。 由于C-RAF被高度调节并由磷酸化激活，这些数据显示存在反馈激 活和抑制环路，其持续作用，维持MAPK信号输出的稳健性和严格性。 因此，所述C-RAF抗性等位基因的活性可能通过在由提供活性的位 点(S338、S621)和提供抑制性的位点(S259)获得的磷酸化的量之 间的平衡来进行调节。只有一个等位基因(G361A)赋予对MEK抑 制的药理学抗性的证据(图2F和2G)。

实施例3：C-RAF抗性突变体显示与B-RAF增加的关联。

以上累积数据显示涵盖14-3-3共有结合位点(S257P和P261T) 和ATP结合区域(G361A)的抗性等位基因(图1C)因为降低的磷 酸化MEK和ERK的抑制而赋予抗性。另外，已经表明，S259/S621A 的双突变体完全废除C-RAF和14-3-3之间的相互作用，而不会影响 与RAS或MEK的相互作用(Tzivion et al.,Nature 394:88-92,1998)。 为了探讨其作用机制，我们免疫沉淀了来自异位表达在最初的筛选过 程中鉴定的所有抗性基因的293/T细胞的C-RAF。当与WT比较时， 降低与14-3-3的相互作用并提高与B-RAF的相互作用的突变维持更 高的MEK和ERK磷酸化状态(图3A)并且还在体外提高C-RAF 激酶活性(数据未显示)。这些结果证实了14-3-3和B-RAF在表达 C-RAF等位基因的A375细胞中的相互作用状态(图3B)。因此，这 些抗性突变体具有较高的针对其底物的活性，甚至是在不存在诸如 Ras的致癌驱动基因的情况下也是如此(Weber et al.,2001)。

实施例4：采用(S)-甲基1-(4-(3-(5-氯-2-氟-3-(甲基磺酰氨基)苯 基)-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)嘧啶-2-基氨基)丙-2-基氨基甲酸酯的 C-RAF抗性等位基因的生化表征

为了排除PLX4720对抗性突变体的无效结合的可能性，检查了突 变体C-RAF对(S)-甲基1-(4-(3-(5-氯-2-氟-3-(甲基磺酰氨基)苯基)-1- 异丙基-1H-吡唑-4-基)嘧啶-2-基氨基)丙-2-基氨基甲酸酯(Novartis) 在A375细胞和表达WT-C-RAF的细胞中的应答(图3C)。C-RAF 抗性等位基因(S257P、P261T)分别提高(S)-甲基1-(4-(3-(5-氯-2- 氟-3-(甲基磺酰氨基)苯基)-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)嘧啶-2-基氨基)丙 -2-基氨基甲酸酯的GI50值～10,000和～30,000倍并且G361A提高该 值20倍(图3C)。如图2C和E中所观察到的，对PLX4720和AZD6244 的应答保持相同(图3B和D)。此外，所述C-RAF抗性突变体甚至 在1μM的浓度赋予生化上对(S)-甲基1-(4-(3-(5-氯-2-氟-3-(甲基磺酰 氨基)苯基)-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)嘧啶-2-基氨基)丙-2-基氨基甲酸酯 的抗性(图3A)。

实施例5：C-RAF抗性突变体赋予对威罗菲尼(PLX4032)的抗 性。

威罗菲尼对BRAF^V600E突变高度应答但导致Mek和Erk在表达致 癌基因Ras的细胞中反常激活(Hatzivassiliou et al.,2010；Heidorn et  al.,2010；Poulikakos et al.,2010)。检测C-RAF抗性等位基因以确 定所述C-RAF抗性等位基因在致癌基因B-RAF存在下是否对威罗菲 尼显示相似的应答。表达WT-C-RAF的A375细胞(0.4μM)(图5A) 相对于PLX4720处理的WT-C-RAF细胞显示相当的GI₅₀值(图2C)。 由G361A赋予的抗性比WT的高50倍，而令人惊讶的是，S257P和 P261T显示对威罗菲尼增强的抗性。由于这些突变体甚至在不存在致 癌基因Ras的情况下赋予抗性，这进一步确定，对Raf抑制剂的抗性 是否是由于增加的活性。在存在和不存在威罗菲尼的情况下将总 C-RAF从表达所述C-RAF变体的A375细胞提取物中免疫沉淀。与 WT相比(图5B)，在药理学抑制过程中显示高抗性的突变(S257P 和P261T)(图5A)具有增强的体外激酶活性；但是G361A抗性突 变体在存在药物的情况下显示甚至更高的激酶活性(图5B)。另外， 这表明C-RAF抗性等位基因保持对于PLX4720与AZD6244的组合 治疗的敏感性(图5C、D和E)。

总之，这些数据与细胞赋予抗性仅需要最适量的Erk信号传导这 一观念相一致。

实施例6：C-RAF抗性等位基因使反常的C-RAF激活和增强的 二聚化成为可能

由RAF抑制剂诱导的反常MEK/ERK激活涉及RAF蛋白的二聚 化(Hatzivassiliou et al.,2010；Poulikakos et al.,2010)。此外，显示 增强的二聚化的截短形式的BRAF^V600E赋予对RAF抑制剂的抗性 (Poulikakos et al.,2011)。为了确定C-RAF抗性突变是否通过增强 的二聚化介导抗性，采用其中若干代表性C-RAF抗性等位基因用两 种不同表位(His/V5或Flag)进行差异标签化的表达构建体在293/T 细胞中进行共转染。采用Ni²⁺珠进行免疫沉淀反应(以捕获His标签 蛋白)，然后采用抗Flag的抗体进行免疫印迹。在这些实验中，与野 生型C-RAF相比，所有赋予对RAF抑制剂的药理学抗性的C-RAF 突变还显示增强的同源二聚化(S257P、P261T、G361A和E478K；)。 正如预期的那样，增强的二聚化通常与提高的p-MEK水平相关(图 6A，输入裂解物)。当His/V5标签的C-RAF突变体与Flag标签的 野生型C-RAF共转染时可以观察到类似的结果(图10A)，虽然MEK /ERK活化的量级从定性上看起来降低(图10A，输入裂解物)。对 PLX4720和威罗菲尼赋予最深的药理学抗性的三个C-RAF突变体 (S257P、P261T和G361A)(图2C和2F)还显示增强总蛋白积累 的证据(图6A，输入裂解物)。因此，C-RAF突变体有关的抗性表 型与RAF的二聚化强相关。

在293T细胞中(其缺乏致癌BRAF突变)，由抗性突变的存在 产生的增强的C-RAF的二聚化呈持续性，但将转染的细胞暴露给RAF 抑制剂(威罗菲尼；图6B)的情况下没有进一步增强。但是，C-RAF 激活(由S338磷酸化证实)和下游MEK/ERK信号传导均由RAF抑 制剂强有力地诱导(图6B，输入裂解物)。为了确定这些抗性突变对 固有C-RAF激酶活性的影响，在存在或不存在RAF抑制剂的情况下 从293T细胞进行体外激酶反应。在不存在药物的情况下，抗性突变 在大多数情况下并未可测量地增加稳态C-RAF激酶活性(p-MEK) (图6C)。CRAF^G361A是一个例外；这里，在相应的全细胞裂解物中 检测到与强有力的固有p-MEK水平相关的适度稳态激酶活性(图 6C)。相反，在体外激酶分析之前用2μM威罗菲尼处理293T细胞 导致在所有所检查的抗性等位基因中C-RAF激酶活性的显著上调(图 6C)。BRAF^V600E黑素瘤细胞(A375)中相似的实验显示在所检查的 三个最有效的(potent)C-RAF抗性突变体中固有激酶活性的提高 (S257P、P261T和G361A；图6D)。将这些细胞暴露于威罗菲尼后 这种激酶活性的进一步增强(图6D)，正如在293T细胞中观察到的 一样。总之，这些结果表明有效的C-RAF抗性突变体增强RAF二聚 化和RAF抑制剂介导的C-RAF激酶活性。

实施例7：C-RAF抗性突变体显示减弱的14-3-3结合和增强的 B-RAF异源二聚化

以上累积数据显示，涵盖14-3-3共有结合位点(S257P和P261T) 和P环的ATP结合区域(G361A)的C-RAF突变赋予对RAF抑制 的药理学和生化抗性，增强RAF二聚化，并且增强用RAF抑制剂处 理后的C-RAF激酶激活。为了研究14-3-3蛋白结合涉及RAF二聚化 的作用，对工程化来异位表达C-RAF抗性等位基因的细胞进行免疫 沉淀实验。为了检查药理学RAF抑制对14-3-3结合和B-RAF异源二 聚化的作用，这些实验是在不存在和存在(在这种情况下，威罗菲尼) RAF抑制的情况下进行的。在不存在RAF抑制剂的情况下，C-RAF 抗性等位基因S257P、P261T和G361A趋向于在293T细胞(图7A) 并且特别是A375(BRAF^V600E)黑素瘤细胞(图7B)中表现出与14-3-3ζ 降低的相互作用以及与B-RAF增强的相互作用。在293T细胞中，由 C-RAF突变触发的增强的C-RAF/B-RAF异源二聚化与C-RAF蛋白 稳定和强有力的MEK/ERK的磷酸化有关(图7A)。另一方面，在 BRAF^V600E黑素瘤细胞中观察到的强有力的MEK/ERK激活仅由 C-RAF抗性突变体轻微地增强(图7B)；鉴于这些细胞中的组成型 致癌B-RAF信号传导，该结果是预期的。有趣的是，C-RAF突变体 之一(G356E)在两个细胞环境中均显示非常低的14-3-3ζ结合(图 7A和7B)；但是C-RAF^G356E在稳态条件下显示没有富集的B-RAF 异源二聚化以及没有MEK/ERK信号传导的增强。这些结果显示，尽 管降低的14-3-3结合可以促进增强的突变体C-RAF二聚化，某种程 度的14-3-3结合(可能在C末端结构域范围内)是促进最大RAF依 赖信号传导所需要的。

正如所预期的，RAF抑制剂威罗菲尼诱导异位表达野生型C-RAF 的293/T细胞中B-RAF/C-RAF的异源二聚化(图7A)，但废除A375 黑素瘤细胞中的该异源二聚化(图7B)。相反，最强有力的C-RAF 抗性突变体的异位表达使得即便在存在药物的情况下在A375细胞中 也能够持续B-RAF异源二聚化(图7B)。这些结果显示BRAF^V600E呈现有利于与抗性相关C-RAF变体异源二聚化的优势构象。取决于 细胞的遗传背景，药理学RAF抑制对14-3-3/C-RAF相互作用具有可 变的影响。在A375细胞(BRAF^V600E)，威罗菲尼适度降低14-3-3ζ 对野生型C-RAF的结合，但在C-RAF^S257P、C-RAF^P261T和C-RAF^G361A突变体的背景下没有作用(图7B)。另一方面，威罗菲尼在293/T细 胞中增强这些14-3-3/C-RAF相互作用(图7A)。这些发现进一步支 持这样的假设：由这些C-RAF突变体在BRAF^V600E背景中所赋予的抗 性表型涉及增强的RAF二聚化，其与14-3-3/C-RAF相互作用减少有 关。

实施例8：由C-RAF抗性突变体增强的MEK/ERK信号传导要求 二聚化

为了检测C-RAF二聚化是否对由C-RAF抗性突变体所赋予的增 强MEK/ERK信号传导是必需的，于残基R401引入精氨酸-组氨酸突 变(C-RAF^R401H)(图10B)。之前已经显示该突变体破坏C-RAF二 聚化(Hatzivassiliou et al.,Nature 464:431-435,2010；Poulikakos et al., Nature 464:427-430,2010)。所述R401H二聚化缺陷型突变引入各自 C-RAF抗性等位基因。正如所预期的，C-RAF双突变体呈现基本上 不能获得增强的MEK/ERK信号传导(图8A)。接下来，共转染是 用差分表位标记的C-RAF抗性/R401H双突变体进行的。如早前所述， 所述C-RAF抗性等位基因以不受RAF抑制剂影响的方式增强C-RAF 二聚体(图8B)。相反，R401H等位基因的引入在大多数所检查的 C-RAF突变体背景中抑制C-RAF同源二聚化并且废除MEK/ERK信 号。C-RAF^G361A等位基因是个例外，其显示出组成型(虽然明显降低 的)MEK/ERK激活，其进一步由威罗菲尼暴露所诱导，甚至当与二 聚化缺陷型双突变体共表达时也是如此。连同上述体外激酶活性结果， 这些数据表明，所述C-RAF^G361A/R401H等位基因还可以包含提高的固有 激酶活性。总的来说，这些结果提供直接证据表明由C-RAF抗性突 变体所赋予的增强的MEK/ERK信号传导需要RAF二聚化。它们还 可以提供用于破坏RAF的二聚化界面的RAF变构抑制剂的未来发展 的原理。

方法

细胞培养

293/T细胞、A375细胞(ATCC)和Phoenix细胞(Allele Biotech) 在37℃、在补充10％胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle培养基中、 在含有5％CO₂的湿润气氛下培养并维持。

C-RAF随机诱变筛选

C-RAF cDNA通过重组克隆(Invitrogen)克隆入pWZL-Blast 载体(由J.Boehm和W.C.Hahn赠送)。采用QuickChange II定点 诱变(Stratagene)将具体突变引入c-raf cDNA。随机诱变基于已建 立的实验操作步骤完成(Emery et al.,Id.2009)。诱变的C-RAF质 粒用于感染A375黑素瘤细胞。用杀稻瘟菌素筛选后，细胞铺板到 15-cm盘中并在RAF抑制剂PLX4720(1.5μM)存在下培养4周直 到抗性克隆出现。

c-RAF DNA测序

收集从随机诱变筛选中出现的PLX4720抗性细胞并且制备基因 组DNA(Qiagen DNeasy)。采用在5'和3'末端特异于侧翼载体序列 的引物从基因组DNA扩增C-RAF cDNA并通过Sanger法采用已建立 的实验操作步骤进行测序。

大规模并行测序分析

采用“下一代”序列分析流水线(Emery et al.,PNAS,2009.)分析 来自大规模并行测序泳道的原始数据(Illumina；每泳道2–3百万36- 碱基对序列)。对于每次运行，代表核苷酸序列、每-碱基质量测量、 检测到的变体以及与cDNA参考序列的比对(如通过用ELAND算法 比对所测定的)的数据文件输出被整合并处理。对所有碱基确定覆盖 率(即包括参考cDNA的每个碱基的片段的数)，并且变体等位基因 从各DNA片段映射到参考序列上。确定每个非野生型等位基因的变 异频率，并且平均变异分数(average variant score，AVS)计算为讨 论的位置和变体等位基因的所有质量分数的平均值。翻译所有编码的 突变以确定氨基酸变异(如果有任何变异)并且高频(>0.5％)和高 质(AVS>7)突变的数据载入CCGD结果数据库。

逆转录病毒感染

采用Fugene 6(Roche)，用pWZLBlast-C-RAF或突变体转染 Phoenix细胞(70％汇合度)。包含病毒的上清液穿过0.45微米注射 器。用病毒和聚凝胺(4μg/mL，Sigma)一起感染A375细胞16小时。 感染后48h将选择性标志物杀稻瘟菌素(3μg/mL)引入。

免疫印迹分析

用PBS洗涤两次之后提取样品并在1％NP-40存在下用150mM  NaCl、50mM Tris pH 7.5、1mM EDTA、PMSF、氟化钠、原钒酸钠 和蛋白酶抑制剂混合物裂解。蛋白质含量是按照制造商的指示用蛋白 质测定试剂(Bio-Rad公司)进行测量。等量的全细胞裂解物上样于 8-16％的SDS-PAGE现成的凝胶并由其分离。蛋白质转移到转印迹装 置的聚偏二氟乙烯膜上。膜用含有0.1％吐温20、5％脱脂牛奶的TBS 室温封闭1h或4℃过夜。然后，用抗所感兴趣的蛋白的单克隆或多 克隆抗体于室温温育膜1h或4℃温育膜过夜，然后用含有0.1％吐 温20的TBS洗涤三次。一抗C-RAF、S259C-RAF、S338C-RAF、 S621C-RAF、pERK、ERK、pMEK、MEK、14-3-3ζFlag(Cell  Signaling)、B-RAF(Santa Cruz Biotechnology)和肌动蛋白(Sigma) 的免疫反应性用与辣根过氧化物酶缀合的二抗抗兔(BD Transduction  Laboratories)或抗鼠(Santa Cruz Biotechnology)抗体可视化并随 后用ECL Plus(Amersham Biosciences)显影并在X-OMAR TAR胶 片上放射自显影。扫描条带并通过Gel Doc系统采用Quantity One 软件定量。

免疫沉淀

对于采用C-RAF抗体(BD Biosciences)的免疫沉淀，蛋白G- 琼脂糖凝胶浆料(Thermo Scientific)采用1×PBS洗涤并在4℃下与 C-RAF抗体(BD Biosciences公司)或正常小鼠IgG(对照)温育1 小时。用裂解缓冲液洗涤三次之后，珠子用全细胞裂解物(0.5mg总 蛋白)孵育2h并且然后用裂解缓冲液洗涤三次。然后通过在1xSDS 样品缓冲液中煮沸而洗脱蛋白。

C-RAF激酶测试

用6μg在含有C-RAF-WT和C-RAF变体等位基因的C-末端的 His或V5标签的pc-DNA转染293T细胞(70％汇合度)。细胞用威 罗菲尼(Allele Biotech)处理1h并且转染48h后，常规操作步骤提 取裂解物。在4℃下进行使用钴珠免疫沉淀过夜1h。蛋白结合钴珠与 20μL ATP/镁的混合物(20mM Mops pH 7.2、25mMβ-甘油磷酸盐、 5mM EGTA、1mM Na₃VO₄、1mM DTT、75mM MgCl₂和0.5m  MATP)、20μL稀释缓冲液(20mM Mops,pH 7.2、25mM-甘油磷 酸盐、5mM EGTA、1mM原钒酸钠、1mM DTT)和1μg无活性 的MEK(获自Millipore)于30℃温育30min。通过免疫染色，采 用p-MEK抗体(Cell Signaling Technology)检测磷酸化的MEK产 物，并且相对p-MEK信号采用光密度计定量，用输入C-RAF的量归 一化并与作为参考的C-RAF-WT比较。

C-RAF激酶测试(A375)

感染WT和突变体C-RAF等位基因的A375细胞在不存在和存在 PLX4032(Allele Biotech)的情况下培养16h。在1％NP-40存在下 用150mM NaCl、50mM Tris pH 7.5、1mM EDTA、PMSF、氟化钠、 原钒酸钠和蛋白酶抑制剂混合物制备裂解物。用C-RAF抗体过夜进 行免疫沉淀并且结合的珠子用裂解缓冲液洗涤三次，随后通过激酶缓 冲液(1x)洗涤。珠子用20ul ATP/镁的混合物(Millipore)和0.5μg 无活性的MEK(Millipore)于30℃温育30min。通过免疫印迹检 测磷酸化的底物MEK。

药理学生长抑制分析

对于包括A375的所有黑素瘤短期培养物，将培养的细胞以每孔 3000个细胞的密度接种到96孔板。16h后，在DMSO中进行化合物 的系列稀释并且转移到细胞以获得基于药物的效力的药物浓度，确保 DMSO的最终体积不超过1％。B-RAF抑制剂PLX4720(购自 Symansis)、PLX4032(购自Allele Biotech)、AZD6244(购自Selleck  Chemicals)和GSK1120212(购自Active Biochem)。加入药物后， 4天后采用Cell-Titer-96含水非放射性增殖测定法(Promega)检测 细胞活力。去除背景之后，活力计算为对照(未处理细胞)的百分比。 对于每个细胞系最低六个重复并且整个实验重复至少三次。使用与S 形剂量–应答曲线拟合的非线性回归曲线来对来自药理学的生长抑制 测定法的数据进行建模。采用Windows下的GraphPad Prism 5 (GraphPad)显示这些曲线。通过确定连接位于50％点两侧的数据点的 直线的斜率来计算GI50值。

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