一种能诱导猪体较早产生干扰素和中和抗体且具有广谱免疫原性的PRRSV减毒株及其疫苗

摘要

本发明公开了一种能诱导猪体较早产生干扰素和中和抗体且具有广谱免疫原性的PRRSV减毒株及其疫苗。一种经本发明分离、传代、减毒后得到的猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)减毒株，命名为HP-PRRSV-LZ-F65，是由PRRSV分离毒在原代猪肺泡巨噬细胞传5代，在MARC-145细胞上传60代后减毒而来。其与PRRSV VR-2332以及VR-2385的核苷酸序列的同源性分别为97.50％、98.2％。实验证明：PRRSV-LZ-F65能够较早诱导猪体产生抗PRRSV的中和抗体，且中和抗体的水平显著高于其他同类疫苗,并且能保护同源型和异源型的PRRSV的攻毒感染，在体外传代50代基因保持稳定。本发明的减毒株HP-PRRSV-LZ-F65及其传代株在作为安全、高效、广谱的候选疫苗株在预防猪繁殖与呼吸综合症中将具有广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪繁殖与呼吸综合症病毒减毒株及其疫苗，特别涉及一种能诱导猪体较早产生干扰素和中和抗体且具有广谱免疫原性的猪繁殖与呼吸综合症病毒减毒株以及由该减毒株或其传代株制备得到的疫苗。本发明属于医药生物技术领域。 

背景技术

猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)，属于套式病毒目的动脉炎病毒科动脉炎病毒属的成员，是引起猪繁殖与呼吸综合症的病原，可致妊娠母猪晚期流产、早产和产死胎，仔猪与育肥猪呼吸道疾病。 

猪繁殖与呼吸综合症病毒的基因组为单链正向RNA，其基因组长度为15kb左右，具有5’端帽子和3’端Poly(A)结构，已经发现有9个开放阅读框(ORF1-9)。ORFs-1编码负责病毒复制转录的酶，ORFs2-4分别编码病毒粒子相关蛋白GP2、GP2b、GP3以及GP4，ORFs5-7分别编码主要结构蛋白：糖基化囊膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)，囊膜蛋白(E)又称GP5蛋白。目前PRRSV有2个主要基因型，欧洲型(1型)PRRSV和美洲型(2型)PRRSV，基因同源性55-70％，基因1型PRRSV病毒至少有3个遗传谱系，基因2型PRRSV病毒至少有9个不同遗传谱系。 

猪繁殖与呼吸综合症病毒能够引起母猪严重的生殖疾病，如死胎、畸形仔猪和二次感染的呼吸道疾病，在美国每年造成约5亿美元的损失，在中国每年造成约200亿人民币的损失。目前已有减毒活疫苗和灭活疫苗用于猪猪繁殖与呼吸综合症的预防和控制。 

分子流行病学调研发现国内目前流行2和1基因型多种遗传谱系的猪高致病性繁殖与呼吸综合病毒。基因型、抗原性的多样、不断变异新变种的出现流行，且有疫苗株和野毒株重配、疫苗免疫猪体分离到变异株、以及减毒活疫苗免疫保护低下的现象。 

猪繁殖与呼吸综合症病毒逃逸机体免疫和病毒多样性导致了目前国内外上市的减毒活疫苗和灭活疫苗的效果不甚理想，特别对异源基因型毒株感染免疫效果不佳。采用逆向分子遗传学研制的试验性的猪繁殖与呼吸综合症病毒疫苗、减毒活疫苗、重组载体表达PRRSV蛋白疫苗、DNA疫苗、植物生产的亚单位疫苗都在不同试验动物上尝试，但由于病毒本身基因和抗原的多样性、以及对其致病性和免疫性的了解甚少成为这些试验性疫苗发展的主要挑战。随着抗PRRSV免疫和PRRSV逆向分子遗传学的研究深入，合理设计研发具有广谱免疫原性的猪繁殖与呼吸综合症病毒疫苗成为疫苗研究的主要方向。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种猪繁殖与呼吸综合症病毒的减毒株，该毒株可较早激活猪体干扰素免疫防御系统，使得猪体较早产生I类干扰素，同时较早产生中和抗体和细胞免疫，同时激发对同源型和异源型的猪繁殖与呼吸综合症病毒的保护性免疫，以此病毒作为抗原注射机体，和现行的减毒活疫苗相比较，具有更安全、更稳定、免疫保护水平高、免疫谱广、免疫持久等优点。 

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段： 

猪繁殖与呼吸综合征病毒强毒株(HP-PRRSV-LZ)的分离：从我国河北省保定暴发猪高热综合症某猪场的病猪，将所采集的病料研磨、离心、过滤、取滤液冻存待用。用原代猪肺泡巨噬细胞扩增毒株传4代后，用PRRSV的N、GP5引物进行RT-PCR扩增；用PRRSVCH-1a株的N、GP5蛋白特异性单抗通过间接免疫荧光方法进行鉴定，试验证明该分离毒株为PRRS病毒，命名为HP-PRRSV–LZ-F4株；通过对HP-PRRSV–LZ-F4株的毒力的测定发现该株病毒对仔猪具有较强的致死性，PCR扩增结果为阳性。HP-PRRSV–LZ-F4株与PRRSV N、GP5蛋白特异性单克隆抗体呈阳性反应，而与猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒、猪乙脑病毒、猪戊肝病毒、猪胃肠炎病毒以及猪流行性腹泻病毒的特异性单抗无交叉反应，采用RT-PCR技术对分离的HP-PRRSV–LZ-F4株的ORF7和ORF5基因进行进行了扩增，分别扩增出2个目的基因片段，在此基础上对分离到的HP-PRRSV–LZ-F4株做了PRRSVNsp2和GP5的序列进行分析证明HP-PRRSV–LZ-F4株属于美洲型(基因2型)，与已分离鉴定VR-2332具有较高的同源性。 

本发明将PRRSV减毒毒株HP-PRRSV–LZ-F4在原代猪肺泡巨噬细胞上传代一次后再在Marc-145细胞上连续传代，经3次蚀斑克隆，对传代过程中不同代次病毒 的培养特性、纯粹性和生物学特性进行了检测，结果表明各代次病毒无外源病毒、细菌、霉菌等污染，且能被高致病性猪繁殖与呼吸综合症病毒特异性的阳性血清中和，根据以上结果并结合不同代次病毒的序列分析结果比较，本发明选择猪繁殖与呼吸综合征病毒株第65代细胞毒，命名为HP-PRRSV–LZ-F65，分类命名为高致病性猪繁殖与呼吸综合症病毒，作为高致病性猪繁殖与呼吸综合征减毒活疫苗株原始种子批，连续传代50代，每隔5-10代测序，结果表明其基因组在50代以内稳定。该减毒株命名为HP-PRRSV-LZ-F65，分类命名为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间是：2014年7月8日，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所，保藏号CGMCC No.9454。该减毒株是由HP-PRRSV-LZ分离毒在原代猪肺泡巨噬细胞传5代，在MARC-145细胞上传60代减毒而来。 

同源性分析结果表明：HP-PRRSV-LZ-F65与VR-2332在核苷酸水平上的同源性为97.50％、与猪繁殖与呼吸综合症病毒VR-2385在核苷酸水平上的同源性为98.2％,HP-PRRSV-LZ-F65 ORF5基因编码氨基酸和VR-2332的ORF5基因编码氨基酸同源性为86.9％，与V2385 ORF5基因编码的氨基酸同源性为84.6％，HP-PRRSV-LZ-F65株的Nsp2基因的核苷酸酸序列全长为2490bP，与HP-PRRSV-LZ-F2株Nsp2基因的核苷酸序列相比连续缺失第600-728位氨基酸，共缺失128个氨基酸。 

安全性、免疫原性试验结果表明：本发明获得的HP-PRRSV–LZ-F65在体外传代至少1-45代后仍能够保持减毒无致病性的稳定、无返祖现象。表明其在自然界使用的安全性，即使在猪体内连续传代，至少6代无表型变异。本发明减毒株及其传代株对妊娠母猪、仔猪等各年龄猪只均安全、无副反应、且能够诱导各种年龄的猪体较早产生干扰素、较早产生中和抗体和细胞免疫反应。 

本发明减毒毒株HP-PRRSV–LZ-F65的形态学观察：HP-PRRSV–LZ传至65代其病毒滴度达到最高并保持稳定，电镜观察发现低代次病毒与高代次的病毒粒子形态有所改变，蚀斑形态比较发现低代次病毒的蚀斑大小不一，而高代次病毒形成的蚀斑大小均一，且比低代次小，电镜负染观察发现HP-PRRSV–LZ-F65病毒粒子以圆形为主，直径为40-100nm。 

进一步的，本发明还提出了所述的猪繁殖与呼吸综合症病毒减毒株或其传代株在制备预防猪繁殖与呼吸综合症药物中的应用。 

将本发明减毒株HP-PRRSV–LZ-F65其传代株与药学上可接受的佐剂相配伍， 可得到一种预防猪繁殖与呼吸综合症的疫苗组合物。 

优选的，所含有的猪繁殖与呼吸综合症病毒减毒株或其传代株的有效量为2.0-5.0lgTCID₅₀/剂。 

具体的本发明疫苗组合物可参考以下方法制备得到: 

建立Marc-145细胞工作细胞库并按相关规程进行鉴定，按0.01-0.01感染复数接种HP-PRRSV–LZ-F65工作种子批的病毒，换掉细胞培养液，加入含微量血清的病毒维持液，2-3天后80％细胞出现病变时，冻融3次后离心取上清液-20℃备用，并对病毒滴度、无菌试验进行检验。合格后的病毒原液按1：3加入适宜冻干保护剂冻干制备减毒疫苗制剂，按适宜比例加入适宜灭活剂可制成灭活疫苗。 

本发明疫苗组合物的使用方法: 

(1)接种途径：颈部肌肉注射 

(2)接种剂量：哺乳仔猪0.5ml，断奶仔猪及架子猪1ml。 

相较于与现有技术，本发明的优点在于： 

1、本发明提供的减毒株或其传代株克服了目前商用疫苗免疫效果低、降低或抑制猪体干扰素生成、对同基因型异源病毒保护水平低的问题，提供的高效猪繁殖与呼吸综合症减毒疫苗株，能够改善现行减毒活疫苗的免疫抑制和迟发免疫反应，注入机体后能够诱导机体早期产生高水平的免疫反应，中和抗体的水平显著高于其他猪繁殖与呼吸综合症病毒诱导的中和抗体； 

2、猪体免疫HP-PRRSV–LZ-F65或其传代株能够诱导猪体产生I类干扰素、早期产生中和抗体和细胞免疫，免疫保护持久，大幅减少猪繁殖与呼吸综合症病毒感染，包括同源高致病性猪繁殖与呼吸综合症病毒以及异源高致病性猪繁殖与呼吸综合症病毒，且无肺部损伤。免疫保护可达6-8月，在体外传代50代基因保持稳定。 

3、传代过程中，在原代猪肺巨噬细胞上I类干扰素生成增强、细胞病变效应减小，猪体内I类干扰素生成增强，在Marc-145细胞上产生干扰素、并能产生完整的HP-PRRSV–LZ-F65病毒，病毒滴度高，这样不仅利于该原始分离毒的减毒驯化且提高了完整病毒的滴度。 

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚，但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制，本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方 案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。 

实施例1猪繁殖与呼吸综合症病毒的分离、传代及其致病性和免疫原性的相关鉴定 

1、材料与方法 

1.1材料 

仔猪3周龄，无特定病原无PRRSV抗体，商用检测PRRSV抗体ELISA试剂盒(IDEXX Laboratories，Inc.，Westbrook，Mass.)，试验用毒株ATCC VR2385、ATCC VR2332购自美国ATCC，HP-PRRSV-HuN4-F112(lot JA-621C-416)从市场购买，2ml为1头份。 

1.2方法 

1.2.1病毒分离、传代 

河北保定某一猪场暴发了典型且严重的猪繁殖与呼吸综合症，猪场300头母猪有80头在5周内流产，50％提前断奶，15％的育肥猪死亡，猪的死亡率78％。对病猪进行采血，血清用0.45um的滤器过滤，滤液放置于-60℃备用。75cm²方瓶培养PAMs细胞，细胞培养液为DMEM，10％胎牛血清，37℃培养，细胞单层后接种1ml血清，于2％胎牛血清的DMEM培养液中32℃培养，每日观察细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)。3天后，培养细胞70％脱落，收集病毒液，接种1ml到另一准备好的PAMs细胞长满单层的75cm²方瓶，其余病毒液贮存于-80℃冰箱备用。重复传代4次，病毒滴度达到5.5lg TCID₅₀/ml。MARC-145细胞在75cm²的方瓶中长满单层，细胞培养液为含8-10％胎牛血清的DMEM培养液，接种病毒液1毫升，37℃培养4天，盲传2-3次，血清分离病毒在Marc-145细胞上有病变。分离的病毒连续在MARC-145细胞传至多代，产生持续稳定的细胞病变效应，病毒滴度达到8.20lgTCID₅₀/ml。 

每代传代的病毒都需通过滴度和免疫荧光抗体检测法确认病毒。免疫荧光抗体法具体操作为：具有猪繁殖与呼吸综合症临床症状的血清，经饱和硫酸铵法、G或A蛋白亲和层析柱纯化作为鉴别多克隆抗体。96孔板接种MARC-145细胞，培养液为含5-10％胎牛血清的MEM，在37℃、5％CO₂孵箱培养过夜，加入不同稀释度的病毒液培养48小时，细胞用乙醇固定、空气中晾干。猪的纯化多克隆抗体作为第一抗体，鼠抗猪的异硫氰酸酯结合IgG抗体为第二抗体。 

1.2.2传代毒致病性和免疫原性的相关鉴定 

选择第4代(HP-PRRSV-LZ-F4)、第20代(HP-PRRSV-LZ-F20)以及第65代(HP-PRRSV-LZ-F65)的传代毒经噬斑纯化后，接种长满单层的MARC-145细胞复制，收获后调整病毒滴度为10^5.5TCID₅₀/2ml。小母猪(在6个月前已经接种猪繁殖与呼吸综合症疫苗(HuN4-F112株))随机分成7组，每组19-20头，隔离饲养，阴性对照组接种不含病毒的细胞裂解液2毫升、实验组分别接种HP-PRRSV-LZ-F4、HP-PRRSV-LZ-F20以及HP-PRRSV-LZ-F65的病毒液2毫升，阳性对照组分别接种VR2332和VR2385病毒液2毫升，疫苗组分别接种HP-PRRSV-HuN4-F112病毒液2毫升。 

临床观察包括呼吸系统症状(0-6级)，直肠温度记录(0-28天)，接种后6、14、21、28天取血进行病毒和血清检测。在接种10天每组随机选10头解剖，剩余的在接种28天解剖，并在接种后10天和28天收集支气管肺泡灌洗液。商用PRRSVELISA(IDEXX Laboratories，Inc.)检测接种前后猪的PRRSV抗体反应，血清样本阳性和阴性比值为0.4，则可认为抗体反应阳性。 

对所有的猪和器官进行病理观察。观察肺部、心脏、脾、淋巴结等，器官收集后用10％中性福尔马林固定用显微镜观察。肺、淋巴结蜡质包埋，单克隆抗体检测抗原，单抗SDOW-171/5000稀释，单抗SR-301/1500稀释混合成抗体。支气管灌洗液用逆转录-PCR检测PRRSV病毒，如果检测阴性，则用PCR检测猪血清，如果血清PRRSV阴性，则用PCR检测该猪的扁桃体。每头猪无菌收集支气管灌洗液50ml，用Earle平衡盐溶液(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo.)灌洗获得，贮存于-70℃以备RT-PCR.，具体方法为：灌洗液冻融3次，4℃，2，000×g离心10分钟，取140微升上清用QIAamp viral RNA minikit(Qiagen Inc.，Valencia，Calif.)按说明书提取RNA用One Step RT-PCR kit(Qiagen Inc.)进行扩增，体系中加入8微升RNA模板，加入42微升RT-PCR混合液，加入ORF7引物。病毒序列分析，每组2个扩增产物，一个为接种后10天的，另一个为接种28天的ORF5序列扩增产物，引物P5F：13696 to 13714；引物P5R：14459 to 14437；PCR产物长度764bp。产物送到公司测序，用DNAstar(DNASTAR Inc.，Madison，Wis.)电脑程序分析对比。 

统计分析：直肠温度数据用多变量方差分析，肺部损伤百分比、何每组样本大小适合用Kruskal-Wallis analysis of variance(ANOVA)，如果P＜0.05，则差异显著。 

2、结果 

2.1病毒分离、传代 

通过在异体细胞上不断传代，HP-PRRSV-LZ逐渐在细胞上适应复制，细胞病变逐步扩大，但达到一定代次后，细胞病变减小且稳定，病毒的突变也在连续传代复制中积累且导致病毒毒力、致病性减弱。传代过程中观察该分离毒在MARC-145细胞的复制周期为8-10小时，感染复数为0.0001-0.01，3天1个代次，传代200代需要约400天时间。 

2.2抗体反应 

实验所选猪在4周龄经抗体检测试剂盒检测，结果表明为阴性。VR2332和VR2385组所有的猪在7-14天抗体阳转，HP-PRRSV-LZ-F4、HP-PRRSV-LZ-F20、HP-PRRSV-LZ-F65组猪的PRRSV抗体反应与VR2332不同，接种后6天猪PRRSV抗体阳转，接种14天抗体滴度达到高峰，4/9猪在免疫后7天检测到PRRSV抗体，7/9猪在接种后14天抗体阳转，8/9猪在接种后21天抗体阳转。HP-PRRSV-HuN4-F112接种后6天，猪的抗体反应为0，14天2/9抗体阳转，21天后4/9猪抗体反应阳转，5/9猪28天抗体反应阳性，结果如表1所示： 

表1 分离传代病毒接种4周龄猪的PRRSV抗体反应(S/P＝0.4为阳转) 

组别 0DPI 6DPI 14DPI 21DPI 28DPI 阴性对照 0 0 0 0 0 HP-PRRSV-HuN4-F112 0 0 0 0.35 0.38 HP-PRRSV-LZ-F65 0 0.4 2.0 1.8 1.8 HP-PRRSV-LZ-F20 0 0.5 2.0 1.7 1.5 HP-PRRSV-LZ-F4 0 0.5 2.5 2.0 1.2 VR2332 0 0 1.2 2.1 1.9 VR2385 0 0 1.6 2.2 2.0

2.2病毒检测 

对照组猪在研究中无PRRSV感染，VR2332和VR2385组的猪在感染10和28天，肺泡灌洗液发现PRRSV核酸阳性，HP-PRRSV-LZ-F56组在接种感染后10天，RT-PCR检测结果6/10为阳性，感染28天8/10为阳性；HP-PRRSV-LZ-F20在感染后10天，8/10为阳性，感染28天后，9/10的猪RT-PCR阳性；HP-PRRSV-LZ-F4组在感染10天后9/10的猪RT-PCR结果阳性，28天后10/10的猪的RT-PCR结果阳性。HP-PRRSV-HuN4-F112组中，感染10天后，6/10的猪RT-PCR结果阳性，28天后，5/9的猪检测结果阳性。 

2.3分离毒、传代毒的序列分析 

分离的猪繁殖与呼吸综合症病毒、传代细胞适应毒ORF5基因测序结果表明，HP-PRRSV-LZ-F56、HP-PRRSV-LZ-F20、HP-PRRSV-LZ-F4属于同一基因进化族，HP-PRRSV-LZ-F56 ORF5基因和HP-PRRSV-HuN4-F112氨基酸同源性为96.5％，HP-PRRSV-LZ-F4ORF5基因和HP-PRRSV-HuN4-F112氨基酸同源性为99.5％，HP-PRRSV-LZ-F4病毒ORF5基因编码氨基酸和HP-PRRSV-HuN4-F112的同源性为96％。HP-PRRSV-LZ-F56、HP-PRRSV-LZ-F20、HP-PRRSV-LZ-F4在猪体内传代一次后分离的病毒其ORF5的序列和传代前有99.5－100％同源性。 

2.4传代毒致病性和免疫原性的相关鉴定 

阴性对照组、HP-PRRSV-LZ-F65和疫苗组的猪在任何时间均无蓝耳病的症状，直肠温度和呼吸症状分级处于正常范围。接种VR2332和VR2385病毒组的猪在接种后5-7天开始出现呼吸困难呼吸急促和昏睡症状，10天后病症加重，14-21天消失。接种HP-PRRSV-LZ-F4病毒液的猪在接种21天有呼吸症状出现(dyspnea and tachypnea)，发烧以及昏睡，在接种后21和28天，症状轻微发展到中等程度。临床症状分级数据的统计分析这些组的猪的症状无显著差异。阴性对照组和HP-PRRSV-LZ-F65和疫苗组的分级数低于HPRRSV-LZ-F4以及HP-PRRSV-LZ-F20组，组之间的临床分级差别随接种后天数而减小。各组猪的直肠温度重复检测结果的统计表明，各组猪的直肠温度在某一时间具有显著差异，P＜0.05，每组直肠体温平均值随接种后天数而变化，每组的变化不同，无趋势可循，但在接种后14、16、18天温度都有下降。 

肺部大面积损伤见表2，肺部损伤估值的平均值(标准差)，各组PRRSV产生的肺部损伤类型一样，但程度不一，损伤特征表现为在肺炎部位普遍存在肺衰竭，斑驳的棕褐色。该损伤出现的最常见部位是颅腹部，但在整个肺部发现其呈多灶性出现。在接种后10天，VR2385和VR2332组猪肺损伤严重程度显著高于其他组，P＜0.0001。接种后28天，HP-PRRSV-LZ-F2组肺部损害远高于其他组，P＜0.002。 

表2 PRRSV在接种后10天和28天产生的肺部损害比较 

肺部显微损伤分级按间隙性肺炎分为0-6级：0，无显微损伤；1，轻微多点损伤；2，轻微扩散损伤；3，中度多点损伤；4，中度多点弥散损伤；5，严重多点损伤；6，严重多点弥散损伤或严重弥散间隙性肺炎。各组PRRSV引起的肺部显微病变和损伤类型一样，但严重程度、发生、痊愈时间不同。肺部损伤特征为2型肺细胞碎解、肥大和增生，单核细胞无菌侵润，以及肺泡渗出物和坏死碎片数量增加。VR2332和VR2385组猪在接种后28天有轻微和中度损伤，10天接种后肺损伤有中度、严重损伤。HP-PRRSV-LZ-F4，HP-PRRSV-LZ-F20组的肺部损伤在接种10天后几乎没有或很小，在接种后28天，有轻微和中度损伤。HP-PRRSV-LZ-F65、HP-PRRSV-HuN4-F112和阴性对照组在接种10天和2天后显微损伤不明显。结果见表2。VR2332和VR2385组接种10天后肺显微损伤严重显著高于其他组P＜0.0001，接种28天后VR2332 VR2385、HP-PRRSV-LZ-F4，HP-PRRSV-LZ-F20组的肺损伤远高于阴性对照组、HP-PRRSV-HuN4-F112疫苗组、HP-PRRSV-LZ-F65组，P＜0.0001。阴性对照组、HP-PRRSV-HuN4-F112、HP-PRRSV-LZ-F65组的猪中无心肌炎的显微症兆，而VR2332、VR2385、HP-PRRSV-LZ-F4，HP-PRRSV-LZ-F20组猪中，分别有8/20、8/20、8/19、7/20有轻微淋巴浆细胞性心肌炎。 

2.3抗体反应 

实验所选猪在4周龄经抗体检测试剂盒检测，结果表明为阴性。VR2332和VR2385组所有的猪在7-14天抗体阳转，HP-PRRSV-LZ-F4、HP-PRRSV-LZ-F20、HP-PRRSV-LZ-F65组猪的PRRSV抗体反应与VR2332不同，接种后6天猪PRRSV抗体阳转，接种14天抗体滴度达到高峰，4/9猪在免疫后7天检测到PRRSV抗体，7/9猪在接种后14天抗体阳转，8/9猪在接种后21天抗体阳转。HP-PRRSV-HuN4-F112接种后6天，猪的抗体反应为0，14天2/9抗体阳转，21天后4/9猪抗体反应阳转，5/9猪28天抗体反应阳性，结果如表3所示： 

表3 分离传代病毒接种4周龄猪的PRRSV抗体反应(S/P＝0.4为阳转) 

组别 0DPI 6DPI 14DPI 21DPI 28DPI 阴性对照 0 0 0 0 0 HP-PRRSV-HuN4-F112 0 0 0 0.35 0.38

[0062] 

HP-PRRSV-LZ-F65 0 0.4 2.0 1.8 1.8 HP-PRRSV-LZ-F20 0 0.5 2.0 1.7 1.5 HP-PRRSV-LZ-F4 0 0.5 2.5 2.0 1.2 VR2332 0 0 1.2 2.1 1.9 VR2385 0 0 1.6 2.2 2.0

实施例2原始种子批PRRSV-LZ-F65在猪体内的稳定性(致病性和减毒性)研究 

1、方法： 

PRRSV-LZ-F65接种猪体，猪分为6组，第1组5头猪鼻内接种PRRSV-LZ-F65，对照组3头猪鼻内接种无菌液体，每日观察临床症状：外观、呼吸、粪便等。6天后称重、放血、宰杀。收集每个猪体的肺灌洗物，经冻融-融化；收集猪血清，制备每头猪肺灌洗物2ml、血清2ml混合物，用来接种第二组和第二对照组的猪体，连续传代接种到第六代，每代重复观察、收集肺部灌洗物和血清。每组单独饲养但条件一样。 

猪接种病毒后，在接种后1-6天采集血液样本，定期检测体温，研究期间每天检测每头猪的健康状况，记录描述如下： 

1.外表正常＝0；沮丧抑郁＝1；兴奋＝2；昏睡/死亡＝30. 

2.呼吸正常＝0；喷嚏＝1；咳嗽＝1；呼吸快/短促＝2；呼吸吃力＝3. 

3.粪便正常＝0；干燥＝1；松散＝2；流体＝3. 

4.眼睛正常＝0；潮湿＝1；无光＝2；凹陷＝3. 

5.鼻孔正常＝0；水样分泌物＝1；红/红肿＝2；外皮溃疡＝3. 

6.嘴正常＝0；流口水＝2；溃疡＝3. 

7.食欲正常＝0；下降＝1；厌食＝3. 

猪在免疫和尸检前称体重，通过每组平均体重比较获得每组体重增加情况，实验组、对照组血清用ELISA和中和抗体法检测，血清中PRRSV病毒的分离采用MA-104细胞，总体白细胞计数用COULTER COUNTER(Beckman公司)，尸检每组猪体的肺并记录，猪肺分成7个部分，检测各部分损伤、红肿占据整个肺部的百分比，肺部的病理参数如下：左叶肺部涉及红肿、损伤百分比；左心肺部涉及病理损伤百分比；肺左间隔设计病理百分比；肺部右部设计病理的百分比；右心肺部涉及病理损伤百分比；肺右间隔设计病理百分比；总计。 

2、结果 

通过细胞和猪体传毒，各组猪体的体温、重量没有变化、肺部无病理损失，各组猪体在试验期间通过ELISA和中和试验检在试验期间均为抗体阴性，在第6天60-100％感染病毒HP-PRRSV-LZ-F65和回传的猪血清和肺部灌洗液中分离到病毒，而对照组病毒阴性，最初的连续3次传代猪的血清和肺灌洗液中，20-40％的猪有病毒，后续3次传代，50-80％分离到PRRSV病毒，基于此数据，可以看出HP-PRRSV-LZ-65在猪体传代6次，其毒力不逆转，说明其安全性方面毒力减弱，无返祖现象。 

实施例3猪繁殖与呼吸综合症病毒减毒株HP-PRRSV-LZ-F65种子批的病毒及其传代毒的免疫原性和安全性实验 

1、材料 

1.1实验动物：100-120头4周龄的猪，PRRSV抗体、支原体肺炎抗体阴性，猪圆环2型病毒PCR检测阴性。分成A－F组隔离饲养。 

试验疫苗：猪繁殖与呼吸综合症疫苗HP-PRRSV-LZ-F95，HP-PRRSV-LZ-F80，HP-PRRSV-LZ-110(HP-PRRSV-LZ-F65为疫苗原始种子批，80代为主种子批，110代为工作种子批，采用MARC-145细胞传代培养，具体方法如实施例1)，国内猪繁殖与呼吸综合症疫苗HP-PRRSV-HuN4-F112，国外进口疫苗Ingelvac PRRS MLV(BoehringerIngelheim，USA)购自市场。猪繁殖与呼吸综合症培养细胞MARC-145购自美国ATCC。 

2、方法 

各组剔除不合格的仔猪，每组分别肌肉免疫试验疫苗和国产、进口商用疫苗，F组免疫MARC-145细胞培养上清液作为安慰剂组，在免疫组接种免疫后3天，引入9头合格不免的猪作为对照。每组免疫和未免的猪每日检查临床症状，直肠温度、和摄食情况，直肠温度和摄食情况在免疫前3天开始观察。免疫猪血液样本在免后0、3、6、9、12、15和18天采集，每组未免疫猪的血液样本在免后3、6、9、12、15、18和24天采集，血清贮存在-80℃备用。 

分离病毒和检测抗体，未免疫猪则用RT-PCR检测PRRSV病毒，方法如实施例1。有病毒血症的未免疫猪发现以后尽快从组中移出。同时免疫组的猪采血时也收集鼻腔、口腔、肛门拭子，立即浸入2mL DMEM并贮存于-80℃冰箱以备分离病毒。猪每次取血时称重，估算0-6天、7-15天、16-21免疫接种后的每日增重(DWG)。 实验的7、14、21天，每组免疫的猪和对照组5头猪用过量巴比妥钠(Dolethal，Vetoquinol，France)静脉注射麻醉，取肺、扁桃体、胸腺、回肠、颌下，腹股沟浅，胸骨，纵隔和肠系膜淋巴结贮存于-80℃以备分离病毒。肺用作病理组织研究。解剖猪血液、鼻腔、口腔拭子也贮存-80℃以备分离病毒。在试验的24天，所有接触猪的临床样本进行病毒分离和滴定，接种单层PAM和MARC-145细胞，每份重复4次，37℃吸附90分钟，用细胞培养液洗涤2次，用含10％胎牛血清DMEM培养，37℃、5％CO₂孵箱培养6天，4-6天时估算细胞病变效应，阳性对照为猪繁殖与呼吸综合症病毒TJM-F92，每孔分别按照10³TCID₅₀、10²TCID₅₀以及10TCID₅₀接种，结果10TCID₅₀对PAM敏感感染。无病毒的DMEM或血清作为阴性对照，PRRSV病毒滴度用Reed和Muench法。血清特异的PRRSV抗体检测如实施例1，呼吸器官损伤病理检测方法按实施例1，免疫组化观察按实施例1，统计学检验采用实施例1方法。 

3、结果 

3.1临床症状和生长性 

观察发现，组A-F的猪免疫后健康，无局部和普通的副反应观察到，也无猪繁殖与呼吸综合症临床症状。在整个实验过程中，各组猪的体温处于正常范围内，无显著性增高，接触的猪在试验期间健康，无临床症状和发热现象。各组的增重变化随时间增加，各组增重在任何时间无显著差异。 

3.2肺部大面积损伤 

A-F组猪无任何肺部明显损伤观察到，各组观察的肺部损伤分级值无明显差异，如表4，各组肺部损伤随时间减少，在3个时间段无明显差异，表明HP-PRRSV-LZ-F65通过细胞传代至80-110代后(HP-PRRSV-LZ-F95，HP-PRRSV-LZ-F80，HP-PRRSV-LZ-110)，致病性无回复。 

表4 各组猪解剖肺部大面积损伤分级值(平均±标准差) 

3.3显微损伤 

对照组猪体肺部显微检测无任何损伤，实验组猪中有一部分有间隙性肺炎病理发生，以轻微或中度肺泡壁增厚、肺泡之间充盈巨噬细胞、多灶位弥散为特征。间隙性肺炎随时间加重，如表5，A-E组猪肺部显微损伤的个数和等级在实验观察期间无显著差异，损伤等级都为轻微1级。 

表5 各组猪解剖肺部显微损伤分级值(平均±标准差) 

3.4免疫组猪的病毒血症 

对照组样本无论用何种细胞检测都无PRRS病毒，A-F组免疫后不同血清的病毒分离结果见表6，所有的疫苗株病毒都能诱导猪体产生病毒血症，尽管每组产生病毒血症的猪个体数不同，但采用MARC-145细胞分离病毒，多数的猪在免疫后3天分离病毒检出结果为阳性，病毒血症出现的时间各组并无显著差异，P＞0.05，免疫后天A组病毒血症阳性率为93.8％，B组阳性率为86.7％，C组阳性率73.3％，D组阳性率为100％，E组阳性率为80％。用PAM分离病毒，多数的样本病毒检出结果为阴性，A-F组猪检出阳性率分别为4.2％、5.9％、5.0％、4.9％、6.1％，12天后全部变为病毒阳性。所有组的猪病毒滴度在试验结束前一周达到高峰，各组猪的病毒滴度、病毒出现时间并无显著差异，P＞0.05。 

表6 MARC-145和PAM细胞培养分离各组猪血清病毒结果 

3.5病毒在组织中的分布 

不同组织器官样本经MRAC-145细胞培养，所有从对照组中获取的组织未能分离到病毒，在免疫组中不同时间的组织器官均能分离到病毒，肺、扁桃体、胸腺、回肠、淋巴结、脾脏分离到病毒的频率分别为44.4％、81.7％、37.8％、33.9％、36.8％、21.7％，说明病毒主要在扁桃体。各组猪脏器分离病毒阳性率无显著差异，P＞0.05。。用PAM细胞分离各组猪体器官的PRRSV，各组在免后21天的扁桃体中分离到病毒，病毒阳性率非常低。 

3.6免疫组化结果 

对照组猪肺切片没有PRRSV抗原检测到，各组猪肺切片检测到PRRSV抗原的几率极低，A—F组在免后7和14天所有器官组织切片抗原检测阴性，但在免后21天，A组有3/5，B组2/5，C组2/5，D组1/5，E组2/5，F组3/5样本检测到PRRSV抗原，分级为1，主要在肺泡巨噬细胞细胞质中。 

3.7病毒排放 

免疫各组猪在试验期间从阴性对照组中的体液中分离病毒阴性，免疫后6-15天，从鼻咽分离病毒的频率相同，总的分离阳性率为8.33％，免后3天到免后18天，从鼻腔分离到病毒的阳性率为4.67％，免疫后6天直到试验结束，粪便分离到PRRSV病毒阳性率为5.67％，A组排泄病毒的阳性率为8.0％，B组病毒分离阳性率为4.89％，C组病毒分离阳性率为5.33％，D组为6.67％，E组为6.63％，各组分离病毒比较，P＞0.05，无显著差异。 

3.8疫苗株的传染性 

所有的疫苗株均能从免疫的猪传到未免疫的猪中，免疫后9天，未免疫的猪中就有病毒血症发现，12天各组未免疫猪多数出现病毒血症，18天全部未免疫的猪出现病毒血症，并在试验结束时仍有病毒血症。各组出现病毒血症的百分比比较，P＞0.05，无显著性差异。用PAM分离培养各组未免猪的血清，免疫后18-21天分离到病毒，A-E组滴度分别为2.6、2.5、3.2、1.8、1.5TCID₅₀/mL，各组猪病毒血症的发生率无显著性差异。 

3.9抗体阳转 

A-C组在免疫后7天抗体阳转，其中未免动物在免疫后12天抗体开始阳转，A组有1头、B组2头、C组2头猪抗体阳转，15天，各组5头未免的猪抗体全部阳转，D-E组15天抗体开始阳转，D组2头，E组2头，24天5头全部阳转。 

3.10病毒排放 

免疫后9-24天，A-C组检测102个样本，其中12个检测到疫苗病毒，占11.77％，排泄病毒几率高依次是鼻腔、口腔、粪便。D组检测45个样本，分离病毒8个，占17.8％，粪便中分离病毒频率最高，约为11.1％，E组检测115个样本，粪便中分离病毒11.3％，鼻腔分离病毒为6.9％，口腔为4.3％。各组病毒排泄比较无显著差异。 

结合实施例2和3，可以看出HP-PRRSV-LZ-F65，至少在65-110代保持减毒无致病性的稳定、无返祖现象。表明其在自然界使用的安全性，即使在猪体内连续感染，至少6代无表型变异。也表明在制备工程从原始种子到工作种子限定传代次数不超过45代是合理和安全的。 

实施例4猪繁殖与呼吸综合症分离毒HP-PRRSV-LZ-F65在PAMs细胞上能诱导猪体较早产生干扰素和中和抗体 

1、材料和方法： 

1.1猪肺泡巨噬细胞的制备：细胞培养液成份，RPMI-1640培养基(Gibco Laboratories，Grand Island，NY，USA)、10％热灭活胎牛血清(FBS)(Hyclone，Laboratories，Logan，UT)10，000单位/毫升青霉素、10，000微克/毫升链霉素、25微克毫升双性霉素。20日龄猪取猪肺泡细胞长成单层，细胞消化液为0.25％胰蛋白酶和EDTA混合液(0.2毫克/毫升)，原代单层细胞消化后离心除去胰蛋白酶、EDTA，加入细胞培养液使细胞浓度为2X10⁵cells/ml，加入100微升至96孔板，37℃、5％二氧化碳孵箱中培养。 

1.2攻击毒：乙型脑炎病毒(SA-14-14-2Vero细胞适应株，由中国药品和生物制品检定所研究院提供用于研究)的制备，用25cm²的细胞瓶培养Vero细胞，细胞单层以后，按MOI0.01接种乙型脑炎病毒，培养4天后，收取病毒液，按常规测定病毒滴度TCID₅₀，-80℃冻存备用。 

1.3试验疫苗 

VR-2385、HP-PRRSV-LZ-F2、HP-PRRSV-LZ-F65、HP-PRRSV-TJM-F92 

1.4干扰素测定的方法 

猪繁殖与呼吸综合症病毒HP-PRRSV-LZ-F65、VR-2385、HP-PRRSV-LZ-F2、HP-PRRSV-TJM-F92在MARC-145细胞、PAMs原代细胞中传代的病毒液用细胞培养液倍比稀释、再10倍稀释，分别吸取100微升加入96孔板单层细胞中(弃去细胞液并反复拍打几次除去残余液体)，每个稀释度重复1-2孔，每板中有6-12孔加入100微升细胞培养液作为细胞或病毒对照，过夜孵化后，倒去液体，每孔加入100微升含400TCID₅₀的乙脑病毒液，包括病毒对照孔，细胞对照孔加入100微升同样的细胞培养液，孵化24小时后，病毒对照孔观察到50-90％的细胞病变效应时，细胞板终止孵化，弃去液体，用0.85％生理盐水洗2次，加入染色固定液固定20分钟，固定液用蒸馏水配制，含0.5％结晶紫、5％福尔马林(v/v)、50％乙醇(v/v)、0.85％氯化钠。弃去固定液，干燥后每孔染料用200微升2-甲基乙醇洗脱，搅拌洗脱20分钟，取每个稀释度2孔洗脱液放入96孔板在分光光度计上测定550纳米的光吸收值，干扰素的稀释度的对数值和光吸收值作图，减少50％细胞病变的干扰素的稀释度＝0.5×(细胞对照吸收值+病毒对照吸收值)。重组猪干扰素IFN-α(购自Chemicon，Temecula，California，USA)作为标准，干扰素活性1单位为产生50％细胞病变抑制稀释度的倒数。Vero细胞、猪乙型脑炎病毒用于干扰素活性的检测，分离毒在MARC-145细胞、猪肺泡巨噬细胞上培养的上清液，按干扰素的测定方法进行检测， 

2、结果 

2.1 HP-PRRSV-LZ-20在MARC-145细胞上上诱导高水平的干扰素 

用猴ELISA试剂盒对HP-PRRSV-LZ-F65、VR-2385、HP-PRRSV-LZ-F2、HP-PRRSV-TJM-F92在MARC-145细胞培养的上清液分别进行测定，结果显示HP-PRRSV-LZ-F65诱导干扰素的量平均为38.5pg/ml，远远高于VR-2385、HP-PRRSV-LZ-F2、HP-PRRSV-TJM-F92诱导的量。这些结果表明：HP-PRRSV-LZ-F65能够诱导MARC-145细胞产生干扰素，而VR-2385、HP-PRRSV-LZ-F2、HP-PRRSV-TJM-F92对MARC-145细胞干扰素的生成具有一定的抑制作用。 

2.2 HP-PRRSV-LZ-20在原代肺泡巨噬细胞上诱导高水平的干扰素 

HP-PRRSV-LZ-F65、VR-2385、HP-PRRSV-LZ-F2、HP-PRRSV-TJM-F92按MOI＝0.01分别接种PAMs细胞培养，VR-2385 HP-PRRSV-TJM-F92s作为对照，进行干扰素活性以及定量检测，结果表明HP-PRRSV-LZ-F65上清液中含有10u/ml的干扰素活性，重复3头幼猪的肺泡巨噬细胞培养HP-PRRSV-LZ-F20上清含9U±2/ml的干扰素，用猪干扰素试剂盒检测各种病毒上清，HP-PRRSV-LZ-F20诱导猪肺泡巨噬细胞产生干扰素平均30.5pg±1.3。HP-PRRSV-TJM-F92在PAMs原代细胞培养上清含1.5U±0.8/ml的干扰素，含量8±pg/ml，VR-2385、HP-PRRSV-LZ-F2在巨噬细胞上培养的上清液不含干扰素，不能抑制猪乙脑病毒在Vero细胞上的病变。 

结果表明HP-PRRSV-LZ-F65及其传代毒和参考疫苗株相比在猪体上诱导了高水平的干扰素。 

实施例5 HP-PRRSV-LZ-F65在疫苗基质细胞上的生长性 

1、HP-PRRSV-LZ-F65病毒液按感染复数(MOI)0.01、0.1、1.0TCID₅₀接种细胞，每天收集细胞上清液，总计5天测定病毒滴度，接种0.01MOI的细胞3天后，病毒滴度可达6.6-7.0log TCID₅₀/ml，按MOI＝1接种细胞的产毒的滴度为3.0logTCID₅₀/ml，第5天滴度2.0logTCID₅₀/ml按0.1MOI接种的细胞第3天产毒的滴度为6.67log TCID₅₀，第1天为3.0logTCID₅₀/ml，第5天为6.0logTCID₅₀/ml，因此按0.01MOI接种的病毒在3-5天滴度明显高于按0.1、1MOI接种的细胞产毒。 

2、病毒噬斑克隆纯化方法：将待纯化病毒稀释至10^-6，取10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6稀释度接种6孔培养板已经长满单层的MARC-145细胞，每个稀释度接种1个孔，同时设1个细胞对照孔，每孔接种100微升，37℃吸附1小时，去掉吸附液， 用无血清MEM清洗2次，加温水浴至37℃的低熔点琼脂，每孔3毫升，室温冷却后放置于37℃5％CO₂孵箱培养4-5天，观察噬斑。选择最高稀释度病毒接种孔挑取独立噬斑，成为F+1代接种6孔培养板生长良好单层的MARC-145细胞，继续传代，经6孔板传1代后即为F+2代。每连续传10代，回传1次，进行一次噬斑克隆纯化。 

按照上述方法分别对HP-PRRSV-LZ-65、HP-PRRSV-LZ-F20、HP-PRRSV-TJM-F92分别进行噬斑分析，病毒接种后的4天细胞板用中性红染色，HP-PRRSV-LZ-F20、HP-PRRSV-LZ-F65产生的噬斑较小，直径约为2-3毫米，HP-PRRSV-TJM-F92产生噬斑较大，直径为5毫米，结果表明HP-PRRSV-LZ-F20在MARC-145细胞上复制不同于HP-PRRSV-TJM-F92。3种病毒按0.05MOI接种MARC-145细胞和原代PAM细胞，HP-PRRSV-LZ致使原代PAM细胞死亡，HP-PRRSV-TJM-F92诱导了可见细胞病变，HP-PRRSV-LZ-F65诱导病变比较轻微不明显。 

3、病毒滴度测定 

HP-PRRSV-LZ-F20、HP-PRRSV-LZ-F95、HP-PRRSV-TJM-F92感染PAMs细胞24小时的培养液在MARC-145细胞上测定滴度分别是3.8lg TCID₅₀/ml、5.5lgTCID₅₀/ml和3.2lgTCID₅₀/ml。结果说明HP-PRRSV-LZ-F95在猪肺泡细胞上的产量高于原始分离毒HP-PRRSV-LZ，高于参考毒HP-PRRSV-TJM-F92，说明了HP-PRRSV-LZ-F95在细胞上的适应性和高生长性，减毒过程是成功的，适合用于生产疫苗。 

实施例6 HP-PRRSV-LZ-65在猪体诱导抗同型或异型病毒的抗体产生试验 

(一)HP-PRRSV-LZ-F65、VR-2385、HP-PRRSV-TJM-F923种病毒诱导同源病毒的抗体产生情况： 

1、方法 

3-8公斤PRRSV阴性小猪分成8组，1-3组鼻内(I.N)分别免疫HP-PRRSV-LZ-F65、HP-PRRSV-TJM-F92、VR-2385病毒液1毫升，滴度10⁵TCID₅₀/毫升，5-7组肌肉(I.M)免疫HP-PRRSV-LZ-F65、HP-PRRSV-TJM-F92、VR-2385病毒液1毫升，滴度10⁵TCID₅₀/毫升，4组、8组作为对照组，各组接种病毒3天后，为评估猪繁殖与呼吸综合症病毒的脱落和传染，每组增加2头未接触病毒的猪为对照，PBS，pH＝7.2作为对照组的注射液。猪每天观察，接种前3天和感染14、56 天称重。血液样本在接种前、接种后的每周采取，每头猪的血清单独保存于-80℃以备病毒血清抗体检测、病毒分离。用戊巴比妥在猪感染病毒后14天、56天麻醉尸检观察肺部病变并分级，收集肺部灌洗液，分离肺泡巨噬细胞加入二甲基亚砜(DMSO)。尸检后也观察肺部病理变化，间隙性肺炎按0-6打分，0表示没有症状，6表示严重扩散间歇性肺炎，结果如表7所示。 

表7 试验设计以及打分结果 

  1组 2组 3组 4组 5组 6组 7组 8组 途径 I.N I.N I.N I.N I.M I.M I.M I.M PRRSV LZ-F65 TJM-F92 VR-2385 PBS LZ-F65 TJM-F92 VR-2385 PBS 头数 6 6 6 6 3 3 3 3 对照组头数 2 2 2 0 2 2 2 0 感染14天尸检 3 3 3 3 0 0 0 0 感染56天尸检 5 5 5 3 2 2 2 2

2、结果 

各组中，接种HP-PRRSV-LZ-F65的猪每日平均增重大于接种HP-PRRSV-TJM-F92的猪，和接种PBS的猪相等，但无显著差异。结果说明HP-PRRSV-LZ-F65对猪的生长影响小。 

在MARC-145细胞上测定血清中和HP-PRRSV-LZ-F65的抗体滴度，无论鼻内或肌肉感染，HP-PRRSV-LZ-F65感染的猪，都诱导了高滴度的中和抗体的产生。在鼻内感染49天后，HP-PRRSV-LZ-F65诱导的中和抗体平均滴度为90，HP-PRRSV-TJM-F92诱导的中和抗体平均滴度10，VR-2385诱导的中和抗体平均滴度为18。鼻内感染56天后HP-PRRSV-LZ-F65诱导的中和抗体平均滴度为90.0，HP-PRRSV-TJM-F92诱导的中和抗体平均滴度8，VR-2385诱导的中和抗体平均滴度为32。接触对照组猪在感染后49天，HP-PRRSV-LZ-F65诱导的血清中和抗体平均滴度为45，感染后56天中和抗体平均滴度为48；接触对照组猪在感染后TJM49天、56天中和抗体平均滴度为6，而VR-2385感染的接触控制的猪血清在49天、56天均测不到抗体。 

肌肉感染49天，HP-PRRSV-LZ-F65诱导的中和抗体平均滴度为90.0，HP-PRRSV-TJM-F92诱导的中和抗体平均滴度20.0，VR-2385诱导的中和抗体平均滴度为10.0。感染56天后HP-PRRSV-LZ-F65诱导的中和抗体平均滴度为68.0，HP-PRRSV-TJM-F92诱导的中和抗体平均滴度5，VR-2385诱导的中和抗体均滴度为 20.0。接触对照组猪在感染后49天，HP-PRRSV-LZ-F65诱导的血清中和抗体平均滴度为78，感染后56天中和抗体平均滴度为70.0；接触对照组猪在感染后TJM-F9249天、56天中和抗体滴度平均为4，而VR-2385感染的接触控制的猪血清在49天、56天测不到抗体。 

这些结果表明，HP-PRRSV-LZ-F65感染诱导猪体较早产生抗HP-PRRSV-LZ-F65的中和抗体，而且滴度较高，用单向方差分析发现，HP-PRRSV-LZ-F65无论鼻内或肌肉感染猪体，产生的抗体显著高于HP-PRRSV-TJM-F92感染(P<0.05)、VR-2385感染组的抗体(P<0.01)。HP-PRRSV-LZ-F65在感染后28天就有可检测到的抗体生成，到感染后56天达到最大。HP-PRRSV-LZ-F65鼻内感染猪的抗体滴度高于HP-PRRSV-TJM-F92鼻内感染的猪2-6倍，仅在感染后28天的中和抗体滴度有显著差异。HP-PRRSV-LZ-F65感染的2头猪在28天产生了就可检测到中和抗体，在感染56天后全部中和抗体阳性。HP-PRRSV-TJM-F92鼻内感染的猪在35天有可检测到的中和抗体，VR-2385鼻内感染的猪在56天有一头猪产生了可检测到中和抗体。 

肌肉感染的猪中，HP-PRRSV-LZ-F65产生了较高的中和抗体，49天后产生的抗体滴度显著高于HP-PRRSV-TJM-F92感染猪的产生的中和抗体滴度，感染56天，，HP-PRRSV-LZ-F65感染猪的抗体分别是128.0、16.0、64.0，而HP-PRRSV-TJM-F92感染猪只有1头猪的抗体在56天达到32，VR-2385感染组也有1头在56天测到抗体。HP-PRRSV-LZ-F65、HP-PRRSV-TJM-F92鼻内感染诱导猪的中和抗体高于肌肉感染且具有显著差异(P＜0.05)，鼻内或肌肉感染VR-2385对诱导中和抗体影响甚微。HP-PRRSV-LZ-F65接种猪在35天检测到中和抗体，持续到56天，HP-PRRSV-TJM-F92的组接种猪只有1头在感染56天后检测到中和抗体。结果如表8所示。 

表8 各组诱导产生PRRSV中和抗体的情况(中和50％病毒的抗体最大稀释度的倒数) 

上述是HP-PRRSV-LZ-F65、VR-2385、HP-PRRSV-TJM-F923种病毒诱导同源病毒的抗体产生情况。 

(二)HP-PRRSV-LZ-F65、VR-2385、HP-PRRSV-TJM-F923种病毒诱导异源病毒的抗体产生情况 

对HP-PRRSV-LZ-F65鼻内感染组在49、56天后血清中和异源PRRSV毒株VR-2385的能力进行了检测，结果表明：3/4的猪在免疫后49天、全部猪在感染后56天产生了抗VR-2385中和抗体。VR-2385鼻内感染组的猪在感染后49、56天有可检测到的抗体。VR-2385、HP-PRRSV-LZ-F65、HP-PRRSV-TJM-F92鼻内染后49天产生的抗VR-2385中和抗体滴度分别为80、24、0，在感染后56天血清中抗VR-2385的抗体平均滴度分别是64、32、0。HP-PRRSV-LZ-F65、HP-PRRSV-TJM-F92感染产生的异源中和抗体滴度有显著性差异(p＜0.01，同样在接触对照组中，VR-2385、HP-PRRSV-LZ-F65、HP-PRRSV-TJM-F92鼻内感染后49天产生的抗VR-2385中和抗体滴度分别为48、16、0，在感染后56天血清中抗VR-2385的抗体平均滴度分别是42、16、0，HP-PRRSV-LZ-F65、HP-PRRSV-TJM-F92鼻内感染产生的异源中和抗体滴度有显著性差异。VR-2385、HP-PRRSV-LZ-F65、HP-PRRSV-TJM-F92肌肉感染后49天产生的抗VR-2385中和抗体滴度分别为80、22、0，在感染后56天血清中抗VR-2385的抗体平均滴度分别是62、28、0，HP-PRRSV-LZ-F65、HP-PRRSV-TJM-F92. 

肌肉感染产生的异源中和抗体滴度有显著性差异。肌肉感染的接触猪中VR-2385、HP-PRRSV-LZ-F65、HP-PRRSV-TJM-F92肌肉感染后49天产生的抗VR-2385中和抗体滴度分别为76、8、0，在感染后56天血清中抗VR-2385的抗体平均滴度分别是72、8、0HP-PRRSV-LZ-F65、HP-PRRSV-TJM-F92肌肉感染产生的异源中和抗体滴度有显著性差异(p＜0.01)。 

这些结果表明与疫苗参考株HP-PRRSV-TJM-F92相比，HP-PRRSV-LZ-F65病毒株可诱导机体产生高滴度的抗异源PRRSV的中和抗体。 

感染病毒的猪在14天后麻醉取肺部组织镜检，都有不同程度的变化，HP-PRRSV-LZ-F65组、HP-PRRSV-TJM-F92肺部宏观变化轻微，平均病变分数分别是24、18，无显著性差异。VR-2385感染猪的平均病变分数为54。但这种变化在56天后消失。HP-PRRSV-LZ-F65感染猪间质性肺炎的平均分级值为2.8，HP-PRRSV-TJM-F92间质性肺炎分级平均值为1.8，和PBS空白对照组为1.2，无显著性差异，但和VR-2385组有显著性差异，VR-2385感染间质性肺炎猪平均值5.2。感染56天后，各组无可观察到间质性肺炎发生，说明HP-PRRSV-LZ-F65的安全性和HP-PRRSV-TJM-F92一样，而且具有较早产生中和抗体和干扰素生成的能力，但致病性和疫苗参考株一样。 

实施例7 HP-PRRSV-LZ-F65对母猪繁育能力的影响 

1、材料和方法 

体外减毒使HP-PRRSV-LZ-F65毒株的生长性和致病性变化，通过免疫母猪观察其对猪的繁殖能力的影响可以评估分离病毒的致病性或免疫性，使本发明的减毒株达到其免疫效果，这要求动物模型敏感且能检验其致病或毒力。 

本实施例选取28头母猪，每组7头，分成A、B、C、D组。A组鼻内接种HP-PRRSV-LZ-F65的6次体内回传传代病毒HP-PRRSV-LZ-F65-B6，B组肌肉接种HP-PRRSV-LZ-F65的6次体内回传传代病毒HP-PRRSV-LZ-F65-B6，C组鼻内接种注射用水作为对正常照组，D组鼻内接种HP-PRRSV-LZ-F65的细胞传代株HP-PRRSV-LZ-F65-P4，在怀孕90天接种。观察期间，进行母猪免疫后7天的体温检测、分娩前到产仔时每周一次的血样检测。收集仔猪在出生、7日龄、14日龄的血样和体重信息，在研究期间到分娩后14天每天观察健康状况。 

母猪暴露后的血清用商用PRRSV ELISA试剂盒、MA-104细胞培养检测，母猪接种后的0-7天观察每日体温获得每组的平均体温；免疫前后白细胞总数检测、临床观察分级如实施例2，母猪临床观察时间为免疫前1天到分娩；直肠温度监测时间为免疫的0-7天，尸检检测肺涉及百分比。同样仔猪出生后每周用PRRSV ELISA试剂盒检测血清，仔猪临床观察时间从出生到14周龄。 

2、结果 

母猪在接种病毒以前,血清无猪繁殖与呼吸道综合症病毒抗体，也无猪繁殖与呼吸综合症病毒感染，在接种HP-PRRSV-LZ-F65和不同的传代病毒14天后，A、B、D组的母猪抗体阳转，B组有3头猪在免后14抗体阴性，但在分娩时抗体阳转。 

A组、B组大多仔猪的血清ELISA结果显示，仔猪出生0天抗体阴性，经母猪喂养7天后抗体阳性。C组所用仔猪抗体为阴性，因为死产只有D组几个血清检测，且一半为阳性。D组母猪所产的仔猪在出生7天后全部死亡，A、B两组母猪血清分离猪繁殖与呼吸综合症病毒阴性。A、B两组仔猪血清分离猪繁殖与呼吸综合症病毒阳性，A组中1母猪的猪仔病毒分离始终阴性，B组只有2头猪仔病毒分离阳性；C组猪仔没有病毒分离到，而D组的71％猪仔病毒分离阳性。 

病毒接种母猪后温度变化不显著，A、B组母猪和C组母猪温度不超过101.7华氏度，D组的4头猪有1天温度超过102华氏度，其中一头温度超过103.4华氏度。 

A组、B组的仔猪增重高于C组仔猪增重，观察14天，平均增重7.9磅，A组平均增重7.7磅，B组、C组平均增重6.9磅，这和母猪一窝产仔多少无关。A组母猪一窝下仔平均为9头，B组为7头，C组为10头，D组所产猪仔在出生后3天就死亡。 

A、B、C三组母猪的白细胞数相对稳定，免疫前的白细胞平均数等于或高于观察期间的92％，D组的3头母猪在观察期间，白细胞数低于正常值范围(7-20×10⁶/ml)。 

A、B组母猪接种病毒后临床症状不明显，C组中有几头母猪在一段时间有明显临床症状，主要症状为食欲减退、呼吸道症状、萎靡。D组的6头猪表现明显临床症状，主要为不同程度的厌食、厌食症。 

仔猪临床症状主要为死亡和食欲减退，如果按每窝平均死亡计算，A、B、C3组无显著差异，A组每窝平均死亡数(average deaths per litter DPL)1.3DPL，B组2.4DPL，C组2.0DPL，D组猪仔存活不超过产后3天。 

由于病毒接种不影响母猪的产仔量，所用母猪的繁育评估采用百分适宜，A组仔猪平均存活率为85％(SD±9.6)，C组仔猪平均存活率为83.4％(SD±7.9)，B组仔猪平均存活率为89％(SD±11.6)。A组平均死胎率8.8(SD±9.66)，B组平均死胎率是6.6(SD±9.7)，C组平均死胎率是14(SD±11.39)。A组平均木乃伊胎率6.1(SD±6.01)，B组平均木乃伊胎率3.9(SD±4.45)，C组平均木乃伊胎率2.6(SD±4.01)，D组仔存活率8.7(SD±8.92)，D组平均死胎率10.7(SD±11.39)，D组平均木乃伊胎率81.9(SD±17.18)。 

本实施例说明，HP-PRRSV-LZ-F65以及回传猪体6代的减毒株HP-PRRSV-LZ-F65-B6，减毒特性稳定，接种的猪和仔猪在繁殖行为、白细胞减少、 直肠温度、临床症状方面无显著差别，安全低毒，毒性小几乎和注射用水引起的反应相同，HP-PRRSV-LZ-F65毒力在母猪上不返祖。 

实施例8高剂量HP-PRRSV-LZ-F65对母猪的安全试验 

1、材料和方法 

目前猪繁殖与呼吸综合症减毒活疫苗使用剂量为1-2×10⁵lgTCID50，本实施例采用HP-PRRSV-LZ-F6510倍浓缩液注射母猪，观察对母猪繁殖行为的影响，母猪分为A、B、D四组，在怀孕的90天分别接种不同剂量的病毒液，A组鼻内接种，HP-PRRSV-LZ-F65，C组鼻内接种注射用水作为正常对照组，D组鼻内接种的减毒株10倍浓缩液。 

观察期间，进行母猪免疫后7天的体温检测、分娩前到产仔时每周一次的血样检测。收集仔猪在出生、7日龄、尸检的血样和体重信息，在研究期间到分娩后14天每天观察健康状况。 

母猪暴露后的血清用商用PRRSV ELISA试剂盒、MA-104细胞培养检测，母猪接种后的0-7天观察每日体温获得每组的平均体温；免疫前后白细胞总数检测、临床观察分级如实施例2，母猪临床观察时间为免疫前1天到分娩；，直肠温度监测时间为免疫的0-7天，尸检检测肺涉及百分比。同样仔猪出生后每周用PRRSV ELISA试剂盒检测血清，仔猪临床观察时间从出生到14周龄。 

2、结果 

该实施例的结果显示怀孕母猪注射HP-PRRSV-LZ-F倍浓缩液HP-PRRSV-LZ-F65病毒原液、注射用水在安全性方面和对生殖影响无明显差别，因此，HP-PRRSV-LZ-F65致病性减弱，使用安全，10倍浓缩液使用也不影响怀孕母猪的生殖行为，这些结果说明HP-PRRSV-LZ-F65株高度减毒且使用安全，并能有效抵抗高致病性HP-PRRSV感染引起的生殖综合症。 

实施例9 HP-PRRSV-LZ-F65在育肥猪上的免疫原性 

1、材料和方法 

猪分为3组，组1肌肉接种HP-PRRSV-LZ-F65的病毒液，1剂2.0lg10TCID50，组2肌肉接种注射用水，组3为正常对照，组1和组2的猪在免疫后28天攻毒，攻击毒来自HP-PRRSV-LZ 2代病毒(HP-PRRSV-LZ-F2)。 

免疫后的前7天和攻毒后的每天检测猪的体温，猪攻毒后每周检测体重，攻毒 前每周采血1次，攻毒后每2天采血，尸检的肺部涉及百分比计算按实施例2进行，研究期间每天观测每头猪的健康状况。猪免疫和攻毒后取血清进行PRRSV ELISA检测猪抗体，攻毒后的血清用MA-104细胞分离病毒，各组的ELISA检测结果和病毒分离结果采用卡方检验分析分析，白细胞计数方法如实施例2。 

2、结果与讨论 

免疫组1的各项检测指标均好于注射用水免疫组。免疫组攻毒4天后，病毒血症显著下降，在攻毒后的10天、11天，有病毒血症猪的个数进一步减少。组2猪的增重和白细胞数较低，肺部涉及百分比、临床分级、直肠体温较高，在攻毒后的10天、11天，有病毒血症猪的个数进一步减少。 

免疫前后、攻毒前后所有猪的血清ELISA检测结果显示，所有猪在免疫时PRRSV抗体阴性(S/P比例<0.4)，免疫后7天仍为阴性，免疫7天后，22头免疫的猪中21头抗体阳转，组1的2头猪在攻毒前抗体阴性，在攻毒后8天抗体阳转。组2所有猪在试验开始到攻毒前抗体阴性，但在攻毒后8天，22头猪中17头抗体阳转，组3所有猪在整个试验期间抗体阴性。 

猪在免前和免后都进行了血清病毒分离，22头免疫的猪中，17头在免后2天分离到病毒，18头在免疫后7天分离到病毒，有1头猪免疫后到攻毒时始终分离不到病毒。这些结果和免疫后血清状态结果一致。 

攻毒时，55％免疫的猪发生了病毒血症，攻毒后2天，病毒血症的猪升至82％，以后逐渐下降，在攻毒后11天下降至9％。组2所有的猪，攻毒时没有病毒血症，攻毒后2天，82％的猪出现病毒血症，攻毒后4天，91％的猪发生病毒血症。组2的猪在攻毒后的6天、10天，有82％猪病毒分离到病毒，在攻毒后11天，71％猪病毒分离到病毒。组3的猪在实验期间，病毒分离始终阴性。 

体温检测结果显示组2的所有猪体温上升，有一半的猪发生2天以上高热，高出攻毒前的平均温度1华氏度。免疫组22头猪只有4头猪高热，体温超过攻毒前平均温度1华氏度。1组猪体温升高的平均时间为2.2天，2组平均4天，3组体温正常，没有发生体温持续2-3天升高现象。 

实验期间猪的增重观察了11天，组3猪平均增重1.06磅/天，组2猪平均增重0.94磅/天，组1猪平均增重0.53磅/天，因此没有免疫但感染PRRSV病毒的猪增重只有免疫攻击猪的增重的57％，是正常对照组的50％。 

在攻毒后，猪的白细胞减少情况进行了检测，组3的猪在攻毒后的2天，每头猪的白细胞数和攻毒前的平均值相比，减少5％。组2的猪白细胞数下降至41％， 到攻毒后11天才恢复到攻毒前水平。免疫组猪在攻毒后3天，白细胞数下降12％，但攻毒后4天恢复到免前的白细胞数水平。 

在攻毒前4天到攻毒后11天，每天进行临床观察，所有的猪在攻毒前无可见的临床症状，组3的猪在攻毒后观察期间也无临床症状，组2的5头猪表现为攻毒临床症状，攻毒后6天日渐明显但不严重。1组的免疫猪中只有1头在攻毒后11天有明显的临床症状。 

在研究末期，尸检观察猪肺损伤情况，3组猪肺正常，平均分级分值为0.02，2组猪的肺分级分值介于33和98之间，平均78.33，1组猪的分级分值介于30和90之间，平均53.20。 

这些数据说明，HP-PRRSV-LZ-F65作为疫苗活性成份的效果，最小剂量2.0logTCID₅₀，可显著减少猪肺部损害、降低感染引起的白细胞减少症状、减少猪发热。除此之外，免疫HP-PRRSV-LZ-F65疫苗，不影响猪的生长，显著高于感染未免疫的猪。 

实施例10 HP-PRRSV-LZ-F65的使用剂量和效果 

1、材料与方法 

70头猪，分成4组，1-3组各20头，4组10头。HP-PRRSV-LZ-F65病毒液，攻击毒为HP-PRRSV-LZ-F2。1组肌肉注射HP-PRRSV-LZ-F65病毒液，2.5lgTCID₅₀/剂。2组鼻内接种HP-PRRSV-LZ-F65病毒液，5.0lgTCID₅₀/剂，3组肌肉注射稀释液，4组作为严格对照。1组、2组、3组的猪在免疫后28天攻毒攻毒后的每天检测猪的体温，猪在免疫、攻毒、攻毒后每周检测体重，攻毒前每周采血1次，攻毒后每2天采血，尸检的肺部涉及百分比计算按实施例2进行，研究期间每天观测每头猪的健康状况。猪免疫和攻毒后取血清进行PRRSV ELISA检测猪抗体，攻毒后的血清用MA-104细胞分离病毒，白细胞计数方法如实施例2。 

2、结果 

血清ELISA检测结果显示，所有猪在免疫时PRRSV抗体阴性(S/P比例<0.4)，免疫后14天，1组70％的猪抗体阳转，2组的95％猪抗体阳转。1组只有1头猪在攻毒前抗体阴性，组2所有猪在试验开始到攻毒前抗体阴性，但在攻毒后8天，攻毒当天抗体阳转。22头猪中17头抗体阳转。3组和4组所有猪在整个攻毒以前抗体阴性，在攻毒后的第9天，3组所有的猪经ELISA检测抗体阳性，4组在试验阶段，抗体仍为阴性。 

病毒的分离结果与血清学结果相关，只有1头猪病毒分离阴性，与其免疫后血清抗体阴性相对应，这些结果说明免疫后病毒血症与抗体阳转的免疫剂量关系，2组猪在免后14天，100％阳转，1组70％阳转；在免疫后14天、21天，高剂量组，有85％和90％的猪出现病毒血症，低剂量组中，免后14天有55％的猪出现病毒血症，免后21天有85％的猪出现病毒血症。 

攻毒后，3组89％的猪有高热现象发生，体温超过攻毒前平均温度1华氏度，持续2天以上。1组猪中，75％的猪发生高热，体温超过平均温度1-2华氏度，持续2天以上，而2组只有45％猪高热，正常对照组猪有30％的猪发生2天以上的高热。免前3天到攻毒后28天，高剂量和低剂量免疫对猪的生长产生危害。1组和2组平均日增重分别为0.77磅/天和0.76磅/天，而3和4组平均日增重分别是0.77和0.78。攻毒后，1组的猪日均增重高出3组猪0.05磅/天，2组猪日均增重高出0.01磅/天，正常对照组日增重高出免疫组0.4-0.5磅/天。3组84％的猪在攻击后的1天或多天，白细胞数下降25％以上，正常对照组中有30％猪，也有类似的白细胞数下降。攻毒后高剂量组猪15％(3/20)、低剂量组55％猪出现白细胞数下降，下降25％，持续1天或几天。 

临床观察显示所有猪在攻毒前处于良好健康状态，攻毒后1-3组猪的健康状态水平无明显变化，昏睡、呼吸症状、食欲丧失作为轻度症状。 

尸检肺部观察猪繁殖与呼吸综合症样损伤分级计算肺涉及百分比，正常对照组平均肺部涉及百分比为零，3组是70.08，1组为48.83，2组17.76。 

从该实施例的结果来看，高剂量HP-PRRSV-LZ-F65，滴度5.0lgTCID₅₀/剂作为疫苗，可减少HP-PRRSV-LZ引起的呼吸系统临床症状，且能明显减轻肺部损伤。因此疫苗有效剂量为2.0-5.0lgTCID₅₀/剂。 

实施例11 HP-PRRSV-LZ-F65的基因测序和分子标记 

本实施例通过基因测序说明体外减毒的分子机制和基因组在体外传代和猪体内稳定与否，为HP-PRRSV-LZ-F65实际应用提供毒种传代的限定安全范围，也为HP-PRRSV-LZ-F65减毒彻底不逆转、HP-PRRSV-LZ-F65保持稳定的减毒性、免疫性、安全性、广谱性(对异源PRRSV病毒)、区别其他疫苗株的早期产生干扰素、早期产生特异性中和抗体以及人工方法定向减毒提供遗传学或分子生物学的部分原因和机制。 

本实施例说明HP-PRRSV-LZ-F65与野毒的差异，减毒株的此特性提供了猪繁 殖与呼吸综合症预防、诊断的分子基础，也可区别现行疫苗株的基因以及变异、重组。HP-PRRSV-LZ-F65在GP5基因、NSP1基因的变化，可作为猪体免疫或感染野毒的分子诊断。提供了猪繁殖与呼吸综合症感染与HP-PRRSV-LZ-F65免疫区别的方法。 

1、方法 

细胞培养方法：HP-PRRSV-LZ-F65是通过MARCK-145细胞、猪体回传减毒、噬斑克隆获得。细胞培养用75cm²T细胞瓶，培养基DMEM50毫升，含5-10％胎牛血清、50微克/毫升的庆大霉素，细胞接种分离的病毒，5％二氧化碳的孵箱培育5-7天作为1代病毒传代。传代时按1:4分散细胞，用胰酶-Versene作为消化液。病毒液单层接种1毫升，含10⁵-10⁶TCID₅₀病毒液，吸附1小时，培养5天在细胞病变明显时收毒，离心除去细胞碎片，冻存于-80℃备用。 

RNA提取和RT-PCR方法：病毒液280微升加入1120微升缓冲液AVL(QIAamp病毒RNA分离试剂盒，Qiagen)，在室温涡旋混合10分钟，加入1120微升乙醇，反复颠倒几次，1分钟6000g离心使病毒RNA吸附到旋转分离柱子上，用试剂盒中缓冲液AW洗涤，60微升二乙基焦碳酸水洗脱。Superscript II RNase H.sup.-reverse transcriptase(RT)逆转录酶(Life Technologies，Inc.)、PRRSV特异引物或随机引物、纯化病毒RNA67℃加热7分钟，40微升的反应体系包括5毫摩MgCl₂、1×标准缓冲液II(Perkin Elmer Corp.)，1毫摩dNTP、1单位RNA酶抑制剂、2单位逆转录酶、1微升RNA，42℃15分钟、99℃5分钟、5℃5分钟孵育。多聚酶联25微升反应混合物:10微升cDNA产物、2毫摩MgCl₂、1×标准缓冲液II(Perkin Elmer Corp.)，0.2毫摩dNTP、0.375单位Taq酶、0.3微摩5’端引物、0.3微摩3’端引物。反应条件：93℃4分钟变性一次，进入35次循环反应，每次循环94℃变性30秒、59℃退火30秒、73℃延伸30秒，35个循环后产物72℃延伸10分钟，置于4℃。PCR产物纯化可用商用试剂盒按说明书进行。 

病毒基因组末端的PCR反应的RNA分离、cDNA合成、纯化采取上述方法或更简便的试剂盒，在PCR扩增末端片段进一步反应加上末端，20微升反应体系：10微升cDNA、1×缓冲液2(New England Biolabs)，2.5微摩CoCl2，0.5毫摩dATP、2单位末端转移酶(New England Biolabs)。37℃加热15分钟，65℃5分钟终止反应，用水稀释至200微升。 

长片段的PCR反应体系，体积50微升，包括10微升带多聚腺苷酸尾的cDNA、1×缓冲液、0.35毫摩的dNTP、0.625毫摩MgCl2、0.04微摩Qt引物(Frohman， 1994)，0.3微摩Qo引物(Frohman，1994)，0.3微摩5'-CGCCCTAATTGAATAGGTGAC-3'、0.75微升酶。混合物93℃变性2分钟，再进行25次的循环，每次循环包括93℃变性10秒、63℃退火30秒、68℃12分钟。循环后68℃7分钟，产物置于4℃。下一轮扩增反应，50微升反应包括：5微升上一步PCR产物100倍稀释液、1×缓冲液、0.35毫摩的dNTP、0.625毫摩MgCl2、0.04微摩Qi引物(Frohman，1994)，0.3微摩引物5'-CCTTCGGCAGGCGGGGAGTAGTGTTTGAGGTGCTCAGC-3'，0.75微升聚合酶。混合物93℃变性2分钟，再进行25次的循环，每次循环包括93℃变性10秒、63℃退火30秒、68℃4分钟。循环后68℃7分钟，产物置于4℃。 

扩增产物在1％琼脂糖电泳上显示为1000-1500bp的条带，使用凝胶纯化试剂盒纯化克隆与质粒pGEM-T(Promega)，分离测序克隆并扩增、测序、拼接。约有100-105个PCR反应和450个DNA测序反应进行拼接、分析，与表9所示的标准病毒进行比较。 

表9 全基因序列比较PRRSV毒株所涉及的标准病毒 

2、结果 

经序列同源比对分析，结果发现HP-PRRSV-LZ-F65与VR-2332在核苷酸水平同源性为97.50％、与猪繁殖与呼吸综合症病毒VR-2385在核苷酸水平具有98.2％,HP-PRRSV-LZ-F65ORF5基因编码氨基酸和VR-2332的ORF5基因编码氨基酸同源性为86.9％，与V2385ORF5基因编码氨基酸同源性84.6％，HP-PRRSV-LZ-F65 株的NsP2基因的核苷酸酸序列全长为2490bP，与PRRSV-LZ-F2株NsP2基因的核苷酸序列相比连续缺失第600-728位氨基酸，共缺失128个氨基酸。 

发现多数PRRSV分离的野毒株只含一个NspI限制性酶切位点，1Kb的RT-PCR产物经酶切有2个片段，HP-PRRSV-LZ-F65减毒株有2个NspI酶切位点，酶切后在电泳中显示3个片段。有的野毒分离株不含NspI酶切位点。 

逆转录PCR基因扩增、cDNA测序结果表明，其序列在核苷酸方面与HP-PRRSV-LZ-F65和原始分离毒细胞2代传代毒的除NSP2氨基酸删除其他基因片段核苷酸序列有99.8％的同源性，有34个核苷酸发生了变化，导致19个氨基酸突变，变化的位置如表10所示。除以上nsp删除外，HP-PRRSV-LZ分离毒的氨基酸发生了变化，揭示了减毒的可能原因，HP-PRRSV-LZ-F65在65-115代之间基因稳定。同时阐明为什么具有早期诱导中和抗体和干扰素的部分分子机制。 

表10 HP-PRRSV-LZ-F65和原始分离毒、不同代次传代毒氨基酸的变化