一种快速测定血清或血浆中甘胆酸含量的试剂盒

摘要

本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种定量检测甘胆酸（CG）的检测试剂盒及其制备方法和用途。本发明提供一种定量检测甘胆酸（CG）的检测试剂盒，包括试纸卡，试纸卡包括底板、及位于底板表面的从加样端开始依次排列的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述金标垫上包含甘胆酸（CG）抗体，所述硝酸纤维素膜上包被有检测线和质控线，所述金标垫上的甘胆酸（CG）抗体采用荧光微球标记。本发明所提供的定量检测甘胆酸（CG）的检测试剂盒首次将甘胆酸（CG）通过荧光微球免疫层析技术进行检测，兼具灵敏性和特异性，具有操作快速简便、结果准确、经济适用等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种快速测定血清或血浆中甘胆酸含量的试剂盒 及其制备方法和用途。

背景技术

甘胆酸(Cholyglycine,CG)是胆酸与甘氨酸结合而成的结合型胆酸，在肝细胞内，胆固 醇经过及其复杂的酶促反应，转变成初级胆汁酸。其中有胆酸(CA)和鹅去氧胆酸(CD-CA)。 胆酸的类固醇核上有三个羟基(C3、C7、C12)，侧链末端的羟基以肽键与甘氨酸结合。

CG由肝细胞合成，正常代谢途径为肠肝循环，经毛细胆管、胆管排入胆囊，随同胆汁进 入十二指肠，帮助食物消化。95％胆酸在回肠末端重吸收，经门静脉再回肝脏，由肝细胞摄 取再利用。在血清中主要以蛋白结合形式存在，溢入体循环的总量小于1％。在正常情况下， 外周血中胆酸含量甚微,正常成人无论空腹或餐后,其血清CG浓度稳定在低水平。当肝细胞受 损时，肝细胞摄取CG能力下降，致使血中CG含量增高；胆汁郁滞时，肝脏排泄胆酸发生 障碍，而返流血液循环的CG含量增高，也使血CG含量增高。测定血清甘胆酸(CG)是评 价肝细胞功能及其肝胆系物质循环功能的敏感指标之一。

临床上急性肝炎、慢性活动性肝炎、原发性肝癌、肝硬化、慢迁肝、梗阻性肝病、肠— 肝循环障碍、胆石症伴黄疸、胆管、胆囊排泄功能障碍患者血CG均明显高于正常人。

甘胆酸同时也是妊娠晚期血清中最主要的胆汁酸组分。正常妊娠时孕妇血清CG水平随 孕周逐步增高，大量雌激素会引起肝细胞膜的改变，减少窦状膜浆的流动性，从而出现胆汁 分泌减少，返流入血，出现妊娠期内胆汁淤积现象，CG水平升高。胎盘绒毛静脉腔内外均处 于高浓度胆汁酸刺激之中，引起血管收缩，胎盘绒毛表面血管痉挛，氧合血流量减少，导致 胎儿缺氧，可出现各种并发症，如胎儿宫内窘迫、早产等。

目前已知的甘胆酸检测方法有放射免疫法(RIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、化学发 光法(CL)等。但这些方法均存在较多缺陷，如放射免疫法同位素试剂具有放射性污染及有 效期较短和操作不方便等弊端，酶联免疫吸附法操作较为繁琐，耗时较长，不适宜临床上使 用。化学发光法尽管灵敏度较高，但需要专用的测定设备，费用较高不利于推广。而胶乳增 强免疫比浊法操作简便、可适用于全自动生化分析仪，检测时间不到10分钟适合临床推广。 但目前我国市场上的甘胆酸检测试剂盒准确度、灵敏度、重复性仍然较差。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种快速测定血清或血浆中甘胆 酸(CG)含量的试剂盒，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种快速测定血清或血浆中甘胆酸(CG) 含量的试剂盒，包括试纸卡，所述试纸卡包括底板、及位于底板表面的从加样端开始依次排 列的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述金标垫上包含CG单克隆抗体，所述硝 酸纤维素膜上包被有检测线和质控线，所述金标垫上的CG单克隆抗体采用荧光微球标记。

优选的，所述金标垫上的CG单克隆抗体采用180nm荧光微球标记，EX(nm)＝650/Em (nm)＝670，具有信号受背景干扰小，检测灵敏度高，结果重复性好的优点。

优选的，所述底板为PVC底板。

优选的，所述硝酸纤维素膜上，检测线位于离加样端较近一侧，质控线位于离加样端较 远一侧。

优选的，所述检测线上包被有CG单克隆抗体。所述金标垫上的CG单克隆抗体与检测 线上的CG单克隆抗体可以是相同的抗体，也可以是不同的抗体。

优选的，质控线上包被羊抗鼠抗体。

优选的，所述样品垫采用缓冲液处理，所述缓冲液选自PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、 甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液和柠檬酸-磷酸盐缓冲液中的一种或多种的组合，缓冲液的浓度 为20-200mM。

优选的，本发明所述的金标垫还经过预处理，预处理时所使用的预处理缓冲液选自甘氨 酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、硼酸盐缓冲液的一种或多种的组合，缓冲液的浓度为5-50mM。

优选的，所述缓冲液还包括反应增强剂，所述反应增强剂选自PEG4000、PEG6000、 PEG8000和PEG20000中的任意一种，所述反应增强剂的浓度为10～50g/L。

优选的，所述缓冲溶液还包括表面活性剂，所述表面活性剂选自S-19 TWEEN 20、S-20 TWEEN 80、S-13 TRITON X-45、S-14 TRITON X-100、S-15 TRITON X305中的任意一种或 多种的组合，所述表面活性剂的浓度为10～50g/L。

优选的，为了使得试剂盒具有更佳的灵敏度和显色效果，本发明所述的金标垫在预处理 时所使用的预处理缓冲液包括下列组分：水苏糖、明矾、果糖二磷酸钠、六偏磷酸钠和甘氨 酸，且水苏糖、明矾、果糖二磷酸钠、六偏磷酸钠、甘氨酸的总浓度为3.5－7.5g/L，缓冲液 的pH值为7.2－7.6。

优选的，各组分在缓冲液中的浓度为：

所述预处理缓冲液的溶剂为水。

所述预处理的具体步骤为：将金标垫在预处理液中浸泡1.5～2h，取出放于36～38℃烘干。

所述预处理缓冲液可使用本领域各种常用的pH调节剂进行pH值的调节。

优选的，所述试剂盒还包括卡壳，所述卡壳包括背卡和上盖，所述背卡设有试纸卡卡槽， 所述试纸卡嵌于所述试纸卡卡槽内，所述上盖设有测试窗和加样孔，所述测试窗的位置与所 述检测线和质控线的位置相配合，所述加样孔的位置与所述样品垫的位置相配合。

更优选的，所述卡壳为塑料卡壳。

优选的，所述检测试剂盒用于定量检测血清或血浆中甘胆酸(CG)的含量。

本发明所提供的定量检测甘胆酸(CG)的检测试剂盒在检测甘胆酸(CG)时采用竞争 抑制免疫层析法，配套免疫定量分析仪器使用。免疫分析仪器通过采集检测线(T)和质控线 (C)条带荧光信号，计算T/C信号值。使用前先将不同标准品滴加到试纸卡上，分析处理 建立定标曲线(T/C信号值与标准品真实值的关系)，再将检测样品时获得的T/C值与标准曲 线比较，即可获得检测样品中的甘胆酸(CG)含量。

本发明第二方面提供所述定量检测脂蛋白甘胆酸(CG)的检测试剂盒的制备方法，包括 如下步骤：

1)用荧光微球标记的甘胆酸(CG)抗体溶液喷涂金标垫，制得包含甘胆酸(CG)抗体 的金标垫；

2)在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上分别喷涂甘胆酸(CG)抗体及羊抗鼠抗体，制 得包被后的硝酸纤维素膜；

3)将样品垫、步骤1)制备金标垫、步骤2)制备的硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘贴在 底板上，切裁制得检测试纸卡；最后将检测试纸卡装入卡壳制得检测试剂盒。

优选的，本发明所述的金标垫还经过预处理，预处理时所使用的预处理缓冲液选自甘氨 酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、硼酸盐缓冲液的一种或多种的组合，缓冲液的浓度为5-50mM。

优选的，为了使得试剂盒具有更佳的灵敏度和显色效果，本发明所述的金标垫在预处理 时所使用的预处理缓冲液包括下列组分：水苏糖、明矾、果糖二磷酸钠、六偏磷酸钠和甘氨 酸，且水苏糖、明矾、果糖二磷酸钠、六偏磷酸钠、甘氨酸的总浓度为3.5－7.5g/L，缓冲液 的pH值为7.2－7.6。

优选的，各组分在缓冲液中的浓度为：

所述预处理缓冲液的溶剂为水。

所述预处理的具体步骤为：将金标垫在预处理液中浸泡1.5～2h，取出放于36～38℃烘干。

所述预处理缓冲液可使用本领域各种常用的pH调节剂进行pH值的调节。

本发明第三方面提供所述定量检测脂蛋白甘胆酸(CG)的检测试剂盒在甘胆酸(CG) 检测领域的用途。

本发明的有益效果为：

本发明所提供的定量检测甘胆酸(CG)的检测试剂盒首次将甘胆酸(CG)通过荧光微 球免疫层析技术进行检测，兼具高灵敏性和高特异性，能够快速检测甘胆酸(CG)的含量。 此外，所述检测试剂盒具有操作快速简便、结果准确、经济适用等优点，受血清(或血浆) 严重血脂、溶血干扰小，当血清(或血浆)血红蛋白≤500mg/L、甘油三酯≤30mg/dL时，对 准确度的影响变差＜10％。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露 的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加 以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精 神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定 的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案， 而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指 出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以 及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术 语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外， 根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例 中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常 规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及 相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等 MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor  Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN  MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series  METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN  STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS  IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic  Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin  Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1

本发明试纸卡的制备：

1)使用预处理缓冲液对金标垫进行预处理，预处理缓冲液为：水苏糖2g/L，明矾0.5g/L， 果糖二磷酸钠1.5g/L，六偏磷酸钠0.3g/L，甘氨酸1.88g/L的水溶液，pH＝7.4，预处理的具体 步骤为：将金标垫在预处理液中浸泡2h，取出放于37℃烘干；然后用荧光微球标记的甘胆 酸(CG)抗体溶液喷涂经预处理的金标垫，制得包被甘胆酸(CG)抗体的金标垫，溶液中 荧光微球与抗体的质量比为5:1，溶液的浓度为10mg/ml，喷涂量为4ul/cm；

2)在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上分别喷涂1mg/ml的甘胆酸(CG)抗体溶液和羊 抗鼠抗体溶液，喷涂量为1ul/cm，制得包被后的硝酸纤维素膜；

3)将样品垫、步骤1)制备金标垫、步骤2)制备的硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘贴在 PVC底板上，切裁制得宽3-5mm的检测试纸卡；最后将检测试纸卡装入卡壳制得检测试剂盒。

标准线曲线：

分别将浓度为0、20、60、100、150、200、250、300、400、500mg/L的甘胆酸(CG) 缓冲溶液滴加于样品垫上，每个浓度设5个重复(检测结果取5个重复的平均值)，膜层析 10分钟以后，使用免疫分析仪器通过采集检测线(T)和质控线(C)条带荧光信号，分析仪 对荧光信号的检测范围是AD值0-10000，计算T/C信号值，建立定标曲线，其中Y轴为T/C 信号值，X轴为标准品真实值。

甘胆酸(CG)抗干扰性和特异性的检测：

将检测样品滴加于样品垫上，每个样品设5个重复(检测结果取5个重复的平均值)，膜 层析10分钟以后，将检测样品时获得的T/C值与标准曲线比较，获得检测样品中的甘胆酸 (CG)含量的检测数据，再将检测获得的甘胆酸(CG)含量数据与真实甘胆酸(CG)含量 数据进行对比，获得准确度影响偏差值。

血清样品1：25mg/L甘胆酸(CG)、50mg/L血红蛋白、50mg/dL甘油三酯；

血清样品2：50mg/L甘胆酸(CG)、500mg/L血红蛋白、10mg/dL甘油三酯；

血清样品3：75mg/L甘胆酸(CG)、100mg/L血红蛋白、20mg/dL甘油三酯；

血清样品4：100mg/L甘胆酸(CG)、150mg/L血红蛋白、30mg/dL甘油三酯；

血清样品5：150mg/L甘胆酸(CG)、200mg/L血红蛋白、40mg/dL甘油三酯；

空白对照：50mg/L血红蛋白、50mg/dL甘油三酯；

样品1-5所获得的检测的甘胆酸(CG)含量数据分别为24.95mg/L、50.05mg/L、74.99mg/L、 99.95mg/L、150.01mg/L，准确度的影响变差＜10％，空白对照中检测时未发现明显荧光信号 变化。

实施例2

对比例试纸卡的制备：

采用25mM甘氨酸缓冲液预处理金标垫，其他试剂及实验方法均同实施例1。

1)采用25mM甘氨酸缓冲液预处理金标垫，然后用荧光微球标记的甘胆酸(CG)抗体 溶液喷涂经预处理的金标垫，制得包被甘胆酸(CG)抗体的金标垫，溶液中荧光微球与抗体 的质量比为5:1，溶液的浓度为10mg/ml，喷涂量为4ul/cm；

2)在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上分别喷涂1mg/ml的甘胆酸(CG)抗体溶液和羊 抗鼠抗体溶液，喷涂量为1ul/cm，制得包被后的硝酸纤维素膜；

3)将样品垫、步骤1)制备金标垫、步骤2)制备的硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘贴在 PVC底板上，切裁制得宽3-5mm的检测试纸卡；最后将检测试纸卡装入卡壳制得检测试剂盒。

甘胆酸(CG)的灵敏性和检测限对比实验：

用荧光仪器进行判断，分析仪的对荧光信号的检测范围是AD值0-10000，根据仪器的性 能，CUTOFF值为50，在特定浓度下，80％以上检测例AD值≥50，即认为试剂盒能够用于 该浓度下的检测。

采用5％BSA生理盐水溶液作为空白样本，空白样本应不含被测物。取3～60pg/mL梯度 浓度的甘胆酸(CG)已知血样进行灵敏性检测，每间隔0.2pg/mL设置一个梯度，每个梯度 设置300个样本，记录检测结果。结果显示实施例1的试剂盒的最低检测限为3.5pg/mL，而 实施例2的试剂盒的最低检测浓度高于60pg/mL。

综上所述，本发明所提供的检测试剂盒具有良好的抗干扰性和特异性，且具有很好的灵 敏性，阴性本底更低，有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技 术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡 所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等 效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。