一种高浓度L-山梨糖发酵生产工艺

摘要

本发明公开了一种高浓度情况下的L-山梨糖高效发酵生产工艺，以生黑葡萄糖酸杆菌为生产菌株，以D-山梨醇为底物发酵生产L-山梨糖，在种液培养基配方中添加0.1mg/ml～5mg/ml明胶，在发酵培养0～16小时的任意时刻，向发酵液中分别单独添加或组合添加0.1mg/ml～5mg/ml柠檬酸、0.1mg/ml～5mg/ml衣康酸。本发明改善了生黑葡萄糖酸杆菌细胞生长状态，提高了种液质量；发酵过程中添加外源物质柠檬酸、衣康酸，促进了生黑葡萄糖酸杆菌细胞代谢，从而提高了发酵过程中L-山梨糖生成速率，发酵后L-山梨糖含量均大于420mg/ml，达到了提高发酵效率和缩短发酵周期的目的。

说明书

技术领域

本发明属于维生素C的制备技术领域，特别涉及一种高浓度L-山梨糖发酵生产工艺。 

背景技术

维生素C是人体必须的一种水溶性维生素，具有抗氧化性、提高机体免疫力等作用，广泛应用于药品、食品、化妆品等领域。 

在目前维生素C工业化生产工艺中，由D-山梨醇发酵生成L-山梨糖是维生素C生产工艺路线中不可缺少的一步，工业上一般采用生黑葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter melagenus)作为生产菌，在高浓度底物情况下发酵生产L-山梨糖的过程中，仍存在菌体生长受抑制、发酵周期长、能耗高等制约生产的技术问题，因此，改进原有发酵生产工艺，提高L-山梨糖发酵效率是非常必要的。 

为了解决上述问题，本公司开发了一种提高L-山梨糖发酵生产率的加工方法(公开号为CN103114111A)，该发明提供了一种采用生黑葡萄糖酸杆菌为生产菌株，以D-山梨醇为底物发酵生产L-山梨糖，在发酵培养0～12小时的任意时刻，向发酵液中添加0.01％～0.05％还原型谷胱甘肽，L-山梨糖的生物合成速率比现有技术最多可提高31.2％；在发酵培养0～12小时的任意时刻，向发酵液中添加0.01％～0.05％酪蛋氨基酸，L-山梨糖的生物合成速率比现有技术可提高27.9％。通过以上技术方案能有效缩短L-山梨糖发酵周期，提高了维生素C发酵生产效率。在该专利的实施例方案中也列出了以下数据：实施例1中发酵24小时山梨糖含量287.2mg/ml；实施例2中发酵26小时山梨糖含量307.8mg/ml；实施例3中发酵24小时山梨糖含量270.6mg/ml；实施例4中25小时发酵至终点测得山梨糖含量为315.4g/L。在实际使用中，该方案发酵后所获得的最大山梨糖含量仅为315.4g/L，仍存在发酵浓度低的问题。 

发明内容

本发明的目的要解决上述技术问题，提供一种生成速率较对照最多可提高，有效缩短了L-山梨糖发酵周期的一种高浓度L-山梨糖发酵生产工艺。 

为了实现上述的目的，本发明采取了如下的技术解决方案：一种高浓度底物条件下的L-山梨糖高效发酵生产工艺，其特征在于： 

其工艺步骤如下： 

1、菌种：生黑葡萄糖酸杆菌； 

2、培养基配方： 

摇瓶种液培养基(mg/ml)：D-山梨醇150，酵母膏5，蛋白胨5，碳酸钙1.5；冰醋酸调节pH至4.8～5.4，121℃高压灭菌25min； 

种液扩大培养基(mg/ml)：D-山梨醇150，酵母膏3，蛋白胨3，碳酸钙1.5；冰醋酸调节pH至4.8～5.4，121℃高压灭菌25min； 

发酵初始培养基(mg/ml)：D-山梨醇450，酵母膏1.5，蛋白胨1.5，碳酸钙1.5；冰醋酸调节pH至4.8～5.4，121℃高压灭菌25min； 

3、摇瓶种液制备： 

从斜面培养基上挑取适量的生黑葡萄糖酸杆菌至种液培养基中，摇瓶容积750ml，装液量250ml，32±1℃，摇床转速230r/min，培养14h作为种液备用，控制种液L-山梨糖含量80mg/ml～120mg/ml； 

4、二级种液培养过程控制： 

接种量为1％，培养温度33±1℃，培养16h作为种液备用，控制种液L-山梨糖含量80mg/ml～120mg/ml； 

5、发酵过程控制： 

初始pH值4.8～5.4，培养温度34±1℃，搅拌速度500～800r/min，在发酵培养0～16h的任意时刻，向发酵液中添加0.1mg/ml～5mg/ml柠檬酸、0.1mg/ml～5mg/ml衣康酸，继续发酵至终点； 

本发明在二级种液培养基配方中添加0.1mg/ml～5mg/ml明胶，在L-山梨糖发酵培养0～16h期间，添加0.1mg/ml～5mg/ml柠檬酸，其发酵液中L-山梨糖的生成速率较对照最多可提高19.82％；在L-山梨糖发酵培养0～16h期间，添加0.1mg/ml～5mg/ml衣康酸，其发酵液中L-山梨糖的生成速率较对照最多可提高24.56％；在L-山梨糖发酵培养0～16h期间，添加0.1mg/ml～5mg/ml柠檬酸、0.1mg/ml～5mg/ml衣康酸，其发酵液中L-山梨糖的生成速率较对照最多可提高26.32％。 

本发明是通过在L-山梨糖发酵种液培养过程中添加外源物质明胶，改善了生黑葡萄糖酸杆菌细胞生长状态，提高了种液质量；发酵过程中添加外源物质柠檬酸、衣康酸，促进了生黑葡萄糖酸杆菌细胞代谢，从而提高了发酵过程中L-山梨糖生成速率，发酵后L-山梨糖含量均大于420mg/ml，达到了提高发酵效率和缩短发酵周期的目的，推广应用具有良好的经济和社会效益。 

具体实施方式

下面对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限制： 

实施例1，在原二级种液培养基中添加1.5mg/ml明胶，在发酵培养基中添加2.5mg/ml的柠 檬酸，利用10L自动发酵罐培养生黑葡萄糖酸杆菌二级种液，将培养好的二级种液7.5L，接入含有50L发酵培养基的100L自动发酵罐中，初始pH值5.2，培养温度34℃，搅拌速度650r/min，发酵39h至终点，L-山梨糖含量427.20mg/ml，产糖速率10.95mg/ml/h，L-山梨糖生产速率较对照提高了17.87％。 

实施例2，在原二级种液培养基中添加2.5mg/ml明胶，在发酵培养基中添加2mg/ml的衣康酸，利用10L自动发酵罐培养生黑葡萄糖酸杆菌二级种液，将培养好的二级种液7.5L，接入含有50L发酵培养基的100L自动发酵罐中，初始pH值5.3，培养温度34℃，搅拌速度650r/min，发酵38h至终点，L-山梨糖含量423.90mg/ml，产糖速率11.16mg/ml/h，L-山梨糖生产速率较对照提高了21.04％。 

实施例3，在原二级种液培养基中添加4mg/ml明胶，在发酵培养基中添加0.5mg/ml的柠檬酸，2.5mg/ml的衣康酸，利用10L自动发酵罐培养生黑葡萄糖酸杆菌二级种液，将培养好的二级种液7.5L，接入含有50L发酵培养基的100L自动发酵罐中，初始pH值5.2，培养温度34℃，搅拌速度650r/min，发酵37h至终点，L-山梨糖含量422.7mg/ml，产糖速率11.42mg/ml/h，L-山梨糖生产速率较对照提高了24.40％。 

实施例4，在原二级种液培养基中添加2.5mg/ml明胶，利用10L自动发酵罐培养生黑葡萄糖酸杆菌二级种液，将培养好的二级种液7.5L，接入含有50L发酵培养基的100L自动发酵罐中，初始pH值5.3，培养温度34℃，搅拌速度650r/min；培养4h后，向发酵液中加入1mg/ml的柠檬酸、0.5mg/ml的衣康酸，发酵38h至终点，L-山梨糖含量420.6mg/ml，产糖速率11.07mg/ml/h，L-山梨糖生产速率较对照提高了21.11％。 

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。