一种基于磁性微珠的样品无转移低场NMR稀有细胞快速检测方法

摘要

本发明涉及分子生物学技术领域，公开了一种基于磁性微珠的样品无转移低场NMR稀有细胞检测方法，包含以下步骤：(1)分别制备目标稀有细胞悬浮液的标准样本和待测样本；(2)分别加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂，混合均匀后立即用低场核磁共振分析仪分别对标准样本和待检样本进行弛豫时间测定；(3)使核磁共振造影剂与样本中的稀有细胞进行免疫反应富集后，再次用低场核磁共振分析仪分别对标准样本和待检样本进行弛豫时间测定；(4)计算弛豫时间改变量，绘制标准曲线，得出待检样本中目标稀有细胞的含量。本发明可简便、快速、高特异性和高灵敏度地检测生物体液样本中的稀有细胞，且由于两次检测之间没有样品的转移过程可获得较高准确率。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术，特别涉及一种生物体液样本中稀有细 胞的检测方法。

背景技术

稀有细胞是指生物体液样本(包括血液、胸水、腹水、尿液、脑脊液等) 中的一些非典型细胞，大量研究表明，对稀有细胞的检测和鉴定对于相关疾 病的病理机制及靶向药物开发具有重要指导意义。因此，寻找准确、快速地 的稀有细胞检测方法将成为亟待解决的问题。然而稀有细胞在生物体液中的 浓度非常低，与非目标细胞的比例大约是1：10⁷，用传统技术无法计数，所 以迫切需要一种简单准确快速的方法解决这一难题。

由于循环稀有细胞在体液中的含量很少，要经过有效的富集步骤才能在 后续的实验中识别鉴定。目前市场上广泛应用于稀有细胞检测研究的方法主 要有密度梯度离心法、膜过滤法和免疫磁性分离技术。

密度梯度区带离心法又称为区带离心法，是将样品加在惰性梯度介质中 进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定 位置上，形成不同区带的分离方法。使用此法可以同时使样品中几个活全部 组分分离，具有良好的分辨率。此法的优点是：①分离效果好，可一次获得 较纯颗粒；②适应范围广，能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒， 又能分离有一定浮力密度差的颗粒；③颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性， 并防止已形成的区带由于对流而引起混合。此法的缺点是：①离心时间较长； ②需要制备惰性梯度介质溶液。研究中经常利用密度梯度离心的原理，用 ficoll液分离和纯化人或动物外周血单个核细胞(PBMC)。

膜过滤方法是根据某些稀有细胞体积大于外周血中粒细胞从而使稀有 细胞从外周血中分离富集出来，然后利用免疫荧光技术对稀有细胞进行鉴别 诊断。该方法中，膜过滤细胞富集过程相对容易，但是并不是所有稀有细胞 体积都大于外周血中粒细胞的，很多稀有细胞的体积和粒细胞大小差不多， 甚至比粒细胞体积更小。基于以上的认识，膜过滤方法被逐渐抛弃。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可简便、快速、高特异性和高灵敏度地检测 生物体液样本中含量较低的稀有细胞的低场核磁共振检测分析方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种基于磁性微珠的样品无转移低 场NMR稀有细胞检测方法，包含以下步骤：

(1)样本制备

将纯培养的目标稀有细胞的细胞系，以缓冲液进行不同梯度稀释，制得 系列浓度的稀有细胞悬浮液标准样本；

对待测生物体液样本进行Ficoll密度梯度离心获取候选混合细胞群，递 经洗涤高心重悬，制得稀有细胞悬浮液待检样本；

(2)亲和富集前核磁共振弛豫时间检测

取上述标准样本，加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造 影剂，混合均匀后立即用低场核磁共振分析仪进行弛豫时间测定，得弛豫时 间值T₁；

取上述待检样本，加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造 影剂，混合均匀后立即用低场核磁共振分析仪进行弛豫时间测定，得弛豫时 间值T₁’；

(3)亲和富集后核磁共振弛豫时间检测

取上述加入核磁共振造影剂的标准样本，在4～8℃温度下孵育10～ 15min，使核磁共振造影剂与标准样本中的稀有细胞发生免疫反应富集后， 再次用低场核磁共振分析仪进行弛豫时间测定，得弛豫时间值T₂；

取上述加入核磁共振造影剂的待检样本，在4～8℃温度下孵育10～ 15min，使核磁共振造影剂与待检样本中的稀有细胞发生免疫反应富集后， 再次用低场核磁共振分析仪进行弛豫时间测定，得弛豫时间值T₂’；

(4)标准曲线制作与结果得出

计算标准样本的弛豫时间改变量ΔT2，所述ΔT2＝T₂-T₁，以ΔT2为纵 坐标，以标准样本中的目标稀有细胞含量为横坐标，绘制成标准曲线；

计算待检样本的弛豫时间改变量ΔT2_test，所述ΔT2_test＝T₂’-T₁’， ΔT2_test不为0，则表明待检样本中含有目标稀有细胞，同时依据上述标准曲 线得出待检样本中目标稀有细胞的含量。

由上述检测步骤可知：本发明利用核磁共振造影剂可以和稀有细胞结合 的特性，运用免疫磁性分离技术，在外加低磁场的作用下通过检验磁珠-细胞 悬浮液中水分子的氢原子信号来定量循环稀有细胞。

具体来说，本发明在利用密度梯度离心等方法前期处理细胞样品后，加 入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂(即NMR检测反应 体系)，采用适宜温度孵育诱导目标稀有细胞和免疫磁性微珠结合。通过NMR 检测孵育前后两次弛豫时间变化来定量地反应体系中目标稀有细胞的数目信 息。由于整个检测反应没有任何样品、试剂的加入和转移，使得体系处于一 个稳定状态，排除了两次检测中由于外来物引入导致的假阳性，使得检测更 加准确精密。本发明中所述的目标稀有细胞的最终检出评价方法基于核磁共 振技术的弛豫时间特性参数的变化，所述弛豫时间特性，是指自旋-晶格弛 豫时间和自旋-自旋弛豫时间T。

优选地，本发明的检测方法中，步骤(2)中所使用的核磁共振造影剂 为顺磁性纳米磁珠或超顺磁性纳米磁珠，且所述的顺磁性纳米磁珠或超顺磁 性纳米磁珠优选为抗EpCAM免疫纳米磁珠、抗CD45免疫纳米磁珠、链霉 亲和素纳米磁珠、叶酸修饰的磁性脂质体中的一种或几种。

由于磁性微珠很小只有50nm(目前市面上商业化的同类磁珠多为μm 级)，对细胞的功能和活性都不会产生影响，完全满足于稀有细胞检测需求 (活细胞且细胞不会受损)。上述的免疫磁珠将固化试剂特有的优点与免疫 学反应的高度特异性结合于一体，从而快速地实现从混合细胞群中捕获和分 离稀有目标细胞的目的，所得稀有细胞可用于计数或其他方面研究应用。

优选地，本发明的检测方法中，所述步骤(2)中，在加入偶联有目标 稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂之前，还包括下述步骤：加入偶联 有抗CD45的核磁共振造影剂将非目标细胞进行磁性标记，通过外加磁场方 式将上述标记的非目标细胞除去。

本发明中免疫磁珠富集方法，除上述发明内容中步骤(2)所描述的直 接加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂，使核磁共振造 影剂与稀有细胞发生靶向免疫(抗原抗体反应)富集(阳性富集)外，亦可 采用阴性+阳性双富集的方法达到目标细胞磁性富集的目的。具体操作方法 即为：在加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂之前，先 利用偶联有抗CD45的核磁共振造影剂(磁性微珠)将非目标细胞(主要为 上皮细胞中含量较多的白细胞等)进行磁性标记，通过外加磁场方式将白细 胞从含有目标稀有细胞的细胞群混合物中去除掉(阴性标记非目标细胞)； 然后，上述获得细胞亚群混合物，根据亚群标志物选择适宜的偶联有目标细 胞特异表达抗体的核磁共振造影剂(磁性微珠)进行免疫反应富集，从而获 得标记有目标细胞的核磁共振造影剂(阳性标记目标细胞)。通过上述阴性 +阳性双富集的操作方法，可达到排出干扰因素、更精确可靠地实现目标细 胞磁性富集的目的。

优选地，本发明的检测方法中，所述步骤(2)中，核磁共振造影剂加 入量优选为：每200个目标稀有细胞中加入1微升核磁共振造影剂。此比例 的核磁共振造影剂不但可以最优化地获得稀有细胞，还能够减少由于核磁共 振造影剂加入过多导致的背景增强，影响检测效果。

优选地，本发明的检测方法中，所述步骤(2)和步骤(3)中，控制低 场核磁共振分析仪的磁场强度为20～25MHz，磁体温度为30～35℃，重复时 间3～5s。更优选地，控制低场核磁共振分析仪的磁场强度优选为20.18MHz， 磁体温度优选为35℃，重复时间优选为5s。

对上述核磁共振体系磁场强度、磁体温度和重复时间的控制，可使检测 更加准确，可控性更强，且利于平行实验的比较和质控。

优选地，本发明的检测方法中，所述步骤(4)中，计算标准样本的弛豫 时间改变量ΔT2和待检样本的弛豫时间改变量ΔT2_test时，分别取多次测量 弛豫时间的平均值进行计算，从而能使本发明的检测结果更为准确可靠。

由上述的论述可知，本发明通过将核磁共振造影剂(如超顺免疫微磁珠) 富集和低场核磁共振仪检测相结合，将稀有细胞的分离和鉴定有机整合在一 起，从而快速实现从混合细胞群中捕获和分离稀有目标细胞。在本发明中利 用免疫磁性微珠选择和分离来高度富集和浓缩体液样品中存在的任何稀有细 胞，将所捕获的细胞可检测地标以稀有细胞特异性表达抗体，且被超顺磁性 微珠所包被，以使得能对所捕获的稀有细胞进行鉴别和计数以及与污染性非 靶细胞明确地在核磁共振仪上做区分。由于具有在每7.5ml体液中可检测到 微量稀有细胞的极强敏感性，是一种具有极强敏感性和特异性的广谱的分离 方案。更重要的，本发明的检测方法由于两次检测弛豫时间之间没有样品的 转移过程而避免了假阳性，该方法可以客观有效地对目标稀有细胞进行检测 和定量，相比于传统检测方法，该方法具有快速、便捷检测的优势，可以用 于大规模样本的快速检测。

现有的对于稀有细胞的检测方法均涉及到免疫荧光技术，需通过荧光显 微镜镜检来对体液中循环稀有细胞的个数进行定量，普遍具有操作复杂、灵 敏性低、检验时间长、价格高、对操作人员要求高，不易重复的弊端(如 i·FISH检测方法成熟的操作人员单次仅能同时操作6个样本，整个过程耗 时2天)。与现有技术相比，本发明将偶联有特异表达抗体的核磁共振造影 剂富集稀有目标细胞技术与具有快速和高灵敏度检测技术的低场核磁共振仪 相结合，从而实现了快速、高效而高灵敏地检测外周血中稀有细胞的目的， 具有如下优点:(1)可使目标稀有细胞直接从生物体液中分离出来,具有简便、 快速的特点；(2)和离心、过滤等方法相比，稀有细胞在磁性分离时受到的 剪切力小，可避免细胞的失活；(3)具有很高的选择性；(4)外加磁场不 会对原料液中的离子和带电溶质的运动产生影响；(5)仪器设备简单，操作 费用低。(6)本发明属同一反应体系的两次NMR检测，期间无样品转移从 而避免了外来物质引入导致的假阳性，进一步提高了检测的准确率及便捷性。 可适应大规模高通量检测。本发明的方法可以实现大规模样本的稀有细胞快 速检测，无论对于产业化还是客户体验上都无疑具有重要的意义。该方法为 首次被提出，目前未见相关报道，且该方法适用于对生物体液样本中的各种 稀有细胞(包括所有的循环稀有上皮细胞)的检测、鉴定和定量分析。

附图说明

图1是本发明的稀有细胞检测方法的流程图；

图2是实施例1中以标准样本的弛豫时间改变量ΔT2为纵坐标、以标 准样本中的目标稀有细胞含量为横坐标所制成的标准曲线。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发 明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解， 在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细 节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改， 也可以实现本申请各权利要求所要求保护的技术方案。

实施例1

(1)样本制备

待检样本制备：

1.1 从乳腺癌模型鼠处获得抗凝血样(～10ml)，所述样品包含怀疑含 有目标稀有细胞的混合细胞群。采集的标本应在当天处理！室温避光保持时 间不应超过24小时；

1.2 Ficoll密度梯度离心法获取候选混合细胞群

1)加入适量细胞分层液(Ficoll溶液配制而成)至无菌离心管A底部，然 后将上述抗凝血测试样以PBS液作适当稀释后(2:1)，沿管壁轻轻加在 分层液上面，使两者形成一个清晰的界面。

2)400×g水平离心30min(离心机转速的增加和减少要均匀、平稳，以 保证形成清晰的界面)。

3)离心后管内最终可见三层液体，上层为黄色液体，中间层为透明液体，底 层为棕红色沉积红细胞(红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞 遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。血小板则因密度小而悬浮于 血浆中，唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界 面中，呈白膜状)，吸取该层细胞递经洗涤高心重悬(300×g 10min洗 涤两次)于B管中而获得可用于下一步免疫微磁珠富集的细胞悬浮液样 本。

标准样本制备：

将纯培养目标稀有细胞，以PBS进行不同梯度稀释 (0,10,10²,10³,10⁴,10⁵,10⁶,10⁷cell/ml)，从而获得系列浓度的目标稀有 细胞悬浮液标准样本；

(2)亲和富集前核磁共振弛豫时间检测

将偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的超顺磁免疫磁珠(以200cell/1ul 磁珠的比例)加入处理好的标准样本细胞体系中(溶于一定体积的缓冲液中)， 充分混合均匀(手动混匀)后立即用低场核磁共振分析仪测定核磁共振的弛豫 时间T1；

取上述待检样本，加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的超顺磁免疫 磁珠，混合均匀后立即用低场核磁共振分析仪进行弛豫时间测定，得弛豫时 间值T₁’。

(3)亲和富集后核磁共振弛豫时间检测与结果得出

取上述加入超顺磁免疫磁珠的标准样本，4～8℃低温孵育15min，使超 顺磁免疫磁珠与标准样本中的稀有细胞发生免疫反应富集后，再次用低场核 磁共振分析仪测定核磁共振的弛豫时间T₂；

取上述加入核磁共振造影剂的待检样本，在4～8℃低温下孵育15min， 使超顺磁免疫磁珠与待检样本中的稀有细胞发生免疫反应富集后，再次用低 场核磁共振分析仪进行弛豫时间测定，得弛豫时间值T₂’。所述T₁及T₂’ 需分别测量三遍并取平均值。

计算标准样本的弛豫时间改变量ΔT2，所述ΔT2＝T₂-T₁，以弛豫时间 改变量(ΔT2)为纵坐标，以标准样本中目标稀有细胞含量为横坐标，绘制 成标准曲线。

上述步骤中使用低场核磁共振分析仪(1.5T)进行核磁共振检测弛豫时 间的仪器参数如下：磁场强度20.18MHz，磁体温度35℃，重复时间5s，每 次数据测量3次后取平均值。

计算待检样本的弛豫时间改变量ΔT2_test，所述ΔT2_test＝T₂’-T₁’， ΔT2_test不为0，则表明待检样本中含有目标稀有细胞，同时依据上述标准曲 线得出待检样本中目标稀有细胞的含量。

系列标准样本中循环稀有细胞定量和鉴定结果统计表：

细胞个数 5 10 20 30 40 50 ΔT2(ms) 11 18 33 56 113 162

根据上表中的数据而绘制的标准曲线如附图2所示。

待检样本的弛豫时间测量结果为：

  1 2 3 平均值 T1’ 5.6 2.2 6.7 4.83 T₂’ 26.7 25.5 24.9 25.70 ΔT2_test21.1 23.3 18.2 20.87

由计算公式：y＝9.321le^(0.0596Χ)，计算可得待测样品中稀有细胞数目 为：13.5。

结果验证

为了验证样品转移带来的假阳性，我们设计了如下实验。

检测0.5ml缓冲液的弛豫时间T1，重复3遍。

向上述缓冲液体系中加入1.5μg磁珠，使液体中磁珠浓度变为 3*10^-3mg/ml，检测其弛豫时间T1，重复3遍。

数据如下：

由上述数据可看出，外来磁珠的加入即可导致体系弛豫时间的巨大变 化，这就为稀有细胞检测带来了假阳性结果。

本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体 实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏 离本发明的精神和范围。