可并行检测奶牛乳房炎十种主要致病菌的基因芯片及检测方法

摘要

本发明公开一种可并行检测奶牛乳房炎十种主要致病菌的基因芯片及检测方法，所述基因芯片包括芯片载体，在芯片载体上固定有用于检测奇异变形杆菌、停乳链球菌、无乳链球菌、表皮葡萄球菌、乳房链球菌、肺炎克雷伯菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和伤寒沙门氏菌的核苷酸探针，还固定有固定阳性对照、杂交阳性对照和杂交阴性对照。该基因芯片针对gyrB和fliC的不同位点设计了多条探针，有效避免了不同亚型菌种核酸序列的差异以及菌种基因组中少数碱基突变而造成的漏检现象，实现对奶牛乳房炎中十种主要病原菌的高通量、高特异性、高灵敏度、高效快捷的检测，对于奶牛养殖、奶牛乳房炎中病原菌的监测和预警具有实际意义。

说明书

技术领域：

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种可并行检测奶牛乳房炎十种主要致病菌的基因芯片及检测方法。

背景技术：

基因芯片技术（Gene chip）是20世纪90年代初期发展起来的一种基因分析的高新生物技术，是将人工合成的目的基因的核苷酸片段（探针）点置于一定的载体上，然后提取待测微生物的全基因组DNA，通过PCR扩增该目的基因片段，并在这些基因片段上标记荧光物质后，在合适的条件下使其与芯片上的探针杂交，同源性高的片段会通过杂交互补配对，经清洗扫描，会在相应的矩阵探针位点显示荧光信号。基因芯片检测的目的片段可以是PCR产物、基因组DNA、总RNA、cDNA、质粒DNA或者寡核苷酸等（Schena etal,2000）。目前报道的检测方法中以多重PCR结合基因芯片方法、通用引物结合基因芯片方法等为主。基因芯片技术在微生物鉴定中的应用，具有特异性强、灵敏度高的特点，尤其是在应对大量、复杂的样品时优势更为明显，便捷高效、成本低廉、误差小。其突出的特点是集成化、微型化、自动化、高通量等，可以高通量、平行化对多种靶基因进行准确鉴定，可为现代微生物菌种识别、毒力因子确定、耐药性检测等提供完善的技术平台（Call etal,2001）。因此，很有必要在短期内利用高新分子生物学技术建立起多种感染性致病菌的高通量、快速、准确的监测体系，以确保在较短的时间内正确诊断诸如奶牛乳房炎等的多种致病菌感染性疾病，以提高我国多感染性致病菌预防、诊断和控制的能力。

奶牛乳房炎致病菌感染能力、传播途径广，同时由于抗生素的大量使用和药物残留的问题使人们在面对奶牛乳房炎的高发和群发时，时常束手无策，多种致病菌通过散发性、群体性发病对奶业造成重大的损失，进而给人们的奶制品消费造成很大影响，对消费者的正常生活质量、社会经济持续发展等方面带来不可估量的损失，因此，对引起奶牛乳房炎的主要致病菌实现快速平行检测已迫在眉睫。引起奶牛乳房炎的致病菌种类众多，目前已知的致病菌大约有220多种其中常见的就有20多种，而90%奶牛乳房炎致病菌主要为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌、停乳链球菌、乳房链球菌、无乳链球菌、伤寒沙门氏菌、绿脓杆菌、志贺氏菌、蜡样芽胞杆菌等。现有技术中有对奶牛乳房炎主要致病菌的检测基因芯片及检测方法的研究，如发明专利CN 101492739A公开的一种奶牛乳房炎主要致病菌的检测基因芯片及检测方法，其是对6种奶牛乳房炎主要致病菌（无乳链球菌、停乳链球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌和金黄色葡萄球菌）基因芯片检测方法的研究，所述基因芯片包括固相载体和固定在固相载体上的特异性检测探针，特异性检测探针包含以大肠杆菌16S rDNA保守区为基底序列设计的通用引物序列之间的6种奶牛乳房炎主要致病菌的可变区域内设计的特异性寡核苷酸杂交探针，并限定了PCR反应的退化温度、优化了PCR扩增的核酸片段和基因芯片进行杂交的条件，获得很好的杂交效果，最终得到准确的检测结果。该方法利用16S rDNA保守区为基底序列设计通用引物，将其作为细菌检测盒鉴定的靶分子，但由于16S rRNA对于亲缘关系较近的细菌分辨率不够，且不同亚型菌种核酸序列的差异以及菌种基因组中少数碱基突变都会造成漏检现象。 

发明内容：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种可并行检测奶牛乳房炎十种主要致病菌奇异变形杆菌、停乳链球菌、无乳链球菌、表皮葡萄球菌、乳房链球菌、肺炎克雷伯菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和伤寒沙门氏菌的基因芯片及检测方法，实现对复杂样本的并行快捷、高通量、高特异性、高灵敏度的检测。

已有的奶牛乳房炎主要致病菌的基因芯片是利用16S rRNA保守区作为基底序列设计通用引物，将其作为细菌检测盒鉴定的靶分子，然而16S rRNA对于亲缘关系较近的细菌分辨率不够，申请人经过长期的研究发现，采用gyrB作为细菌鉴定和分类的靶基因，gyrB基因是编码DNA解旋酶B亚基的基因，该基因进化速率较快，碱基替换频率较高，能比16srRNA基因更好地区分相似种，能够满足奇异变形杆菌、停乳链球菌、无乳链球菌、表皮葡萄球菌、乳房链球菌、肺炎克雷伯菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌九种细菌的鉴定需求。另外，由于当前沙门氏菌的命名比较混乱，通过对16s rRNA和gyrB序列的保守性分析，根据两种基因序列设计探针，可能只能鉴定到沙门氏菌属，而无法保证设计的探针特异性只针对鼠伤寒沙门氏菌。经过大量的文献调研，申请人采用fliC作为鉴定伤寒沙门氏菌的靶基因。因此，本发明针对上述十种常见奶牛乳房炎致病菌，根据gyrB和fliC两种基因分别选取特异性探针，以保证各个菌种探针之和对应的菌种产生特异性信号，同时针对所述的十种细菌的gyrB和fliC两种基因，分别设计了多条探针，有效避免了由于不同亚型菌种核酸序列的差异以及菌种基因组中少数碱基突变而造成的漏检现象。 

本发明是采取以下技术方案予以实现： 

一种可并行检测奶牛乳房炎十种主要致病菌的基因芯片，包括有芯片载体，在芯片载体上固定有用于检测奇异变形杆菌、停乳链球菌、无乳链球菌、表皮葡萄球菌、乳房链球菌、肺炎克雷伯菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和伤寒沙门氏菌的核苷酸探针。

所述的用于检测奇异变形杆菌、停乳链球菌、无乳链球菌、表皮葡萄球菌、乳房链球菌、肺炎克雷伯菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的探针是从gyrB基因中设计的。 

所述的用于检测伤寒沙门氏菌探针是从gyrB和fliC基因中设计的。 

所述的用于检测奇异变形杆菌（pro）的核苷酸探针，其序列为SEQ ID NO:1。 

所述的用于检测停乳链球菌（sdy）的核苷酸探针，其序列为SEQ ID NO:2。 

所述的用于检测无乳链球菌（sag）的核苷酸探针，其序列为SEQ ID NO:3。 

所述的用于检测表皮葡萄球菌（sep）的核苷酸探针，其序列为SEQ ID NO:4。 

所述的用于检测乳房链球菌（supi）的核苷酸探针，其序列为SEQ ID NO:5。 

所述的用于检测肺炎克雷伯菌（kpn）的核苷酸探针，其序列为SEQ ID NO:6。 

所述的用于检测绿脓杆菌（pae）的核苷酸探针，其序列为SEQ ID NO:7。 

所述的用于检测金黄色葡萄球菌（sau）的核苷酸探针，其序列为SEQ ID NO:8。 

所述的用于检测大肠杆菌（eco）的核苷酸探针，其序列为SEQ ID NO:9。 

所述的用于检测伤寒沙门氏菌（sen）的核苷酸探针，其序列为SEQ ID NO:10。 

表1：本发明所用到的探针序列信息表 

本发明的芯片上还固定有固定阳性对照（HEX）、杂交阳性对照（PC）和杂交阴性对照（NC），其核苷酸序列依次为SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13。

上述与阳性质控探针杂交的阳性质控片段为杂交PC-TAMRA，其核苷酸序列为SEQ ID NO:14。（质量控制探针和阳性质控片段的序列信息如表2）。 

表2：质量控制探针和阳性质控片段的序列信息 

本发明的基因芯片制备步骤为：

将核苷酸探针稀释至适当浓度后，在晶芯PersonalArrayer 16个人点样仪（CapitalBio）上，根据实际情况分别对384孔点样板、玻片、针架、点阵、样品和清洗参数进行设置，通过运行晶芯PersonalArrayer 16个人点样仪将探针点制于固相氨基芯片上；然后用博奥晶芯LuxScan10K扫描仪 ，检测芯片点制情况。

上述步骤核苷酸探针稀释至适当浓度，是使用无菌水溶解各探针至40 μM，与晶芯^@基因芯片点样液1:1的比例进行混合，使各探针终浓度为20 μM；然后将探针按照设计好的探针排布表，依次添加到384孔点样板中。 

本发明所述的可并行检测奶牛乳房炎十种主要致病菌的基因芯片的检测方法，依次包括以下步骤： 

（1）待检样本核酸的提取：从采集到的奶牛乳房炎病牛奶样中分离获得细菌；然后用CTAB/NaCl法提取所得细菌的基因组DNA作为模板备用；

（2）普通或多重PCR扩增反应：普通或多重PCR扩增体系是：2 μL 10×PCR 反应缓冲液，0.4 μL 10 mM dNTPs，1 U Taq DNA 聚合酶，0.5 μL 10μM 上游引物和0.5 μL 10μM 下游引物，1-2μL（约100 ng）待检样品DNA，双蒸水补足到20 μL总体积。且所述PCR 反应的条件为：94℃ 预变性5 min；94℃变性30 s，55℃（根据引物退火温度调整） 退火30 s，72℃ 延伸1 min30 s，35 个循环；72℃延伸10 min，4℃保存；

（3）荧光标记PCR反应：①预处理：直接取5 μL PCR产物作为模板至无菌洁净的0.2 ml离心管中，然后向每个样品管中加入3 μL随机引物，并补水至19 μL，振荡混匀，瞬时离心；再将离心后的样品管放入PCR仪，95℃变性3 min，立即冰浴3 min，瞬时离心；②荧光标记：取一新的0.2 ml离心管置于在冰上，依次向内添加2.5 μL 5×Klenow Buffer，1 μL Klenow 酶，2.5 μL 2.5 mM dNTPs；然后将6 μL的荧光标记反应体系Mix加入到经过预处理的样品管中，振荡混匀，瞬时离心；最后把样品管放入PCR仪中，先37℃ 反应90 min，再72℃ 反应10 min，4℃保存；

（4）杂交：①配制杂交体系：在42℃融化杂交缓冲液，取一无菌洁净的0.2 ml离心管，依次向内添加5 μL杂交缓冲液、15 μL荧光标记物，置于冰上备用；②杂交：打开芯片杂交盒，将杂交盒平放桌面上，在杂交和底部凹槽内加入约80 μL无菌水，以防止杂交过程中杂交液大量挥发；将芯片正面朝上（标签朝向操作者）放入杂交盒内两个定位销之间；放上芯片盖片（有凸台的一面朝向芯片），上端先接触芯片，再缓缓盖下；用移液器通过盖玻片加样孔缓慢注入20 μL变性后的杂交液，杂交液会凭借液体表面张力在盖玻片下面的凸台和芯片表面之间形成一道液膜，不要震动盖片或芯片避免破坏液膜；将杂交盒的盖板扣上，确保槽板两端的定位销分别插入盖板两端的定位销孔中；扣上盖板后，分别将两个金属夹卡进两侧，注意：动作要平缓，不要让杂交盒有大的震动，以防止杂交液溅出点阵区域；另外，金属夹需要完全卡进，以确保杂交盒的密封性；将杂交盒放入博奥BioMixerTMⅡ杂交仪，42℃，反应2h或过夜。

（5）洗脱：使用晶芯芯片清洗仪对芯片进行清洗：①两种洗脱液的配置：洗脱液Ⅰ为2×柠檬酸钠盐溶液和0.2% 十二烷基硫酸钠溶液的混合物，洗脱液Ⅱ为0.2×柠檬酸钠盐溶液：②洗脱操作：在42℃下，先用洗脱液Ⅰ清洗两次，每次 120 s；然后用洗脱液Ⅱ清洗三次，每次80 s，1500 rpm离心1 min甩干； 

（6）使用扫描仪检测，分析结果：使用扫描仪扫描出结果，使用分析软件量化各点的信号值。

本发明在现有基因芯片的基础上经过一系列的优化研究，不算入制备基因芯片的时间，整个样品检测时间能在6小时内完成，并且由于针对gyrB和fliC的不同位点设计了多个探针，因此该基因芯片一方面能有效避免单一探针在鉴定不同亚型的微生物时漏检的情况，另一方面能有效降低单一探针在鉴定微生物时基因突变导致的漏检情况；优化的标准操作流程尽可能避免人为操作的影响，稳定性更好。总体而言，本发明能够突破现有微生物检测技术的种种弊端，实现对奶牛乳房炎中十种主要病原菌的高通量、高特异性、高灵敏度、高效快捷的检测，对于奶牛养殖、奶牛乳房炎中病原菌的监测和预警具有实际意义。 

附图说明：

 图1是本发明基因芯片特异性检测—无关菌试验的结果图；

图2是本发明基因芯片特异性检测—标准菌试验的结果图；

图3是本发明基因芯片特异性检测—两株标准菌试验的结果图；

     图4是本发明基因芯片灵敏度检测—无乳链球菌的结果图。 

具体实施方式：

     下面结合具体实施例及附图对本发明进一步详细说明。

 1.探针的设计 

本发明的基因芯片用来检测奶牛乳房炎病牛奶样中的十种常见致病菌，包括奇异变形杆菌、停乳链球菌、无乳链球菌、表皮葡萄球菌、乳房链球菌、肺炎克雷伯菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和伤寒沙门氏菌。其使用的探针均根据菌种的gyrB和fliC基因序列设计而成，经过BLAST对比保证其特异性，所用探针、引物序列信息见表3。所用探针、引物由专门的公司行业合成。

表3：本发明所用探针、引物的序列信息 

2.所述基因芯片的构建：

（1）商业合成的寡核苷酸探针稀释至适当浓度：使用无菌水溶解各探针至40 μM，与晶芯@基因芯片点样液1:1的比例进行混合，使各探针终浓度为20 μM。然后，根据实际情况分别对384孔点样板、玻片、针架、点阵、样品和清洗参数进行设置，通过运行晶芯PersonalArrayer 16个人点样仪将探针点制于固相氨基芯片上。上述构建的基因芯片探针的一种点样阵列如表4。

表4：上述基因芯片探针的一种点样阵列 

注：HEX为点样质控探针；NC为杂交阴性质控探针；PC为杂交阳性质控探针。

（2）探针与芯片水合交联：点制之后需要在37℃湿盒内水和杂交12 h。 

（3）水合后芯片处理：使用双蒸水清洗3次，每次2分钟，洗脱去未连接的、连接不紧密的探针。使用0.2% NaBH₄ 封闭：使芯片完全浸没，静置5 min后，150 pm 振荡5 min，再静置5 min；最后用双蒸水清洗3次，每次2 min。2000 rpm离心2 min去除芯片表面水迹，4℃避光保存备用。 

3.所述基因芯片的检测方法 

（1）待检测样本核酸的提取：首先，从采集到的奶牛乳房炎病牛奶样中分离获得细菌；然后用CTAB/NaCl法提取所得细菌的基因组DNA作为模板备用；

（2）PCR扩增：①普通或多重PCR扩增体系：2 μL 10×PCR reaction buffer，0.4 μL 10 mM dNTPs，1 U Taq DNA Polymerase，0.5 μL 10μM 上游引物和0.5 μL 10μM 下游引物，1-2μL（约100 ng）待检样品DNA，双蒸水补足到20 μL总体积。②PCR 反应条件：94℃ 预变性5 min；94℃变性30 s，55℃（根据引物退火温度调整） 退火30 s，72℃ 延伸1 min 30 s，35 个循环；72℃延伸10 min，4℃保存；

（3）荧光标记PCR产物：①预处理：直接取5 μL PCR产物作为模板至无菌洁净的0.2 ml离心管中，然后向每个样品管中加入3 μL随机引物，并补水至19 μL，振荡混匀，瞬时离心；再将离心后的样品管放入PCR仪，95℃变性3 min，立即冰浴3 min，瞬时离心；②荧光标记：取一新的0.2 ml离心管置于在冰上，依次向内添加2.5 μL 5×Klenow Buffer，1 μL Klenow 酶，2.5 μL 2.5 mM dNTPs；然后将6 μL的荧光标记反应体系Mix加入到经过预处理的样品管中，振荡混匀，瞬时离心；最后把样品管放入PCR仪中，先37℃ 反应90 min，再72℃ 反应10 min，4℃保存；

（4）杂交：①配制杂交体系：在42℃融化杂交buffer，取一无菌洁净的0.2 ml离心管，依次向内添加5 μL杂交buffer、15 μL荧光标记物，置于冰上备用；②杂交：打开芯片杂交盒，将杂交盒平放桌面上，在杂交和底部凹槽内加入约80 μL无菌水，以防止杂交过程中杂交液大量挥发；将芯片正面朝上（标签朝向操作者）放入杂交盒内两个定位销之间；放上芯片盖片（有凸台的一面朝向芯片），上端先接触芯片，再缓缓盖下；用移液器通过盖玻片加样孔缓慢注入20μL变性后的杂交液，杂交液会凭借液体表面张力在盖玻片下面的凸台和芯片表面之间形成一道液膜，不要震动盖片或芯片避免破坏液膜；将杂交盒的盖板扣上，确保槽板两端的定位销分别插入盖板两端的定位销孔中；扣上盖板后，分别将两个金属夹卡进两侧，注意：动作要平缓，不要让杂交盒有大的震动，以防止杂交液溅出点阵区域；另外，金属夹需要完全卡进，以确保杂交盒的密封性；将杂交盒放入博奥BioMixerTMⅡ杂交仪，42℃，反应2 h或过夜；

（5）洗脱：使用晶芯芯片清洗仪对芯片进行清洗。①两种洗脱液的配置：洗脱液Ⅰ为2×柠檬酸钠盐溶液和0.2% 十二烷基硫酸钠溶液的混合物，洗脱液Ⅱ为0.2×柠檬酸钠盐溶液：②洗脱操作：在42℃下，先用洗脱液Ⅰ清洗两次，每次 120 s；然后用洗脱液Ⅱ清洗三次，每次80 s，1500 rpm离心1 min甩干；

（6）扫描芯片，分析结果：使用扫描仪扫描芯片，输出图像。使用分析软件量化各点的信号值。阳性结果有清晰的杂交信号。

4.使用基因芯片检测奇异变形杆菌 

（1）待检测样本核酸的提取：按照CTAB/NaCl法提取奇异变形杆菌的基因组DNA作为模板备用；

（2）PCR扩增：①普通或多重PCR扩增体系：2 μL 10×PCR reaction buffer，0.4 μL 10 mM dNTPs，1 U Taq DNA Polymerase，0.5 μL 10μM 上游引物和0.5 μL 10μM 下游引物，1-2μL（约100 ng）待检样品DNA，双蒸水补足到20 μL总体积。②PCR 反应条件：94℃ 预变性5 min；94℃变性30 s，55℃（根据引物退火温度调整） 退火30 s，72℃ 延伸1 min30 s，35 个循环；72℃延伸10 min，4℃保存；

（3）荧光标记PCR产物：①预处理：直接取5 μL PCR产物作为模板至无菌洁净的0.2 ml离心管中，然后向每个样品管中加入3 μL随机引物，并补水至19 μL，振荡混匀，瞬时离心；再将离心后的样品管放入PCR仪，95℃变性3 min，立即冰浴3 min，瞬时离心；②荧光标记：取一新的0.2 ml离心管置于在冰上，依次向内添加2.5 μL 5×Klenow Buffer，1 μL Klenow 酶，2.5 μL 2.5 mM dNTPs；然后将6 μL的荧光标记反应体系Mix加入到经过预处理的样品管中，振荡混匀，瞬时离心；最后把样品管放入PCR仪中，先37℃ 反应90 min，再72℃ 反应10 min，4℃保存；

（4）杂交：①配制杂交体系：在42℃融化杂交buffer，取一无菌洁净的0.2 ml离心管，依次向内添加5 μL杂交buffer、15 μL荧光标记物，置于冰上备用；②杂交：打开芯片杂交盒，将杂交盒平放桌面上，在杂交和底部凹槽内加入约80 μL无菌水，以防止杂交过程中杂交液大量挥发；将芯片正面朝上（标签朝向操作者）放入杂交盒内两个定位销之间；放上芯片盖片（有凸台的一面朝向芯片），上端先接触芯片，再缓缓盖下；用移液器通过盖玻片加样孔缓慢注入20μL变性后的杂交液，杂交液会凭借液体表面张力在盖玻片下面的凸台和芯片表面之间形成一道液膜，不要震动盖片或芯片避免破坏液膜；将杂交盒的盖板扣上，确保槽板两端的定位销分别插入盖板两端的定位销孔中。扣上盖板后，分别将两个金属夹卡进两侧，注意：动作要平缓，不要让杂交盒有大的震动，以防止杂交液溅出点阵区域；另外，金属夹需要完全卡进，以确保杂交盒的密封性；将杂交盒放入博奥BioMixerTMⅡ杂交仪，42℃，反应2 h或过夜；

（5）洗脱：使用晶芯芯片清洗仪对芯片进行清洗。①两种洗脱液的配置：洗脱液Ⅰ为2×柠檬酸钠盐溶液和0.2% 十二烷基硫酸钠溶液的混合物，洗脱液Ⅱ为0.2×柠檬酸钠盐溶液：②洗脱操作：在42℃下，先用洗脱液Ⅰ清洗两次，每次 120 s；然后用洗脱液Ⅱ清洗三次，每次80 s，1500 rpm离心1 min甩干；

（6）扫描芯片，分析结果：使用扫描仪扫描芯片，输出图像。使用分析软件量化各点的信号值。汇总点制阵列信息和扫描信息从而明确检测结果；

（7）本实施例方法的检测结果表明，基因芯片仅对奇异变形杆菌的gyrB基因检测出较强的信号值，没有出现假阴性情况，且特异性好。

5.使用基因芯片检测停乳链球菌 

检测方法同实施例4，检测结果扫描图像表明，基因芯片仅对停乳链球菌的gyrB基因检测出较强的信号值，没有出现假阴性情况，且特异性好。

6.使用基因芯片检测无乳链球菌 

检测方法同实施例4，检测结果扫描图像表明，基因芯片仅对无乳链球菌的gyrB基因检测出较强的信号值，没有出现假阴性情况；且特异性好。

7.使用基因芯片检测表皮葡萄球菌 

检测方法同实施例4，检测结果扫描图像表明，基因芯片仅对表皮葡萄球菌的gyrB基因检测出较强的信号值，没有出现假阴性情况，且特异性好。

8.使用基因芯片检测乳房链球菌 

检测方法同实施例4，检测结果扫描图像表明，基因芯片仅对乳房链球菌的gyrB基因检测出较强的信号值，没有出现假阴性情况，且特异性好。

9.使用基因芯片检测肺炎克雷伯菌 

检测方法同实施例4，检测结果扫描图像表明，基因芯片仅对肺炎克雷伯菌的gyrB基因检测出较强的信号值，没有出现假阴性情况，且特异性好。

10.使用基因芯片检测绿脓杆菌 

检测方法同实施例4，检测结果扫描图像表明，基因芯片仅对绿脓杆菌的gyrB基因检测出较强的信号值，没有出现假阴性情况，且特异性好。

11.使用基因芯片检测金黄色葡萄球菌 

检测方法同实施例4，检测结果扫描图像表明，基因芯片仅对金黄色葡萄球菌的gyrB基因检测出较强的信号值，没有出现假阴性情况，且特异性好。

12.使用基因芯片检测大肠杆菌 

检测方法同实施例4，检测结果扫描图像表明，基因芯片仅对大肠杆菌的gyrB基因检测出较强的信号值，没有出现假阴性情况，且特异性好。

13.使用基因芯片检测伤寒沙门氏菌 

检测方法同实施例4，检测结果扫描图像表明，基因芯片仅对伤寒沙门氏菌的gyrB基因检测出较强的信号值，没有出现假阴性情况，且特异性好。

对本实施例基因芯片进行的特异性检测，包括无关菌试验、标准菌试验和两株标准菌试验，如图1~3所示，其检测结果如下： 

（1）基因芯片特异性检测—无关菌试验：无关菌为A-肺炎链球菌 5-D、B-普通变形杆菌 1527、 C-溶血葡萄球菌 CN4，由图1所示：1为PCR扩增结果，2为基因芯片杂交结果，PCR扩增在扩增A、B和C三种细菌时，引物特异性良好，并且PCR产物与基因芯片之间均无杂交信号，检测结果表明芯片的特异性良好。

（2）基因芯片特异性检测—标准菌试验：对十种致病菌：奇异变形杆菌、停乳链球菌、无乳链球菌、表皮葡萄球菌、乳房链球菌、肺炎克雷伯菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和伤寒沙门氏菌分别单个进行基因芯片特异性检测，由图2所示，A图为PCR扩增结果，B图为基因芯片杂交结果，结果显示： PCR产物与基因芯片之间均无杂交信号，检测结果表明均无出现假阴性情况，特异性好。 

     （3）基因芯片特异性检测—两株标准菌试验：对奇异变形杆菌标准株和表皮葡萄球菌标准株杂交进行基因芯片特异性的检测，由图3所示，2、3行：奇异变形杆菌杂交信号，8、9行：表皮葡萄球菌杂交信号，1、22行：质控探针，结果显示：阳性结果有清晰的杂交信号，特异性好，通量高。 

14.基因芯片的灵敏度检测 

（1）待检测样本核酸的提取：按照CTAB/NaCl法提取无乳链球菌的基因组DNA作为模板，然后用Qubit2.0精确测量无乳链球菌核酸浓度，根据核酸浓度计算出1 μl样品中所含基因组拷贝数，按拷贝数梯度稀释样品为1×10⁵、1×10⁴、5×10³、1×10³、5×10²、1×10²、5×10¹和1×10¹备用。

（2）PCR扩增体：①普通或多重PCR扩增体系：2 μL 10×PCR reaction buffer，0.4 μL 10 mM dNTPs， 1 U Taq DNA Polymerase，0.5 μL 10μM 上游引物和0.5 μL 10μM 下游引物，1-2μL（约100 ng）各梯度样品DNA，双蒸水补足到20 μL总体积。②PCR 反应条件：94℃ 预变性5 min；94℃变性30 s，55℃（根据引物退火温度调整） 退火30 s，72℃ 延伸1 min30 s，35 个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。 

（3）荧光标记PCR产物：①预处理：直接取5 μL PCR产物作为模板至无菌洁净的0.2 ml离心管中，然后向每个样品管中加入3 μL随机引物，并补水至19 μL，振荡混匀，瞬时离心；再将离心后的样品管放入PCR仪，95℃变性3 min，立即冰浴3 min，瞬时离心；②荧光标记：取一新的0.2 ml离心管置于在冰上，依次向内添加2.5 μL 5×Klenow Buffer，1 μL Klenow 酶，2.5 μL 2.5 mM dNTPs；然后将6 μL的荧光标记反应体系Mix加入到经过预处理的样品管中，振荡混匀，瞬时离心；最后把样品管放入PCR仪中，先37℃ 反应90 min，再72℃ 反应10 min，4℃保存。 

（4）杂交：①配制杂交体系：在42℃融化杂交buffer，取一无菌洁净的0.2 ml离心管，依次向内添加5 μL杂交buffer、15 μL荧光标记物，置于冰上备用；②杂交：打开芯片杂交盒，将杂交盒平放桌面上，在杂交和底部凹槽内加入约80 μL无菌水，以防止杂交过程中杂交液大量挥发；将芯片正面朝上（标签朝向操作者）放入杂交盒内两个定位销之间；放上芯片盖片（有凸台的一面朝向芯片），上端先接触芯片，再缓缓盖下；用移液器通过盖玻片加样孔缓慢注入20μL变性后的杂交液，杂交液会凭借液体表面张力在盖玻片下面的凸台和芯片表面之间形成一道液膜，不要震动盖片或芯片避免破坏液膜；将杂交盒的盖板扣上，确保槽板两端的定位销分别插入盖板两端的定位销孔中。扣上盖板后，分别将两个金属夹卡进两侧，注意：动作要平缓，不要让杂交盒有大的震动，以防止杂交液溅出点阵区域；另外，金属夹需要完全卡进，以确保杂交盒的密封性；将杂交盒放入博奥BioMixerTMⅡ杂交仪，42℃，反应2 h或过夜。 

（5）洗脱：使用晶芯芯片清洗仪对芯片进行清洗。①两种洗脱液的配置：洗脱液Ⅰ为2×柠檬酸钠盐溶液和0.2% 十二烷基硫酸钠溶液的混合物，洗脱液Ⅱ为0.2×柠檬酸钠盐溶液：②洗脱操作：在42℃下，先用洗脱液Ⅰ清洗两次，每次 120 s；然后用洗脱液Ⅱ清洗三次，每次80 s，1500 rpm离心1 min甩干。 

（6）扫描芯片，分析结果：使用扫描仪扫描芯片，输出图像。使用分析软件量化各点的信号值。阳性结果有清晰的杂交信号。 

本实施例方法以无乳链球菌为代表菌株，对该基因芯片的灵敏度进行检测分析，试验中无乳链球菌全基因组DNA的梯度浓度：1-1×10⁵，2-1×10⁴，3-5×10³，4-1×10³，5-5×10²，6-1×10²，7-5×10¹，8-1×10¹，9-NC，1×10⁵ ~ 1×10¹ 代表PCR扩增1 ul模板的基因组拷贝，由图4所示，结果显示：该基因芯片能够检测到低至5×10²拷贝的病原体核酸，因此结果表明该基因芯片的灵敏度较高。同样地，对其它九种致病菌奇异变形杆菌、停乳链球菌、表皮葡萄球菌、乳房链球菌、肺炎克雷伯菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、伤寒沙门氏菌采用该实施例方法，进行基因芯片的灵敏度检测，结果均表明该基因芯片的灵敏度较高。