一种铂杂化氧化铜多壁碳纳米管传感器的制备方法及应用

摘要

本发明属于免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种铂杂化氧化铜多壁碳纳米管免疫传感器的制备方法及应用。采用铂杂化的氧化铜多壁碳纳米管标记的电化学免疫传感器，实现了常见胰腺癌肿瘤标记物的检测，具有特异性强，灵敏度高，检测限低，对胰腺癌的检测具有重要的科学意义和应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于新型功能纳米材料、免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种铂杂化氧化铜多壁碳纳米管免疫传感器的制备方法及应用。

背景技术

肿瘤的发病率高，不易察觉，我国病例数相当庞大，占全世界病例数的55%，且肿瘤的生长和转移的速度快，对人类的健康产生极大危害。肿瘤标志物是肿瘤细胞产生和释放的以抗原、酶、激素等形式的代谢产物存在于肿瘤细胞内或宿主体液中，其在临床上对于随原发肿瘤的发现，肿瘤高危人群的筛选、良性和恶性肿瘤的鉴别诊断、肿瘤发展程度的判断，肿瘤的治疗效果的观察和评价及肿瘤复发和预后的预测产生极大的影响，引起人们的广泛关注。

CA199、CA242、CEA等常见的肿瘤标志物，对于胰腺癌的诊断都能起到一定的作用。夹心型电化学免疫传感器结合了高特异性的免疫分析技术和高灵敏的电化学分析技术，具有灵敏度高、制备简单、检测快速、成本低等优点，在临床检验、环境监测、食品安全控制、生物监测等领域都有重要的应用价值。

氧化石墨烯表面有大量的羧基官能团，使得他更容易与有机物结合反应。且具有大的比表面积，良好的电子传递能力和催化性能，能有效吸附固载抗体。β-环糊精的分子洞适中，应用范围广，生产成本低，是目前工业上使用最多的环糊精产品。β-环糊精其内腔疏水而外部亲水的特性使其可依据范德华力、疏水相互作用力、主客体分子间的匹配作用等与许多有机和无机分子形成包合物及分子组装体系，这种选择性的包络作用即通常所说的分子识别，其结果是形成主客体包络物，因此，β-环糊精还原石墨烯能结合更多的抗体且结合更牢固。

发明内容

本发明提供了一种铂杂化氧化铜多壁碳纳米管传感器的制备方法及应用，实现了对肿瘤标志物的超灵敏检测。

本发明的目的之一是提供一种铂杂化氧化铜多壁碳纳米管免疫传感器的制备方法。

本发明的目的之二是将所制备的铂杂化氧化铜多壁碳纳米管免疫传感器，用于检测肿瘤标志物。

本发明的技术方案，包括以下步骤。

1.一种铂杂化氧化铜多壁碳纳米管传感器的制备方法，步骤如下：

（1）将直径为4mm的玻碳电极用Al₂O₃抛光粉打磨，超纯水清洗干净；

（2）取6μL、0.5 ~ 1.5mg/mL的b-环糊精修饰的还原石墨烯滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；

（3）继续将6 μL、8 ~ 12 μg/mL的肿瘤标志物一抗Ab₁滴加到电极表面，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中干燥；

（4）继续将3 μL、0.5 ~ 1.5 mg/mL的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；滴加6 μL、0.001 ~ 20 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中干燥；

（5）将6 μL、1 ~ 3 mg/mL的Pt@CuO/MWCNT-Ab₂二抗孵化物溶液，滴涂于电极表面上，置于4 ℃冰箱中晾干，制得铂杂化氧化铜多壁碳纳米管传感器。

2.b-环糊精修饰的还原石墨烯的制备

称取60~100 mg的β-环糊精加入到20mL超纯水中，超声溶解，与20mL、0.4 ~ 0.6 mg/mL的氧化石墨烯溶液混合，依次加入200~300 μL氨水、10~20μL水合肼，强磁力搅拌5min，在60℃下水浴加热3.0 ~ 4.0小时，离心分离得到β-环糊精修饰的还原石墨烯。

3. Pt@CuO/MWCNT-Ab₂二抗孵化物溶液的制备

（1）Pt@CuO/MWCNT二抗标记物的制备

1）氧化铜多壁碳纳米管的合成

称取0.05 ~ 0.2 g CuO(OAc)₂与0.5 g多壁碳纳米管混合，研磨30 ~ 40 min, 在350℃、氩气保护下煅烧3 ~ 4  h，冷却，制得CuO/MWCNT；

2）Pt@CuO/MWCNT二抗标记物的合成

4~6 mg研磨过的CuO/MWCNT置于圆底烧瓶内， 20~30 mg的K₂PtCl₂溶于5 mL水中，超声溶解，置于上述圆底烧瓶中，用盐酸调节pH至3.2，100℃油浴中搅拌，回流12 h，冷却至室温，水洗，以8000rpm转速，每次10 min离心分离3次，烘干，制得Pt@CuO/MWCNT二抗标记物；

（2）Pt@CuO/MWCNT-Ab₂二抗孵化物溶液的制备

将2~6 mg的Pt@CuO/MWCNT二抗标记物分散到1 mL超纯水中，加入100 μL、80~120 μg/mL的肿瘤标志物二抗Ab₂溶液和900 μL、50 mmol/L的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h；在4 ℃下，6000 rpm转速下离心15 min，得到下层沉淀，加入1 mL、50 mmol/L 的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，得下层沉淀，最后加入1 mL、50 mmol/L 的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，制得Pt@CuO/MWCNT-Ab₂二抗孵化物溶液，4 ℃下保存备用。

4.胰腺癌肿瘤标志物的检测

（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.10 ~ 7.98磷酸盐缓冲溶液中进行测试；

（2）用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔 0.1 s，运行时间400 s；

（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液中注入10μL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。

上述所述肿瘤标志物选自下列之一： CA19-9、CA242、CEA。

本发明所用原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买。

本发明的有益成果

（1）本发明使用了β-环糊精修饰的还原石墨烯，石墨烯有大的比表面积，可增加抗体的结合位点，石墨烯氧化得还原石墨烯，是亲水性物质，在水中有优越的分散性，且羧基能与抗体上的氨基有效结合，β-环糊精能与许多有机和无机分子形成包合物及分子组装体系，因此，β-环糊精修饰的还原石墨烯增加了抗体结合率，使得结合更加牢固；

（2）采用Pt@CuO/MWCNT作为二抗标记物，MWCNT有极高的强度和良好的导电性，且对过氧化氢有催化作用，Pt和CuO对过氧化氢也有催化作用，因此，Pt@CuO/MWCNT对过氧化氢的催化作用呈三重的放大作用，从而提高了传感器的灵敏度，降低了检测限；

（3）一种铂杂化氧化铜多壁碳纳米管免疫传感器对肿瘤标志物的检测，其线性范围0.5 pg/mL～25 ng/mL，检测限最低0.12 pg/mL，表明一种铂杂化氧化铜多壁碳纳米管免疫传感器可以达到准确测定的目的。

具体实施方式

实施例1 一种铂杂化氧化铜多壁碳纳米管传感器的制备

（1）将直径为4 mm的玻碳电极用Al₂O₃抛光粉打磨，超纯水清洗干净；

（2）取6μL、0.5 mg/mL的b-环糊精修饰的还原石墨烯滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；

（3）继续将6 μL、8 μg/mL的肿瘤标志物一抗Ab₁滴加到电极表面，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中干燥；

（4）继续将3 μL、0.5 mg/mL的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；滴加6 μL、0.001 ~ 20 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中干燥；

（5）将6 μL、1 mg/mL的Pt@CuO/MWCNT-Ab₂二抗孵化物溶液，滴涂于电极表面上，置于4 ℃冰箱中晾干，制得铂杂化氧化铜多壁碳纳米管传感器。

实施例2一种铂杂化氧化铜多壁碳纳米管传感器的制备

（1）将直径为4 mm的玻碳电极用Al₂O₃抛光粉打磨，超纯水清洗干净；

（2）取6 μL、1.0 mg/mL的b-环糊精修饰的还原石墨烯滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；

（3）继续将6 μL、10 μg/mL的肿瘤标志物一抗Ab₁滴加到电极表面，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中干燥；

（4）继续将3 μL、1.0 mg/mL的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；滴加6 μL、0.001 ~ 20 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中干燥；

（5）将6 μL、2 mg/mL的Pt@CuO/MWCNT-Ab₂二抗孵化物溶液，滴涂于电极表面上，置于4 ℃冰箱中晾干，制得铂杂化氧化铜多壁碳纳米管传感器。

实施例3一种铂杂化氧化铜多壁碳纳米管传感器的制备

（1）将直径为4 mm的玻碳电极用Al₂O₃抛光粉打磨，超纯水清洗干净；

（2）取6 μL、1.5 mg/mL的b-环糊精修饰的还原石墨烯滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；

（3）继续将6 μL、12 μg/mL的肿瘤标志物一抗Ab₁滴加到电极表面，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中干燥；

（4）继续将3 μL、1.5 mg/mL的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；滴加6 μL、0.001 ~ 20 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中干燥；

（5）将6 μL、3 mg/mL的Pt@CuO/MWCNT-Ab₂二抗孵化物溶液，滴涂于电极表面上，置于4 ℃冰箱中晾干，制得铂杂化氧化铜多壁碳纳米管传感器。

实施例4 b-环糊精修饰的还原石墨烯的制备

称取60 mg的b-环糊精加入到20 mL超纯水中，超声溶解，与20 mL、0.4 mg/mL的氧化石墨烯溶液混合，依次加入200 μL氨水、10 μL水合肼，强磁力搅拌5 min，在60℃下水浴加热3.0 h，离心分离得到b-环糊精修饰的还原石墨烯。

实施例5 b-环糊精修饰的还原石墨烯的制备

称取80 mg的b-环糊精加入到20mL超纯水中，超声溶解，与20 mL、0.5 mg/mL的氧化石墨烯溶液混合，依次加入250 μL氨水、15 μL水合肼，强磁力搅拌5 min，在60℃下水浴加热3.5 h，离心分离得到b-环糊精修饰的还原石墨烯。

实施例6 b-环糊精修饰的还原石墨烯的制备

称取100 mg的b-环糊精加入到20 mL超纯水中，超声溶解，与20 mL、0.6 mg/mL的氧化石墨烯溶液混合，依次加入300 μL氨水、20 μL水合肼，强磁力搅拌5 min，在60℃下水浴加热4.0小时，离心分离得到b-环糊精修饰的还原石墨烯。

实施例7 Pt@CuO/MWCNT-Ab₂二抗孵化物溶液的制备

（1）Pt@CuO/MWCNT二抗标记物的制备

1）氧化铜多壁碳纳米管的合成

称取0.05 g CuO(OAc)₂与0.5 g多壁碳纳米管混合，研磨30 min, 在350℃、氩气保护下煅烧3 h，冷却，制得CuO/MWCNT；

2）Pt@CuO/MWCNT二抗标记物的合成

4 mg研磨过的CuO/MWCNT置于圆底烧瓶内， 20 mg的K₂PtCl₂溶于5 mL水中，超声溶解，置于上述圆底烧瓶中，用盐酸调节pH至3.2，100℃油浴中搅拌，回流12 h，冷却至室温，水洗，以8000 rpm转速，每次10 min离心分离3次，烘干，制得Pt@CuO/MWCNT二抗标记物；

（2）Pt@CuO/MWCNT-Ab₂二抗孵化物溶液的制备

将2 mg的Pt@CuO/MWCNT二抗标记物分散到1 mL超纯水中，加入100 μL、80 μg/mL的肿瘤标志物二抗Ab₂溶液和900 μL、50 mmol/L的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h；在4 ℃下，6000 rpm转速下离心15 min，得到下层沉淀，加入1 mL、50 mmol/L 的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，得下层沉淀，最后加入1 mL、50 mmol/L 的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，制得Pt@CuO/MWCNT-Ab₂二抗孵化物溶液，4 ℃下保存备用。

实施例8  Pt@CuO/MWCNT-Ab₂二抗孵化物溶液的制备

（1）Pt@CuO/MWCNT二抗标记物的制备

1）氧化铜多壁碳纳米管的合成

称取0.1 g CuO(OAc)₂与0.5 g多壁碳纳米管混合，研磨35 min, 在350℃、氩气保护下煅烧3.5 h，冷却，制得CuO/MWCNT；

2）Pt@CuO/MWCNT二抗标记物的合成

5 mg研磨过的CuO/MWCNT置于圆底烧瓶内， 25 mg的K₂PtCl₂溶于5mL水中，超声溶解，置于上述圆底烧瓶中，用盐酸调节pH至3.2，100℃油浴中搅拌，回流12 h，冷却至室温，水洗，以8000 rpm转速，每次10 min离心分离3次，烘干，制得Pt@CuO/MWCNT二抗标记物；

（2）Pt@CuO/MWCNT-Ab₂二抗孵化物溶液的制备

将4 mg的Pt@CuO/MWCNT二抗标记物分散到1 mL超纯水中，加入100 μL、100 μg/mL的肿瘤标志物二抗Ab₂溶液和900 μL、50 mmol/L的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h；在4 ℃下，6000 rpm转速下离心15 min，得到下层沉淀，加入1 mL、50 mmol/L 的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，得下层沉淀，最后加入1 mL、50 mmol/L 的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，制得Pt@CuO/MWCNT-Ab₂二抗孵化物溶液，4 ℃下保存备用。

实施例9  Pt@CuO/MWCNT-Ab₂二抗孵化物溶液的制备

（1）Pt@CuO/MWCNT二抗标记物的制备

1）氧化铜多壁碳纳米管的合成

称取0.2 g CuO(OAc)₂与0.5 g多壁碳纳米管混合，研磨40 min, 在350℃、氩气保护下煅烧4小时，冷却，制得CuO/MWCNT；

2）Pt@CuO/MWCNT二抗标记物的合成

6 mg研磨过的CuO/MWCNT置于圆底烧瓶内， 30 mg的K₂PtCl₂溶于5 mL水中，超声溶解，置于上述圆底烧瓶中，用盐酸调节pH至3.2，100℃油浴中搅拌，回流12小时，冷却至室温，水洗，以8000 rpm转速，每次10 min离心分离3次，烘干，制得Pt@CuO/MWCNT二抗标记物；

（2）Pt@CuO/MWCNT-Ab₂二抗孵化物溶液的制备

将6 mg的Pt@CuO/MWCNT二抗标记物分散到1 mL超纯水中，加入100 μL、120 μg/mL的肿瘤标志物二抗Ab₂溶液和900 μL、50 mmol/L的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h；在4 ℃下，6000 rpm转速下离心15 min，得到下层沉淀，加入1 mL、50 mmol/L 的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，得下层沉淀，最后加入1 mL、50 mmol/L 的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液，制得Pt@CuO/MWCNT-Ab₂二抗孵化物溶液，4 ℃下保存备用。

实施例10 胰腺癌肿瘤标志物CA19-9的检测

（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.10 ~ 7.98磷酸盐缓冲溶液中进行测试；

（2）用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔 0.1 s，运行时间400 s；

（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化；

（4）测定样品中CA19-9的线性范围为1 pg/mL~20 ng/mL，检测限为0.21 pg/mL。

实施例11 胰腺癌肿瘤标志物CA242的检测

按照实施例10的方法对样品中CA242进行检测，其线性范围为0.5pg/mL~20ng/mL，检测限为0.12 pg/mL。

实施例12 胰腺癌肿瘤标志物CEA的检测

按照实施例10的方法对样品中CEA进行检测，其线性范围为1 pg/mL~25 ng/mL，检测限为0.21 pg/mL。