一种与非综合征型先天性心脏病辅助诊断相关的SNP标志物及其应用

摘要

本发明属于基因工程及生殖医学领域，公开了一种与非综合征型先天性心脏病辅助诊断相关的SNP标志物及其应用。该标志物为rs3789612、rs4140836、rs13391263、rs13101737、rs1400558、rs6872396、rs13189951、rs9266596、rs7863990、rs2433752、rs7259736、rs490514、rs2474937、rs1531070、rs9533839、rs17019472、rs10182004、rs9461938、rs72759270和rs1886441的组合。该标志物可用于制备非综合征型先天性心脏病辅助诊断试剂盒。

说明书

发明领域

本发明属于基因工程及生殖医学领域，涉及非综合征型先天性心脏病辅助诊断相 关的SNP标志物及其应用。

背景技术

先天性心脏病(congenital heart disease,CHD)是由于心脏、血管在胚胎发育过程中 的障碍所致的心脏、血管形态、结构、功能、代谢上的异常。在众多出生缺陷中，CHD 占28％左右，是一种最为常见的先天性疾病。根据世界卫生组织的资料，普遍认为CHD 的发病率在足月、活产的新生儿为0.60％～0.80％，在早产、死产或流产的病例中发病 率则更高。据测算，我国每年新增CHD病例超过13万例，CHD已成为我国围产儿第 一位高发畸形。自2000年起，围产期CHD发生率呈快速上升趋势，2011年全国CHD 发生率为2000年的3.56倍。同时，CHD也是造成婴幼儿死因或残疾的主要原因之一， 它不但严重危害儿童生存和生活质量，影响家庭幸福和谐，也会造成巨大的潜在寿命损 失和社会经济负担。

流行病学研究证明，综合征型的CHD(syndromic CHD)占患者总数的25％左右， 其余为非综合征型CHD(non-syndromic CHD)，即表现为心血管畸形而不伴其他系统畸 形。非综合征型CHD在人群中多数呈散发，根据左、右两侧心脏及大血管之间有无分 流，可分为3大类：左向右分流型(潜伏青紫型)、右向左分流型(青紫型)、无分流型(无 青紫型)。左向右分流型主要包括：VSD、PDA、ASD等。右向左分流型主要包括：法 洛四联症和大动脉转位等。无分流型主要包括：肺动脉口狭窄和主动脉缩窄等。引起非 综合征型CHD的原因很多，包括孕母感染风疹病毒、接触环境致畸物、孕期用药、母 体疾病、孕妇吸烟、嗜酒、吸毒、染色体异常、单基因突变以及多基因缺陷等。 值得注意的是，71％患儿可存活到生育年龄以后，因此，CHD，尤其是非综合征型CHD 已成为影响我国儿童身心健康及人口生存质量的重大公共卫生问题。

目前，先天性心脏病的诊断方法主要为病史询问、体格检查、影像学检查(彩色 多普勒超声心动图、X线、多层螺旋CT、磁共振成像)、心导管检查和心血管造影、 放射性核素心血管造影显像及心电图等。然而，现在临床常用的检查仍存在一些弊端： 多层螺旋CT及X线对人体存在一定的辐射危害，不能作为CHD的一线影像检查途 径；磁共振成像时间长(至少需要30分钟)，检查噪声大，且病人的移动对图像质 量的影响很大，故不适用于不能合作的儿童；放射性核素心血管造影注射技术要求高； 心导管检查及心血管造影作为CHD诊断的金标准，在临床先心病确诊中居于重要地 位，但其属于有创检查，操作复杂，有一定的手术风险性，存在引起肺水肿的可能， 因此不适合作为常规筛查手段。

心脏发育是一个极其复杂的过程，其关键时期为受孕后2～8周，经历了心管形成、 环化、内部分隔、血管连接等过程，每个阶段都受到许多重要基因和信号通路的调控。 研究表明，遗传因素是非综合征型CHD的重要病因，其中单核苷酸多态性(single  nucleotide polymorphism，SNP)起重要作用。SNP是指在基因组水平上由单个核苷酸的 变异—A,T,C或G的改变而引起的DNA序列的改变，造成包括人类在内的物种之间染 色体基因组的多样性，是人类可遗传变异中最常见的一种。SNP的存在被认为赋予了个 体不同的表型性状，以及对于环境暴露、药物治疗等因素的不同反应性。因此SNP可 能是导致个体对常见疾病发病和预后易感性差异的重要遗传基础。近年来，针对肿瘤和 心血管疾病等常见重大疾病的SNP研究已经成为临床和科研工作者的研究热点。

然而，目前还没有将SNP应用于非综合征型先天性心脏病诊断的报道，若能筛 选出非综合征型先天性心脏病易感的SNP作为生物标志物，并研制相应的诊断试剂 盒，对我国非综合征型先天性心脏病诊断现状必将是一次有力的推动，也为其药物筛 选、药效评价及靶向治疗开辟了新的途径。

发明内容

本发明的目的是针对上述技术问题，提出一种与非综合征型先天性心脏病辅助诊 断相关的SNP标志物。

本发明的第二个目的是提供上述SNP标志物的特异性扩增引物。

本发明的第三个目的是提供上述SNP标志物的特异性延伸引物。

本发明的第四个目的是提供上述SNP标志物及其特异性扩增引物和/或特异性延 伸引物在制备先天性心脏病辅助诊断试剂盒中的应用。

本发明第五个目的是提供非综合征型先天性心脏病辅助诊断试剂盒。

发明人通过分离和研究非综合征型先天性心脏病患者及与其年龄、性别匹配的健康 对照外周血DNA中的单核苷酸多态性，寻找一组与非综合征型先天性心脏病高度相关 的高特异性和敏感性的SNP，并研制出可便于临床应用的非综合征型先天性心脏病辅助 诊断试剂盒，为非综合征型先天性心脏病的筛查和诊断提供数据支持，为发现具有潜在 治疗价值的新型小分子药物提供数据支持。

本发明的目的是通过下列技术方案实现的：

一种与非综合征型先天性心脏病辅助诊断相关的SNP标志物，该标志物为 rs3789612、rs4140836、rs13391263、rs13101737、rs1400558、rs6872396、rs13189951、 rs9266596、rs2433752、rs7259736、rs490514、rs2474937、rs1531070、rs9533839、rs17019472、 rs10182004、rs9461938、rs72759270和rs1886441的组合。

所述的SNP标志物的特异性扩增引物，该引物为：

rs3789612的扩增引物序列为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2；

rs4140836的扩增引物序列为SEQ ID No:4和SEQ ID No:5；

rs13391263的扩增引物序列为SEQ ID No:7和SEQ ID No:8；

rs13101737的扩增引物序列为SEQ ID No:10和SEQ ID No:11；

rs1400558的扩增引物序列为SEQ ID No:13和SEQ ID No:14；

rs6872396的扩增引物序列为SEQ ID No:16和SEQ ID No:17；

rs13189951的扩增引物序列为SEQ ID No:19和SEQ ID No:20；

rs9266596的扩增引物序列为SEQ ID No:22和SEQ ID No:23；

rs2433752的扩增引物序列为SEQ ID No:25和SEQ ID No:26；

rs7259736的扩增引物序列为SEQ ID No:28和SEQ ID No:29；

rs490514的扩增引物序列为SEQ ID No:31和SEQ ID No:32；

rs2474937的扩增引物序列为SEQ ID No:34和SEQ ID No:35；

rs1531070的扩增引物序列为SEQ ID No:37和SEQ ID No:38；

rs9533839的扩增引物序列为SEQ ID No:40和SEQ ID No:41；

rs17019472的扩增引物序列为SEQ ID No:43和SEQ ID No:44；

rs10182004的扩增引物序列为SEQ ID No:46和SEQ ID No:47；

rs9461938的扩增引物序列为SEQ ID No:49和SEQ ID No:50；

rs72759270的扩增引物序列为SEQ ID No:52和SEQ ID No:53；

rs1886441的扩增引物序列为SEQ ID No:55和SEQ ID No:56。

所述的SNP标志物的特异性延伸引物，该引物为：

rs3789612的延伸引物序列为SEQ ID No:3；

rs4140836的延伸引物序列为SEQ ID No:6；

rs13391263的延伸引物序列为SEQ ID No:9；

rs13101737的延伸引物序列为SEQ ID No:12；

rs1400558的延伸引物序列为SEQ ID No:15；

rs6872396的延伸引物序列为SEQ ID No:18；

rs13189951的延伸引物序列为SEQ ID No:21；

rs9266596的延伸引物序列为SEQ ID No:24；

rs2433752的延伸引物序列为SEQ ID No:27；

rs7259736的延伸引物序列为SEQ ID No:30；

rs490514的延伸引物序列为SEQ ID No:33；

rs2474937的延伸引物序列为SEQ ID No:36；

rs1531070的延伸引物序列为SEQ ID No:39；

rs9533839的延伸引物序列为SEQ ID No:42；

rs17019472的延伸引物序列为SEQ ID No:45；

rs10182004的延伸引物序列为SEQ ID No:48；

rs9461938的延伸引物序列为SEQ ID No:51；

rs72759270的延伸引物序列为SEQ ID No:54；

rs1886441的延伸引物序列为SEQ ID No:57。

所述的SNP标志物在制备非综合征型先天性心脏病辅助诊断试剂盒中的应用。

所述的SNP标志物的特异性扩增引物在制备非综合征型先天性心脏病辅助诊断试 剂盒中的应用。

所述的SNP标志物的特异性延伸引物在制备非综合征型先天性心脏病辅助诊断试 剂盒中的应用。

一种非综合征型先天性心脏病辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测外周血DNA中 rs3789612、rs4140836、rs13391263、rs13101737、rs1400558、rs6872396、rs13189951、 rs9266596、rs2433752、rs7259736、rs490514、rs2474937、rs1531070、rs9533839、rs17019472、 rs10182004、rs9461938、rs72759270和rs1886441。

所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有上述SNP标志物的特异性扩增引物和/或特异性 延伸引物。

其中，特异性扩增引物为：

rs3789612的扩增引物序列为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2；

rs4140836的扩增引物序列为SEQ ID No:4和SEQ ID No:5；

rs13391263的扩增引物序列为SEQ ID No:7和SEQ ID No:8；

rs13101737的扩增引物序列为SEQ ID No:10和SEQ ID No:11；

rs1400558的扩增引物序列为SEQ ID No:13和SEQ ID No:14；

rs6872396的扩增引物序列为SEQ ID No:16和SEQ ID No:17；

rs13189951的扩增引物序列为SEQ ID No:19和SEQ ID No:20；

rs9266596的扩增引物序列为SEQ ID No:22和SEQ ID No:23；

rs2433752的扩增引物序列为SEQ ID No:25和SEQ ID No:26；

rs7259736的扩增引物序列为SEQ ID No:28和SEQ ID No:29；

rs490514的扩增引物序列为SEQ ID No:31和SEQ ID No:32；

rs2474937的扩增引物序列为SEQ ID No:34和SEQ ID No:35；

rs1531070的扩增引物序列为SEQ ID No:37和SEQ ID No:38；

rs9533839的扩增引物序列为SEQ ID No:40和SEQ ID No:41；

rs17019472的扩增引物序列为SEQ ID No:43和SEQ ID No:44；

rs10182004的扩增引物序列为SEQ ID No:46和SEQ ID No:47；

rs9461938的扩增引物序列为SEQ ID No:49和SEQ ID No:50；

rs72759270的扩增引物序列为SEQ ID No:52和SEQ ID No:53；

rs1886441的扩增引物序列为SEQ ID No:55和SEQ ID No:56。

特异性延伸引物为：

rs3789612的延伸引物序列为SEQ ID No:3；

rs4140836的延伸引物序列为SEQ ID No:6；

rs13391263的延伸引物序列为SEQ ID No:9；

rs13101737的延伸引物序列为SEQ ID No:12；

rs1400558的延伸引物序列为SEQ ID No:15；

rs6872396的延伸引物序列为SEQ ID No:18；

rs13189951的延伸引物序列为SEQ ID No:21；

rs9266596的延伸引物序列为SEQ ID No:24；

rs2433752的延伸引物序列为SEQ ID No:27；

rs7259736的延伸引物序列为SEQ ID No:30；

rs490514的延伸引物序列为SEQ ID No:33；

rs2474937的延伸引物序列为SEQ ID No:36；

rs1531070的延伸引物序列为SEQ ID No:39；

rs9533839的延伸引物序列为SEQ ID No:42；

rs17019472的延伸引物序列为SEQ ID No:45；

rs10182004的延伸引物序列为SEQ ID No:48；

rs9461938的延伸引物序列为SEQ ID No:51；

rs72759270的延伸引物序列为SEQ ID No:54；

rs1886441的延伸引物序列为SEQ ID No:57。

所述诊断试剂盒，该试剂盒还可以包括PCR反应常用的酶和试剂，如Taq酶、 dNTP混合液、Mgcl₂溶液、去离子水等；还可以含有标准品和/或对照品。

具体地说，本发明解决问题的技术方案包括：(1)建立统一标准的标本库和数据库： 以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床 资料。(2)基因型检测：选择非综合征型先天性心脏病病例，与非综合征型先天性心 脏病病例年龄、性别匹配的对照，利用高密度SNP芯片，在全基因组范围内找出与非 综合征型先天性心脏病相关的SNP。(3)对于筛选出来的阳性关联SNP，进一步采用 Sequenom MassARRAY基因分型平台进行检测，以验证将其应用于诊断的可重复性。 (4)非综合征型先天性心脏病辅助诊断试剂盒的研制：根据非综合征型先天性心脏病 病例和健康对照中基因型分布频率有显著差异的SNP开发SNP辅助诊断试剂盒。

本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口 学资料、临床资料等，并采用了Affymetrix6.0芯片进行全基因组扫描，初筛阳性位点 采用Sequenom MassARRAY时间飞行质谱生物芯片系统进行验证。

具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：

1.研究样本的选择

(1)经超声心动图、心脏导管插入术或手术明确诊断的非综合征型先天性心脏 病患者；

(2)排除合并其他器官先天异常、染色体异常患者；

(3)排除一级亲属患先心病、母亲患有糖尿病、苯丙酮尿症、母亲孕 期接触致畸物(如农药或有机溶剂)及服用药物的患者；

(4)与病例年龄、性别匹配的对照；

本研究共采用8217例符合标准的样本进行研究。

2.酚-氯仿法提取外周血基因组DNA，按常规方法操作。通常能得到20-50ng/μl  DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。

3.Affymetrix6.0芯片检测

(1)取受试者全基因组DNA样本；

(2)在Affymetrix6.0芯片(购于美国昂飞公司，下同)上进行全基因组扫描；

(3)检测并比较各基因型在非综合征型先天性心脏病病例与健康对照中的分别 差异。

4.Sequenom MassARRAY基因分型检测

(1)取受试者DNA样本；

(2)设计SNP的特异性扩增引物和特异性延伸引物；

(3)进行PCR扩增反应及产物纯化；

(4)进行单碱基延伸反应及产物纯化；

(5)检测并比较非综合征型先天性心脏病病例与健康对照中不同基因型的分布 差异。

5.诊断试剂盒制备方法

Affymetrix6.0芯片进行全基因组扫描和Sequenom MassARRAY基因分型平台验 证后确定非综合征型先天性心脏病病例与健康对照中基因型分布频率有显著差异的 SNP，作为非综合征型先天性心脏病辅助诊断的指标。最后筛选出的与非综合征型先 天性心脏病发病有关的SNP组成辅助诊断试剂盒(rs3789612、rs4140836、rs13391263、 rs13101737、rs1400558、rs6872396、rs13189951、rs9266596、rs2433752、rs7259736、 rs490514、rs2474937、rs1531070、rs9533839、rs17019472、rs10182004、rs9461938、 rs72759270和rs1886441)。诊断试剂可以包括这些SNP的特异性扩增引物及特异性 延伸引物，以及Taq酶、dNTP等试剂。

6.统计分析方法

运用卡方检验(用于分类变量)或者student t检验(用于连续性变量)比较人口 学特征等在研究对象组间分布的差异。用logistic回归分析中的additive模型进行关联 分析。计算比值比(Odds Ratio,OR)以及它们的95％可信区间。定义那些OR小于1的 SNP为保护性SNP；定义那些OR大于1的SNP为危险性SNP。

为了进一步研究这19个SNP构成的综合指征用于早期诊断的效果，我们构建了一 个数学公式，综合考虑每个SNP与非综合征型先天性心脏病发病的正、负关联情况和 联系强度。具体来说，我们对每个SNP的三种基因型进行评分，野生纯合型＝“0”，杂 合型＝“1”，变异纯合型＝“2”，以单个SNP分析时的additive模型下的回归系数为权重， 综合考虑每个SNP的情况给每个研究研究对照确定一个危险分值。危险分值的计算方 法如下：危险分值＝(0.447×rs3789612的评分)+(0.490×rs4140836的评分)+ (0.338×rs13391263的评分)+(0.325×rs13101737的评分)+(0.266×rs1400558的评分) +(0.570×rs6872396的评分)+(0.397×rs13189951的评分)+(0.477×rs9266596的评分) +(-0.329×rs2433752的评分)+(0.332×rs7259736的评分)+(0.255×rs490514的评分) +(0.499×rs2474937的评分)+(0.479×rs1531070的评分)+(0.392×rs9533839的评 分)+(-0.284×rs17019472的评分)+(0.270×rs10182004的评分)+(0.570×rs9461938的评 分)+(-0.341×rs72759270的评分)+(0.311×rs1886441的评分)，获得的危险分值系数 以及界限值被直接应用于全基因组关联研究的2191例样本中。(以rs3789612为例：0.447 为rs3789612的回归系数(见表1)；rs3789612的评分，野生纯合型＝“0”，杂合型＝“1”， 变异纯合型＝“2”，某个SNP的基因型由仪器检测结果确定；某个样本的总评分是这些 个SNP分别评分的总和，单个SNP的基因型只是计算评分的一个中间过程，不需要知道 具体基因型。)

统计学分析均通过专门的统计学分析软件完成(PLINK1.07)。统计学显著性水平 P值设为0.05，所有统计学检验均为双侧检验。

以下是本发明进一步的说明：

在上述945例符合条件的非综合征型先天性心脏病病例及1246例健康对照中， 两组年龄、性别均衡可比。我们将这两组人群经Affymetrix6.0芯片进行全基因组扫 描获得相关结果。

根据Affymetrix6.0芯片检测，本发明人检测到在“非综合征型先天性心脏病病 例”组和“健康对照”组中基因型分布频率存在差异的SNP包括：rs3789612、 rs4140836、rs13391263、rs13101737、rs1400558、rs6872396、rs13189951、rs9266596、 rs2433752、rs7259736、rs490514、rs2474937、rs1531070、rs9533839、rs17019472、 rs10182004、rs9461938、rs72759270和rs1886441。

根据上述检测结果，我们将这20个与非综合征型先天性心脏病发病相关的SNP 在另外2160例非综合征型先天性心脏病病例和与其年龄、性别匹配的3866例健康对 照中在Sequenom MassARRAY基因分型平台进行验证，结果与Affymetrix6.0芯片检 测一致。

单因素和多因素Logistic回归分析结果均表明，这19个SNP与非综合征型先天 性心脏病的发病存在着显著关联。

进一步分析这19个SNP的组合用于非综合征型先天性心脏病诊断的效果，发现 其组合能够很好的区分病例与对照。

根据上述实验结果，本发明人制备了一种能用于非综合征型先天性心脏病辅助诊 断的试剂盒，包含测定受试者血标本DNA中上述SNP的特异性扩增引物、特异性延 伸引物和其他检测试剂。

具体而言，这19个SNP的组合，或者这19个SNP的特异性扩增引物、特异性 延伸引物的组合构成的相关诊断试剂盒有助于非综合征型先天性心脏病的辅助诊断， 为临床医生快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度，及时采取更具个性化的防 治方案提供支持。

本发明有益效果：

本发明提供的SNP标志物作为非综合征型先天性心脏病辅助判断的标志物的优越 性在于：

(1)SNP是一种新型基因生物标志物，区别于传统生物标志物，稳定、微创、 易于检测，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类生物标志物的成功开发将为非 综合征型先天性心脏病的诊断和治疗开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供 借鉴。

(2)SNP试剂盒是一种系统、全面的诊断试剂盒，可用于非综合征型先天性心脏 病的辅助诊断，有助于反映患者的疾病状态，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时 采取更具个性化的防治方案提供支持。

(3)采用严密的验证和评价体系，本发明人初期采用全基因组芯片扫描以获取疾 病相关的SNP谱，并在Sequenom MassARRAY基因分型平台上进行了验证；以上方法 和策略的应用加速和保证了SNP生物标志物和诊断试剂盒在临床上的应用，也为其他 疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。

本发明通过控制年龄、性别等对疾病发展的影响因素，研究SNP在非综合征型先 天性心脏病辅助诊断的应用前景，阐述SNP对于非综合征型先天性心脏病进展的影响， 揭示其诊断价值。因此，本发明获得了非综合征型先天性心脏病发病相关SNP谱和特 异性标志物；通过SNP生物标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可使得非综合征型先 天性心脏病的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果 评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。

附图说明

图1：显示全基因组关联研究病例组和对照组的ROC曲线。

显示非综合征型先天性心脏病病例组对健康对照组为参照的ROC曲线。

具体实施方式

实施例1样品的收集和样品资料的整理

发明人于2006年开始至2012年从南京医科大学第一附属医院、南京儿童医院、 西安西京医院收集了大量的非综合征型先天性心脏病患者血标本，通过对样品资料的 整理，发明人从中选择了8217例符合下列标准的样本全基因组芯片扫描和单个SNP  Sequenom MassARRAY基因分型的实验样品：

1、经超声心动图、心脏导管插入术或手术明确诊断的非综合征型先天性心脏病 患者；

2、排除合并其他器官先天异常、染色体异常患者；

3、排除一级亲属患先心病、母亲患有糖尿病、苯丙酮尿症、母亲孕期 接触致畸物(如农药或有机溶剂)及服用药物的患者；

4、与病例年龄、性别匹配的健康对照；

并系统采集了这些样本的人口学资料和临床资料等情况。

实施例2外周血DNA中SNP的全基因组扫描

在上述符合条件的945例非综合征型先天性心脏病患者和1246例健康对照中， 两组年龄、性别匹配。将这两组人群经Affymetrix6.0芯片检测获得相关结果。具体 步骤为：

1、向储存于2ml冻存管中的外周血加入溶血试剂(即裂解液，40份量配置方法 如下：蔗糖219.72g、氯化镁2.02g和曲拉通X-100(amresco 0694)20ml混合后，用 TrisHcl溶液定容至2000ml，下同)，颠倒混匀后完全转入。

2、去除红细胞：用溶血试剂将5ml离心管补至4ml，颠倒混匀，4000rpm离心 10分钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm 离心10分钟，弃上清。

3、抽提DNA：向沉淀中加1ml抽提液(每300ml中含有122.5ml0.2M氯化钠， 14.4ml0.5M乙二胺四乙酸，15ml10％十二烷基硫酸钠，148.1ml双蒸水，下同) 和8μl蛋白酶K，震荡器上充分震荡混匀，37℃水浴过夜。

4、去除蛋白质：加1ml饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟)，4000rpm离心10 分钟，取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液 (氯仿：异戊醇＝24：1，v/v，下同)，充分混匀后(手摇15分钟)，4000rpm离 心10分钟，取上清(分入两个1.5ml的离心管)。

5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60μl,再加入与上清液等体积的 冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10min。

6、DNA洗涤：在沉淀中加入冰无水乙醇1ml,12000rpm离心10min,弃上清 后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。

7、测量浓度:通常能得到20-50ng/μl DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值) 在1.6-2.0。

8、在Affymetrix 6.0芯片(购于美国昂飞公司，下同)上进行全基因组扫描；

9、数据分析与处理:在“非综合征型先天性心脏病病例”组和“健康对照”组 中发现的基因型分布频率有显著差异的SNP在上文中已经罗列出，结果见表1。

实施例3单个SNP的Sequeom MassARRAY基因分型

将上述全基因组扫描发现与非综合征型先天性心脏病发病有关的SNP在2160例 非综合征型先天性心脏病病例和3866例健康对照中进行检测，具体步骤为：

1、向储存于2ml冻存管中的外周血加入溶血试剂，颠倒混匀后完全转入。

2、去除红细胞：用溶血试剂将5ml离心管补至4ml，颠倒混匀，4000rpm离心 10分钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm 离心10分钟，弃上清。

3、抽提DNA：向沉淀中加1ml抽提液和8μl蛋白酶K，震荡器上充分震荡混 匀，37℃水浴过夜。

4、去除蛋白质：加1ml饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟)，4000rpm离心10 分钟，取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液 (氯仿：异戊醇＝24：1)，充分混匀后(手摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取 上清(分入两个1.5ml的离心管)。

5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60μl,再加入与上清液等体积的 冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10min。

6、DNA洗涤：在沉淀中加入冰无水乙醇1ml,12000rpm离心10min,弃上清 后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。

7、测量浓度:通常能得到20-50ng/μl DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值) 在1.6-2.0。

8、进行Sequenom MassARRAY基因分型：

1)使用Sequenom公司Genotyping Tools及MassARRAY Assay Design软件对全 基因组扫描发现的19个阳性关联的SNP设计PCR扩增引物及单碱基延伸引物(表 2)。反应体系包括4μl Sequenom MassARRAY基因分型PCR master mix(Hotstar Taq  0.5U，每条扩增引物0.5pmol，0.1μl的25mM dNTPs、1.9μl双蒸水)，加入1μl DNA。 仪器使用的是Sequenom MassARRAY Nanodispenser，PCR反应条件为：94℃4分 钟；94℃20秒,56℃30秒，72℃1分钟，45个循环；72℃3分钟；4℃保 持。

2)在PCR反应结束后，将PCR产物用SAP(shrimp alkaline phosphatase，虾碱 性磷酸酶)处理，以去除体系中游离的dNTPs。

3)在碱性磷酸酶处理结束后，进行单碱基延伸反应，反应体系包括：2μl EXTEND  Mix(单碱基延伸反应液，包括其中各延伸反应引物混合物0.94μl，iPLEX酶0.041μl, 延伸混合物0.2μl)，7μl SAP处理后PCR产物。PCR反应条件：I.94℃30秒；II.94℃ 5秒；III.52℃5秒；IV.80℃5秒；V.重复III、IV4个循环；VI.重复II、III、IV、 V39个循环；VII.72℃3分钟；VII.4℃保持

4)树脂纯化：

(1)将Clean Resin树脂平铺到6mg的树脂板中；

(2)加16μl水到延伸产物的对应孔内；

(3)将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转30分钟,使树脂 与反应物充分接触；

(4)离心使树脂沉入孔底部。

5)芯片点样：启动MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪，将树脂纯化后的 延伸产物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上

6)质谱检测：将点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF(matrix-assisted  laser desorption/ionization–time of fligh，基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱) 分析，检测结果使用TYPER 4.0软件(sequenom)分型并输出结果。

9、数据处理和分析：利用logistic回归模型中的additive模型比较每个SNP的三 种基因型在病例组和对照组中分布频率的差异，结果与全外显子扫描类似不再列出。

实施例4利用危险度评分方法进一步分析SNP与非综合征型先天性心脏病发病

根据上述结果，本发明人通过对2组样品(“非综合征型先天性心脏病病例组” 和“健康对照组”)基因型分布频率的比较，选择阳性关联的SNP，以全基因组扫 描样本中单个SNP回归系数为权重，进一步求得危险分值，绘制ROC来评价检测的 灵敏性和特异性，进而诊断这些SNP对非综合征型先天性心脏病发病的判断能力。 对19个SNP标志物的联合分析发现，这19个SNP以71.3％的AUC将健康对照组和 先天性心脏病病例组分开，最佳临界点的灵敏度为68.0％，特异度：63.8％(图1)。

因此，本发明人证明了采用rs3789612、rs4140836、rs13391263、rs13101737、 rs1400558、rs6872396、rs13189951、rs9266596、rs2433752、rs7259736、rs490514、rs2474937、 rs1531070、rs9533839、rs17019472、rs10182004、rs9461938、rs72759270和rs1886441 的组合能够很好地将健康对照和非综合征型先天性心脏病患者区分。

实施例5用于非综合征型先天性心脏病辅助诊断SNP试剂盒的制作

SNP试剂盒的制作和操作流程是基于Affymetrix6.0芯片检测和Sequenom  MassARRAY基因分型技术。试剂盒含有一批SNP特异性扩增引物(包括下列引物： rs3789612的扩增引物序列为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2；rs4140836的扩增引物序列 为SEQ ID No:4和SEQ ID No:5；rs13391263的扩增引物序列为SEQ ID No:7和SEQ ID  No:8；rs13101737的扩增引物序列为SEQ ID No:10和SEQ ID No:11；rs1400558的扩增 引物序列为SEQ ID No:13和SEQ ID No:14；rs6872396的扩增引物序列为SEQ ID No:16 和SEQ ID No:17；rs13189951的扩增引物序列为SEQ ID No:19和SEQ ID No:20； rs9266596的扩增引物序列为SEQ ID No:22和SEQ ID No:23；rs2433752的扩增引物序 列为SEQ ID No:25和SEQ ID No:26；rs7259736的扩增引物序列为SEQ ID No:28和SEQ  ID No:29；rs490514的扩增引物序列为SEQ ID No:31和SEQ ID No:32；rs2474937的扩 增引物序列为SEQ ID No:34和SEQ ID No:35；rs1531070的扩增引物序列为SEQ ID  No:37和SEQ ID No:38；rs9533839的扩增引物序列为SEQ ID No:40和SEQ ID No:41； rs17019472的扩增引物序列为SEQ ID No:43和SEQ ID No:44；rs10182004的扩增引物 序列为SEQ ID No:46和SEQ ID No:47；rs9461938的扩增引物序列为SEQ ID No:49和 SEQ ID No:50；rs72759270的扩增引物序列为SEQ ID No:52和SEQ ID No:53；rs1886441 的扩增引物序列为SEQ ID No:55和SEQ ID No:56。)特异性延伸引物(包括下列延伸 引物：rs3789612的延伸引物序列为SEQ ID No:3；rs4140836的延伸引物序列为SEQ  ID No:6；rs13391263的延伸引物序列为SEQ ID No:9；rs13101737的延伸引物序列 为SEQ ID No:12；rs1400558的延伸引物序列为SEQ ID No:15；rs6872396的延伸引 物序列为SEQ ID No:18；rs13189951的延伸引物序列为SEQ ID No:21；rs9266596 的延伸引物序列为SEQ ID No:24；rs2433752的延伸引物序列为SEQ ID No:27； rs7259736的延伸引物序列为SEQ ID No:30；rs490514的延伸引物序列为SEQ ID  No:33；rs2474937的延伸引物序列为SEQ ID No:36；rs1531070的延伸引物序列为 SEQ ID No:39；rs9533839的延伸引物序列为SEQ ID No:42；rs17019472的延伸引物 序列为SEQ ID No:45；rs10182004的延伸引物序列为SEQ ID No:48；rs9461938的延 伸引物序列为SEQ ID No:51；rs72759270的延伸引物序列为SEQ ID No:54；rs1886441 的延伸引物序列为SEQ ID No:57。)，还可以有相应PCR技术所需的常用试剂，如： dNTPs，MgCl₂，双蒸水，Taq酶等，这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的，另 外还可以有标准品和对照(如确定基因型的标准品和空白对照等)。此试剂盒的价值 在于只需要外周血而不需要其它组织样品，通过最精简和特异的扩增引物及延伸引 物检测SNP，再通过SNP谱辅助判断非综合征型先天性心脏病，不仅稳定，检测方 便，且精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以 帮助指导诊断和更有效的个体化治疗。

表1.病例组与对照组全基因组关联分析结果

表2.相关SNP引物信息

F：Forward Primer，上游引物；R：Reverse Primer，下游引物；E：Extended Primer， 延伸引物。