一种提高卡伍尔链霉菌发酵生产抗生素产量的方法

摘要

本发明公开了一种提高卡伍尔链霉菌发酵生产抗生素产量的方法，属于生物技术领域，该方法为：传种菌株斜面试管，制备原始发酵菌株；将实验室保存的卡伍尔链霉菌菌株传种在固体斜面培养基上，在28℃条件下培养4天，备用；制备一级种子液；制备发酵培养基；接种发酵培养基；发酵培养；下罐，检测含量。该方法显著降低了空压机和发酵罐电机负荷，在生产中可节约大量电力，显著降低了生产成本。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体为一种提高卡伍尔链霉菌发酵生产抗生素产 量的方法。

背景技术

链霉菌的发酵一般采用葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉等物质作为碳源，以蛋白 胨、酵母膏、豆粕等作为氮源，在辅以一些无机盐如NaCl、KH₂PO₄，以及一些 微量元素如Fe²⁺、Mn²⁺等离子构成完整的发酵培养基配方。但是在链霉菌发酵 过程中除产生抗生素外，还会产生一些多糖类物质以及多种杂蛋白，在发酵培养 过程中发酵液往往出现高度粘稠现象。此时链霉菌的菌丝团内部常出现供氧不足 的现象，该现象可直接导致有效成份的生物合成量降低，使抗生素产量下降，更 为严重的是在厌氧条件下往往出现大量合成副产物的现象，进一步造成后期有效 成份的分离提纯成本增加。

生产上，为增加供氧量，通常有两种做法：

第一种方法，直接提高发酵罐供气量。该方法不仅增加了空压机的负荷，提 高了生产成本而且单纯增加风量并不能有效提高微生物的氧气利用效率，必须配 合增加发酵罐的转速。

第二种方法，在发酵过程中提高发酵罐的搅拌速度。链霉菌本身属于丝状细 菌，在高速搅拌条件下极易出现发酵罐搅拌桨打断菌丝并造成菌丝自溶的现象， 而且在发酵液高度粘稠的状体下，提高转速增加供氧量的手段本身对氧气利用效 率提升空间有限。如何在不增加转速的情况下提高氧气的利用率，提高抗生素产 量一直是限制抗生素生产过程中提高抗生素产量的一个瓶颈因素。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种提高卡伍尔链霉菌发酵生 产抗生素产量的方法，该方法显著降低了空压机和发酵罐电机负荷，在生产中可 节约大量电力，显著降低了生产成本。其技术方案为：

一种提高卡伍尔链霉菌发酵生产抗生素产量的方法，包括以下步骤：

步骤一：传种菌株斜面试管，制备原始发酵菌株；将实验室保存的卡伍尔 链霉菌菌株传种在固体斜面培养基上，在28℃条件下培养4天，备用；

步骤二：制备一级种子液；将斜面菌种接种到一级液体种子培养基中，在恒 温回旋式摇床上以190转/分恒温培养24h；

步骤三：制备发酵培养基：在5.0L发酵罐中，按照葡萄糖20.0g/L；蛋白胨 6.0g/L；酵母粉1.5g/L；豆粕3.0g/L；聚乙烯醇5.0g/L；碳酸钙0.2g/L的量配制 发酵培养基，发酵罐装液量控制在2.5L-3.0L范围内，调节发酵液初始 pH＝8.5-9.0范围内，121℃高温灭菌30min，降温至28℃，备用；

步骤四：接种发酵培养基：按照5％的接种量将一级液体种子接种于5.0L发 酵罐中；

步骤五：发酵培养：控制发酵罐通气量在2.0-3.0L/min转速在300-400转/min， 温度为28℃的条件下，发酵96h；

步骤六：下罐，检测含量：在配备有二极管阵列检测器的液相色谱上检测发 酵液中抗生素含量。

优选地，步骤一中所述的固体斜面培养基配方为：葡萄糖20.0g/L；蛋白胨 6.0g/L；酵母粉1.5g/L；豆粕3.0g/L；碳酸钙0.2g/L；琼脂粉20.0g/L；调节pH＝8.5-9.0 范围内；以3.0mL/管分装于斜面试管中，加棉塞后，于121℃高温灭菌，备用。

优选地，步骤二中所述的一级液体种子培养基配方为：葡萄糖18.0g/L；蛋 白胨5.0g/L；酵母粉1.0g/L；豆粕3.0g/L；碳酸钙0.20g/L，调节pH＝8.5-9.0范 围内；将配制好的一级液体种子培养基按照100ml/瓶(500ml规格摇瓶)的量分 装到摇瓶中，121℃高温灭菌30分钟，备用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1.本发明在发酵培养基中加入5.0g/L的聚乙烯醇，可在保持发酵罐较低转速 和较低通气量的条件下，显著提高发酵过程中抗生素产量。

2.本发明技术方案显著降低了空压机和发酵罐电机负荷，在生产中可节约大 量电力，显著降低了生产成本。

附图说明

图1是添加不同浓度PVA对抗生素产量的影响；

图2是抗生素的液相色谱图。

具体实施方式

下面结合附图何具体实施方式对本发明的技术方案作进一步说明。

一种提高卡伍尔链霉菌发酵生产抗生素产量的方法，包括以下步骤：

步骤一：传种菌株斜面试管，制备原始发酵菌株。将实验室保存的卡伍尔 链霉菌菌株传种在固体斜面培养基上，在28℃条件下培养4天，备用。

固体斜面培养基配方为：葡萄糖20.0g/L；蛋白胨6.0g/L；酵母粉1.5g/L； 豆粕3.0g/L；碳酸钙0.2g/L；琼脂粉20.0g/L；调节pH＝8.5-9.0范围内。以3.0mL/ 管分装于斜面试管中，加棉塞后，于121℃高温灭菌，备用。

步骤二：制备一级种子液。将斜面菌种接种到一级液体种子培养基中，在恒 温回旋式摇床上以190转/分恒温培养24h。

一级液体种子培养基配方为：葡萄糖18.0g/L；蛋白胨5.0g/L；酵母粉1.0g/L； 豆粕3.0g/L；碳酸钙0.20g/L，调节pH＝8.5-9.0范围内。将配制好的一级液体种 子培养基按照100ml/瓶(500ml规格摇瓶)的量分装到摇瓶中，121℃高温灭菌 30分钟，备用。

步骤三：制备发酵培养基：在5.0L发酵罐中，按照葡萄糖20.0g/L；蛋白胨 6.0g/L；酵母粉1.5g/L；豆粕3.0g/L；聚乙烯醇5.0g/L；碳酸钙0.2g/L的量配制 发酵培养基，发酵罐装液量控制在2.5L-3.0L范围内，调节发酵液初始 pH＝8.5-9.0范围内，121℃高温灭菌30min，降温至28℃，备用。

步骤四：接种发酵培养基：按照5％的接种量将一级液体种子接种于5.0L发 酵罐中。

步骤五：发酵培养：控制发酵罐通气量在2.0-3.0L/min转速在300-400转/min， 温度为28℃的条件下，发酵96h。

步骤六：下罐，检测含量：在配备有二极管阵列检测器的液相色谱上检测发 酵液中抗生素含量。

添加不同浓度的PVA后抗生素产量变化趋势图及数据见下表1.

测定过程中，直接采用经过离心后的发酵液进液相色谱测定抗生素含量，为 避免发酵液中其他杂质堵塞色谱柱，离心后的发酵液用甲醇稀释5倍后进液相色 谱测定，并以液相色谱的峰高表示抗生素含量。所得数据如下表1所示。

表1添加不同浓度聚乙烯醇(PVA)对抗生素产量的影响

由表1可见，当添加5.0g/L的聚乙烯醇时，抗生素产量最高，液相色谱图 上峰高值为41.54mAU，而不添加聚乙烯醇的发酵液中，抗生素峰高值只有 13.35mAUM，产量提高3.1倍。

发酵液中添加不同浓度的聚乙烯醇对抗生素产量的影响如下图1所示。

由图1可见，当添加浓度为5.0g/L时，发酵液中抗生素浓度最高，所以最 终确定聚乙烯醇的最终添加浓度为5.0g/L。

发酵获得抗生素的液相色谱检测方法：

色谱柱：150mm×4.5mm；检测器：二极管阵列检测器(DAD)；流动相：75％ 的甲醇水溶液；流速：1.0ml/min；出峰时间：3.5min左右。发酵获得的抗生素 对多种植物病原真菌及细菌都具有显著抗性，表1列出了该抗生素对部分病原菌 株的抗性。

表2发酵获得抗生素对不同植物病原菌的室内抑制效果

注：表中数据为抑菌圈直径。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此， 任何熟悉本技术领域的技术人员，在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得 到的技术方案的简单变换或等效替换均落入本发明的保护范围内。