一株用于拮抗太子参专化型尖孢镰刀菌的解淀粉芽孢杆菌

摘要

本发明涉及一株用于拮抗太子参专化型尖孢镰刀菌的解淀粉芽孢杆菌。该菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）BN-D，已于2014年5月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCCNo.9114。该菌株可高效抑制太子参根际土壤的专化型尖孢镰刀菌，在该领域的应用前景广阔。

说明书

技术领域

本发明涉及一株用于拮抗太子参专化型尖孢镰刀菌的解淀粉芽孢杆菌。 

背景技术

太子参(Pseudstellariae heterophylla)是一种比较名贵的中药材，含氨基酸、糖类、苷类、磷脂类、环肽类以及微量元素等。有补气益血、生津补脾胃的作用，适于小儿夏季久热不退，咳嗽，饮食不振，心悸等虚弱之症及小儿病后体弱无力、盗汗、口平等症。随着太子参药效药理研究的日益深入，太子参作为补益药物，逐渐成为我国常用大宗药材之一。 

太子参用途广泛，市场需求很大。但是，其连作障碍极其严重，即在同一块地里连续种植太子参的情况下，即使在加强田间管理的情况下，其生长状况变差，甚至绝收，其品质变劣，多糖和总人参皂苷含量显著下降。申请人经过研究证实，太子参连作后，根际土壤中太子参专化型尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f. sp. heterophylla)数量极显著增加，重茬太子参专化型尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f. sp. heterophylla)数量是对照近5倍；将分离到的太子参专化型尖孢镰刀菌接种于种植太子参的健康土壤中，太子参专化型尖孢镰刀菌在健康土壤中大量增殖，且侵染太子参根部，引发太子参病害。 

近几年，随着绿色农业、有机农业以及微生物防治的特殊作用机制的研究正在蓬勃发展，而获得高效拮抗菌并使其作用发挥到最大则是生物防治的基础。对尖孢镰刀菌的生物防治在其他作物（如香蕉、西瓜、黄瓜，草莓等）中研究比较多，分离报道的拮抗菌种类也较全面。如木霉、丛枝菌根真菌(AM)、非致病尖孢镰刀菌、淡紫拟青霉、假单胞细菌、芽孢杆菌、放线菌等，戴君勇等从香石竹、棉花植物根际土壤分离过解淀粉芽孢杆菌KL-1，并用于香石竹尖孢镰刀菌(F. oxysporum f．sp．Diathi)、棉花枯萎病菌( F. oxysporum f．sp．vasinfectum)的防治。但本研究分离的菌株和他们相比来源不同，针对的对象也不同，由于尖孢镰刀菌存在着遗传多态性的缘故。作为一种世界性分布的土传病原真菌,尖孢镰刀菌种内的致病菌株具有高度的寄主专化性，从棉花地里分离的解淀粉芽孢杆菌KL-1并不一定对太子参专化型镰刀菌有很好的效果。目前已经分离的针对太子参专化型尖孢镰刀菌的拮抗菌种类只有《用于拮抗太子参根际土壤尖孢镰刀菌的多粘类芽孢杆菌》(专利号: CN 102676435 B)，还未见针对太子参专化型尖孢镰刀菌的解淀粉芽孢杆菌的相关报道。本课题组在前期研究中，通过稀释涂平板法和平板对峙试验从福建省宁德市柘荣县溪源村太子参GAP基地试验田采集重茬太子参根际土样中分离到了一株可高效抑制太子参专化型尖孢镰刀菌的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），命名为BN-D,该拮抗菌的分离可为太子参根腐病的生物防治提供新的生防菌剂。 

发明内容

为此，本发明从太子参重茬根际土壤中筛选到一株用于拮抗太子参专化型尖孢镰刀菌的解淀粉芽孢杆菌。 

本发明提供的一株用于拮抗太子参根际土壤太子参专化型镰刀菌的解淀粉芽孢杆菌，为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）BN-D，已于2014年5月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCCNo.9144。 

该菌可在芽孢杆菌通用培养基中培养发酵。培养基成分：胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L，酵母提取物(Yeast extract) 5g/L，氯化钠(NaCl) 5g/L，pH 7.0。 

在油镜下(目镜10X，物镜100X)下观察该菌革兰氏染色结果,该菌为杆菌，革兰氏染色呈阴性。该菌株经形态学和16s RNA分子生物学鉴定，确定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。 

该菌株能较广泛利用碳源，包括:L-鼠李糖、蔗糖、D-葡萄糖和D-甘露醇，但对部分碳源不利用，包括:D-果糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、L-肌醇、麦芽糖及纤维二糖，也能较广泛利用氮源，可使淀粉水解，不利用纤维素。 

本发明的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）BN-D,可高效抑制太子参根际土壤的专化型尖孢镰刀菌，在该领域的应用前景广阔。该菌株已于2014年5月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保蒇，其简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.9144。 

附图说明

图1为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）BN-D在NA培养基生长图。 

图2为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）BN-D对太子参专化尖孢镰刀菌的抑菌效果。左图为太子参专化型尖孢镰刀菌对照；右图为解淀粉芽孢杆菌BN-D拮抗太子参专化型尖孢镰刀菌的抑菌效果。 

图3为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）BN-D对太子参毒性试验；图片中第一排为未加解淀粉芽孢杆菌BN-D的对照太子参盆栽苗，第二排为加入解淀粉芽孢杆菌BN-D的处理后的太子参盆栽苗。 

图4为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）BN-D太子参专化型尖孢镰刀菌太子参组培苗共培试验。图片从左到右依次为：不加任何菌的太子参组培苗；只加太子参专化型镰刀菌的太子参组培苗；同时加太子参专化型镰刀菌、解淀粉芽孢杆菌BN-D的太子参组培苗。 

具体实施方式

1、解淀粉芽孢杆菌BN-D的分离与纯化 

土样的采集：2012年从福建省宁德市柘荣县溪源村太子参GAP基地试验田采集重茬太子参根际土样。采用5点采样法，混合均匀做为样品。

采用稀释分离法对土样微生物分离纯化，称取10g土壤加入装有90mL无菌水的三角瓶中，120r/min，振荡30min，将震荡好的土壤悬液制成10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7等不同稀释度的土壤溶液。将上述稀释的悬液涂抹于装有LB培养基（配方如下:胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L，酵母提取物(Yeast extract) 5g/L，氯化钠(NaCl) 10g/L，用NaOH调节该培养基的pH到7.0~7.4，每升加10g~15g琼脂粉）的平板法上，每个浓度重复3次，置于30℃的培养箱中培养过夜，选取菌落数适宜的平板，挑取其中的单菌落，采用平行划线的方法进行纯化，连续3次转接，确认为单一细菌。分别取分离纯化后的土壤微生物接种到LB培养基上，30℃活化2天，然后接到PDA培养基上，用打孔器打取太子参尖孢镰刀菌菌饼接到PDA(马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂每升加15~20克，自然PH)平板上进行平板对峙实验，选取有明显拮抗作用的菌株进行纯化后保存、备用。 

2、解淀粉芽孢杆菌的筛选及抑菌效果测定 

将上述纯化的有一定拮抗作用的各菌株与太子参尖孢镰刀菌采用对峙培养法进行进一步筛选：取出上述纯化的菌液100μL倒入LB平板培养基上，用灭菌的玻璃涂棒将稀释液均匀的涂布，30℃培养7天。用直径5mm打孔器打取拮抗菌菌块接入PDA培养基平板一边，并打取同样大小的尖孢镰刀菌菌块接入另一端，进行平板对峙培养。筛选拮抗效果好的菌株对其进行鉴定，经形态学和16s rRNA分子生物学鉴定，确定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），命名为BN-D。

解淀粉芽孢杆菌BN-D菌株经种子罐发酵，至中试发酵罐进一步放大发酵后，在太子参种植后立即喷雾施用于土壤，或菌液发酵后，拌基肥施用于即将种植太子参的土壤。菌液喷雾施用或拌基肥施用，其施用浓度为10⁶-10⁸CFUs/mL。施用后将显著提高太子参产量和品质。 

3、解淀粉芽孢杆菌BN-D的抑菌效果测定 

在实验室中，用打孔器将尖孢镰刀菌及解淀粉芽孢杆菌BN-D各打成直径为5mm的小菌块并分别将其移入PDA平板培养基的两端。未接种该菌的PDA平板培养基中心位置接入相同大小的菌块为空照。28℃恒温培养5日，进行菌落直径大小测量及抑制率计算，确定菌株的拮抗性能。

抑菌率计算公式:抑菌率(%)=(对照的尖孢镰刀菌菌落直径－接种该菌的尖孢镰刀菌菌落直径)/对照的尖孢镰刀菌菌落直径×100%。 

结果，该菌株对尖孢镰刀菌5天抑菌率达到93.2%，如图2所示。 

4、解淀粉芽孢杆菌BN-D菌株毒性试验  

将该解淀粉芽孢杆菌BN-D接入100mL LB培养基中，培养3天后，取培养3天的该菌菌液100 mL用无菌水稀释5倍后施入太子参盆栽中，每天观察太子参的生长情况，观察该解淀粉芽孢杆菌对太子参是否有毒害作用。如图3所示，与对照相比，太子参组盆栽苗生长良好，表明该解淀粉芽孢杆菌BN-D对太子参本身生长没有毒害，不会使太子参致病。

5、解淀粉芽孢杆菌BN-D、太子参尖孢镰刀菌及太子参组培苗共培试验。 

将200μL该拮抗菌菌液加入到太子参组培苗根际周围，培养2天后在组培瓶边缘接入镰刀菌，每天观察病原菌、拮抗菌、太子参组培苗之间的互作效果。 

如图4所示，太子参组培苗生长良好，只接入镰刀菌的太子参组培苗则被镰刀菌侵染而逐渐枯萎并最终死亡。而在接有太子参尖孢镰刀菌及解淀粉芽孢杆菌BN-D的太子参组培瓶内，解淀粉芽孢杆菌BN-D围绕在组培苗周围形成抑制区，致使镰刀菌无法越过抑制区而对太子参致病，并且太子参苗生长状况与空白对照一样长势良好。最终在接入拮抗菌的组培瓶内形成了以太子参苗为中心，外围分别为拮抗菌、拮抗菌抑制区、镰刀菌三者互作的局面。 

5、解淀粉芽孢杆菌BN-D的应用前景 

植物病害80%以上是由真菌引起的，控制真菌病害对于提高农作物产量极其重要。尖孢镰刀菌是一类典型的土传病害真菌，在土壤和有机质中数量多而活跃，其寄居范围非常广泛，可引起瓜类、茄科、香蕉、棉、豆科及花卉等100多种植物发生枯萎病，在农业生产中导致严重的作物减产，降低品质，影响供应和外销，甚至引起人畜中毒，造成严重的经济损失。申请人经过研究证实:种植太子参后，根际土壤中太子参专化型尖孢镰刀菌数量极显著增加；将分离到的尖孢镰刀菌接种于种植太子参的健康土壤中，尖孢镰刀菌在健康土壤中大量增殖，且侵染太子参根部，引发太子参病害。全国每年太子参总栽培面积约5万多亩，按目前市场价格估算，全国产值约50亿多元人民币，但是连作后太子参根际土壤中专化型尖孢镰刀菌等致病菌和病原菌增多，使得产量急剧下降为头茬(对照)的1/3以下，产生严重的经济损失，是一个急需解决的重要问题。解淀粉芽孢杆菌BN-D可高效抑制太子参专化型尖孢镰刀菌，在该领域的应用前景广阔。